陳長(zhǎng)福

（龍巖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建龍巖 364000）

禽坦布蘇病毒（avian Tembusu virus，ATV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）恩塔亞病毒群新成員。該屬成員主要為蟲(chóng)媒病毒，其中包含嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的病毒，如登革熱病毒（dengue virus，DENV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、圣路易腦炎病毒（St.Louis encephalitis virus，SLEV）以及西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）等[1]。此外，根據(jù)傳播途徑不同，黃病毒屬病毒還可分為蜱媒病毒（tick-borne viruses group）、蚊媒病毒（mosquitoborne viruses group）和未知媒介病毒（non-vector group）[2]。2010 年4 月，我國(guó)蘇、閩、浙等多地的種（蛋）鴨群發(fā)生了一種以“產(chǎn)蛋量驟降、卵泡出血”為主要特征的新發(fā)疫病，經(jīng)研究證實(shí)引發(fā)病原為一種新的黃病毒——鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTV）[3-5]。DTV 起初發(fā)生在種（蛋）鴨群中，隨后在種（肉）鵝、種（肉）鴨、種（蛋）雞、鴿子、麻雀以及發(fā)病鴨場(chǎng)周?chē)米又邢嗬^被檢測(cè)或分離到[6-9]。鑒于DTV 感染宿主范圍拓寬，黃瑜等[10]將鴨坦布蘇病毒病統(tǒng)一命名為禽坦布蘇病毒?。╝vian Tembusu virus disease，ATVD）。

ATVD 最早于2000 年在馬來(lái)西亞某肉雞群中發(fā)生，患病雞群主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)機(jī)能紊亂和生產(chǎn)性能下降，但未出現(xiàn)死亡[11]。2010 年以來(lái)，我國(guó)鴨群中的ATVD 疫情迅速蔓延至全國(guó)大部分養(yǎng)禽場(chǎng)[12]。郭晨等[13]對(duì)2019 年鴨源ATV 福建分離株（FJ42）E基因進(jìn)行遺傳分析，推測(cè)該毒株可能由馬來(lái)西亞雞源病毒隨候鳥(niǎo)遷徙傳播至福建省后逐步演化而成。在已知的候鳥(niǎo)主要遷徙路線中，“東亞—澳大利亞”候鳥(niǎo)遷徙路線途經(jīng)我國(guó)福建等東部沿海諸省，而閩西地區(qū)水禽種質(zhì)資源豐富，飼養(yǎng)量大，因此定期開(kāi)展閩西地區(qū)水禽ATV 檢測(cè)及其基因變異分析意義重大。

本研究對(duì)采自福建省龍巖市7 個(gè)縣（市、區(qū)）活禽交易市場(chǎng)、規(guī)?；輬?chǎng)和散養(yǎng)戶的3 205 份鴨、鵝泄殖腔棉拭子，進(jìn)行ATV 病原檢測(cè)及分離鑒定，并對(duì)部分分離毒株NS5基因進(jìn)行序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析，以期掌握閩西地區(qū)ATV 的分子特征和遺傳進(jìn)化規(guī)律，為科學(xué)制定防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

EasyPure? Viral DNA/RNA Kit、EasyScript?One-Step RT-PCR SuperMix 及2×EasyTaqPCR Super Mix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）股份有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)自TaKaRa 公司；PCR 儀、電泳儀，為Bio-Rad 公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)Gene Genius，為Syngene 公司產(chǎn)品。

1.2 檢測(cè)樣品

2020 年春季和秋季，分別采集福建省龍巖市轄區(qū)內(nèi)7 個(gè)縣（市、區(qū)）農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、規(guī)模化禽場(chǎng)和散養(yǎng)戶的鴨泄殖腔棉拭子樣品2 885 份、鵝泄殖腔棉拭子樣品320 份（表1）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照《禽坦布蘇病毒病診斷技術(shù)》（DB35/T 1593—2016）合成檢測(cè)引物。ATVNS5基因片段擴(kuò)增引物（ATV/330F：GAGTGAACTCATCATACC；ATV/330R：GATTTGATCAACATGTCGTCT）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室設(shè)計(jì)，鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

1.4 樣品RT-PCR 檢測(cè)

按EasyPure Viral DNA/RNA Kit 試劑盒操作說(shuō)明，提取病毒核酸；參照《禽坦布蘇病毒病診斷技術(shù)》（DB35/T 1593—2016）開(kāi)展RT-PCR 檢測(cè)。

1.5 病毒分離培養(yǎng)

將部分經(jīng)RT-PCR 檢出的ATV 陽(yáng)性樣品無(wú)菌處理后，經(jīng)尿囊腔接種11 日齡鴨胚，收取1～7 d內(nèi)死亡的鴨胚尿囊液（未死亡鴨胚于接種后7 d 收毒），連續(xù)盲傳2 代后再次進(jìn)行ATV 檢測(cè)，將陽(yáng)性樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 NS5 基因片段序列測(cè)定與分析

使用引物ATV 330F/ATV 330R 擴(kuò)增ATV 分離毒株的NS5基因片段，參照EasyPure Viral DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明，提取病毒核酸。獲得的RNA 樣品按EasyScript One-Step PCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系50.00 μL：2×EasyTaqPCR Super Mix 25.00 μL，ddH2O 17.50 μL，上下游引物各1.25 μL，DNA 模板5.00 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸10 min，35 個(gè)循環(huán)。將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送福州鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序，獲得序列分別使用Lasergene、Editseq、MegAlign、MEGA5 等軟件分析，然后與GenBank 中的ATV 參考株進(jìn)行分子變異比較。

2 結(jié)果

2.1 樣品RT-PCR 檢測(cè)

2.1.1 不同宿主 2 885 份鴨泄殖腔棉拭子樣品中，共檢測(cè)出ATV 陽(yáng)性樣品485 份，陽(yáng)性率為16.81%，其中番鴨、半番鴨、山麻鴨和連城白鴨的陽(yáng)性率分別為23.71%（188/793）、20.45%（117/572）、11.63%（121/1 040）和12.29%（59/480）；320 份鵝泄殖腔棉拭子樣品中，共檢測(cè)出ATV 陽(yáng)性樣品66 份，陽(yáng)性率為20.63%（66/320）。不同宿主樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。不同宿主的ATV 陽(yáng)性率比較發(fā)現(xiàn)，鴨平均陽(yáng)性率（16.81%）與鵝（20.63%）差異極顯著（P＜0.01）。部分樣品RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 不同宿主樣品的ATV 檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.1.2 不同日齡 3 205 份水禽泄殖腔棉拭子樣品來(lái)源于1～380 日齡的水禽，其中1～＜30 日齡的ATV 陽(yáng)性率為4.44%（4/90），30～＜90 日齡為9.16%（76/830），90～＜180 日齡為21.29%（397/1 865），180～＜380 日齡為17.62%（74/420）。不同日齡水禽樣品ATV 陽(yáng)性率比較發(fā)現(xiàn)，90 日齡以上水禽的ATV 陽(yáng)性率（20.61%）明顯高于90 日齡以下（8.70%），兩者差異極顯著（P＜0.01）。不同日齡水禽樣品檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表3。

2.1.3 不同場(chǎng)所 3 205 份水禽泄殖腔棉拭子樣品來(lái)自規(guī)?；輬?chǎng)、散養(yǎng)戶、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，分別為260、1 470、1 475 份。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示，規(guī)模化禽場(chǎng)、散養(yǎng)戶和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的AIV 陽(yáng)性率分別 為8.85%（23/260）、20.68%（304/1 470）和15.19%（224/1 475）?？梢?jiàn)，散養(yǎng)戶的ATV 陽(yáng)性率最高，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)次之，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)最低，不同場(chǎng)所水禽的ATV 陽(yáng)性率差異極顯著（P＜0.01）。

表4 不同場(chǎng)所水禽樣品ATV 檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.1.4 不同季節(jié) 不同季節(jié)檢測(cè)結(jié)果（表5）顯示，春季ATV 陽(yáng)性率為22.74%（362/1 592），秋季為11.72%（189/1 613），春季ATV 陽(yáng)性率明顯高于秋季（P＜0.01）。

2.2 病毒分離及NS5 基因序列測(cè)定與分析

將部分ATV 陽(yáng)性樣品經(jīng)鴨胚分離培養(yǎng)，從中選擇8 株鴨源（ATV-FJZP31、FJSH54、FJLC117、FJWP133、FJXL146、FJXL165、FJCT228、FJYD248）、5 株鵝源（ATV-FJZP77、FJCT92、FJYD173、FJXL182、FJWP193）毒株，進(jìn)行NS5基因片段序列測(cè)定，將獲得的NS5基因片段與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的ATVNS5基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果（圖2）顯示，13 株水禽（鴨和鵝）源ATV 分離株的NS5基因片段核苷酸序列同源性高達(dá)98.6%～100%。該13 株分離毒株與國(guó)內(nèi)ATV 代表株的核苷酸序列同源性介于96.5%～99.7%，其中同源性最高的是與中國(guó)2020 年分離株H（MT108702.1）和CHN-YC（MN966680.1）。

遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖3）顯示：不同來(lái)源的NS5基因片段核苷酸序列出現(xiàn)兩個(gè)大的分支，分離毒株與國(guó)內(nèi)其他恩塔亞病毒群（Ntayavirusgroup）的ATV 處于同一分支，而澳大利亞分離株N2（EU303233）、日本腦炎病毒群（Japanese encephalitis virus group）、西尼羅病毒（West Nile virus）（AF481864）、圣路易腦炎病毒（St.Louis encephalitis virus）（EU090146）及羅西奧病毒（Rocio virus）（A Y632542）則處于另一進(jìn)化分支。

3 討論

ATV 天然宿主廣泛，先后有從鴨、雞、鵝、鴿子、麻雀和蚊子等宿主中檢測(cè)或分離到該病毒的報(bào)道[14]。ATV 對(duì)鴨群危害最大，可感染種（蛋）鴨或肉鴨，涉及櫻桃谷鴨、北京鴨、紹興鴨等國(guó)內(nèi)外大部分品種。龍巖市以山麻鴨、連城白鴨、番鴨和半番鴨等品種飼養(yǎng)為主。本研究分別于2020 年春季和秋季采集該地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、規(guī)?；輬?chǎng)及散養(yǎng)戶的鴨、鵝泄殖腔棉拭子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATV 總陽(yáng)性率為17.19%，其中鵝陽(yáng)性率（20.63%）高于鴨（16.81%）。結(jié)合所采樣品來(lái)源水禽的流行病學(xué)數(shù)據(jù)和信息，發(fā)現(xiàn)來(lái)源鴨群的ATV 滅活疫苗免疫率高于鵝群，由此推測(cè)鴨鵝間陽(yáng)性率差異可能與ATV 滅活疫苗免疫狀況相關(guān)，也可能與鴨、鵝樣品不均等，鵝樣品相對(duì)較少有一定關(guān)系。

ATV 可自然感染不同日齡的鴨群，在未開(kāi)展疫苗免疫前，臨床中以種（蛋）鴨感染率最高[15]。Ti 等[16]通過(guò)人工感染不同日齡鵝發(fā)現(xiàn)，鵝日齡越小，ATV 感染率越高。本研究發(fā)現(xiàn)，90～＜180 日齡水禽樣品的ATV 陽(yáng)性率最高（21.29%），30 日齡內(nèi)最低（4.44%），這與30日齡以內(nèi)幼鴨的母源抗體保護(hù)有一定關(guān)系。結(jié)合樣品來(lái)源信息可見(jiàn)，90 日齡以上水禽以種（蛋）用為主，表明龍巖市的種（蛋）水禽ATV 感染較嚴(yán)重，且免疫過(guò)ATV滅活疫苗的禽群依然存在ATV感染，這可能與疫苗的選擇及其免疫程序相關(guān)。

ATV 作為蚊蟲(chóng)傳播的黃病毒，其傳播途徑包括空氣傳播、接觸傳播和垂直傳播等。對(duì)不同場(chǎng)所樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，散養(yǎng)戶水禽樣品ATV 陽(yáng)性率最高（20.68%），農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)次之（15.19%），規(guī)?；輬?chǎng)最低（8.85%）。散養(yǎng)戶ATV 陽(yáng)性率相對(duì)較高可能與其養(yǎng)殖硬件條件、生物安全管理措施相對(duì)薄弱有關(guān)。由此提示，適當(dāng)改善養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境并加強(qiáng)生物安全防控，如合理開(kāi)展免疫、加強(qiáng)環(huán)境消毒、定期驅(qū)蚊等，對(duì)該病防控至關(guān)重要。

ATV 作為單股正鏈RNA 病毒，其核苷酸容易變異，繼而可能導(dǎo)致氨基酸、抗原性和致病性發(fā)生改變。NS5 蛋白是ATV 最大的蛋白質(zhì)，其核酸序列高度保守，在病毒基因組復(fù)制和免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用[17-18]。對(duì)龍巖市13 株不同水禽源ATV 分離株NS5基因片段核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其同源性高達(dá)98.6%～100%，也驗(yàn)證了該地區(qū)不同水禽源ATV 分離株NS5基因較為保守。該13株ATV 分離毒株與國(guó)內(nèi)代表株核苷酸序列同源性介于96.5%～99.7%，與來(lái)自中國(guó)2020 年分離株H（MT108702.1）和CHN-YC（MN966680.1）同源性最高。遺傳進(jìn)化分析顯示，本研究分離毒株與國(guó)內(nèi)其他恩塔亞病毒群（Ntayavirusgroup）的ATV處于同一分支，而與澳大利亞等國(guó)外分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果與劉友生等[15]于ATVD 發(fā)病早期（2010—2011 年）對(duì)采集自我國(guó)沿海及周邊9省的439 份家禽疑似ATV 感染樣品檢測(cè)及NS5基因測(cè)序分析得出的結(jié)果相似。由此說(shuō)明，龍巖市不同水禽源ATV 分離株仍為當(dāng)前國(guó)內(nèi)流行株，但其全基因組、致病性等是否發(fā)生改變，有待進(jìn)一步深入研究確定。

總之，本研究對(duì)2020 年采集自龍巖市不同季節(jié)、品種、日齡及養(yǎng)殖模式的水禽泄殖腔棉拭子樣品進(jìn)行ATV 病原檢測(cè)及NS5基因變異分析，掌握了該地區(qū)ATV 的流行特點(diǎn)及基因遺傳進(jìn)化情況，為制定該病防控措施提供了依據(jù)。