蘇紅遼，耿向華，韓紅霞，吳紅霞

（1.滑縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，河南滑縣 456400；2.滑縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南滑縣 456400）

豬鏈球菌病是由多種不同血清群鏈球菌引起的，具有不同臨診癥狀傳染病的總稱，以淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及敗血癥為主要臨床特征。豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是豬鏈球菌病的主要病原體，引起疾病譜多種多樣，包括但不限于腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎。通過莢膜抗原，SS 可分為35 個(gè)血清亞型，其中SS2 是最常從病豬體內(nèi)分離到的一種亞型，致病力最強(qiáng)，各地檢出率也最高[1]，而且可感染人并致死，引起的疾病為人獸共患病，因此其不僅給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且威脅食品安全和人類健康[2]。

最早的人類SS 感染病例于1968 年報(bào)道，隨后多個(gè)病例在歐洲、亞洲及北美被報(bào)道[3]。SS 可通過垂直傳播和水平傳播兩種途徑感染豬。SS 通常潛伏在規(guī)模養(yǎng)殖豬的扁桃體內(nèi)，當(dāng)攜帶病原仔豬的母源抗體逐漸消失時(shí)，可從扁桃體或其他黏膜表面向全身播散，繼而發(fā)展為菌血癥、敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等[4]。具體而言，SS 致病的前提是細(xì)菌突破上皮細(xì)胞的多種屏障，進(jìn)入血液，并在循環(huán)中大量增殖，隨后隨血流侵襲不同的器官，引起炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者可發(fā)生膿毒性休克而危及生命。SS 感染主要表現(xiàn)為急性發(fā)病，寒戰(zhàn)、高熱，可伴有嘔吐、腹瀉、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)疼痛等全身中毒性癥狀，病程發(fā)展迅速，可在1 d內(nèi)累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)休克、肝腎功能不全、凝血障礙[5]。另外，目前部分SS 菌株也出現(xiàn)了多重耐藥性，若早期盲目使用不敏感抗生素，則會(huì)錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)[6]。

本研究明確了河南省安陽市的SS2 地域性分布、生化特點(diǎn)及耐藥情況，為有效防控豬鏈球菌病提供了有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB）和胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA），為青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，按說明書配制、滅菌后，分別按體積分?jǐn)?shù)5%、10%，每升加入50 mL 小牛血清。2×TaqMix、DL 2 000 DNA Marker，為翌圣生物科技（上海）股份有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 SS2 標(biāo)準(zhǔn)菌株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC 號(hào)為3930，原始編號(hào)為ATCC 700796）。

1.1.3 藥敏紙片 慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢曲松等16 種抗菌藥物藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司及Oxoid 公司。

1.1.4 主要儀器 PCR 儀，Applied Biosystems 公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，上海金鵬分析儀器有限公司產(chǎn)品；二級(jí)生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；隔水恒溫培養(yǎng)箱，上海舍巖儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

SS2 菌株P(guān)CR 檢測(cè)以及生化特性、藥敏性檢測(cè)等操作，均在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施。

1.2.1 受試菌株分離 受試菌株由滑縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心在無菌條件下分離，參考劉麗蓉等[7]的方法進(jìn)行，樣品采自安陽縣、北關(guān)區(qū)、文峰區(qū)、林州市、殷都區(qū)、龍安區(qū)、湯陰縣、內(nèi)黃縣和滑縣疑似SS 感染病豬，樣本為豬關(guān)節(jié)液、肺組織和腦組織。

1.2.2 鏈球菌PCR 鑒定 采用裂解法提取細(xì)菌DNA：挑取單菌落接種到含有5%（體積分?jǐn)?shù)）血清的TSB 中，培養(yǎng)24 h；取1 mL 菌液加入1.5 mL 離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入100 μL 滅菌ddH2O，置沸水中煮沸10 min，冰浴10 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，即為DNA 模板。使用Applied Biosystems 公司的PCR 儀，分別加入設(shè)計(jì)好的SS 和SS2 引物，以DNA 為模板分別進(jìn)行擴(kuò)增。參考菌株基因號(hào)為CP100432，SS 鑒定引物（F：TTCCAATCGGCGGTGGTAAA；R：TCGCACATGGAAGGGCAATA）擴(kuò)增長(zhǎng)度為566 bp，SS2 鑒定引物（F：AGTGATTTGTCGGGAGGGTT；R：ATGCCACTGTAGCGTCTCTT）擴(kuò)增長(zhǎng)度為498 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 體系：2×TaqMix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增，參照趙樸等[8]的方法進(jìn)行，取出產(chǎn)物后使用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 SS2 生化試驗(yàn)鑒定 SS2 生化試驗(yàn)鑒定參考劉麗蓉等[7]的方法進(jìn)行。

1.2.4 SS2 藥敏試驗(yàn) 將分離純化的SS2 菌株按常規(guī)方法[9]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性

在含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的TSA 平板上，分離菌株長(zhǎng)出大量半透明、針尖大小、光滑、濕潤(rùn)的小菌落，革蘭氏染色陽性，成對(duì)或呈短鏈狀排列，符合SS 菌落形態(tài)及特點(diǎn)。

2.2 SS 分離株P(guān)CR 鑒定

從56 份病豬樣品（包括關(guān)節(jié)液、肺組織和腦組織）中，共分離鑒定出來自于全市9 個(gè)縣區(qū)的38 株SS 菌株（圖1），其中21 株為SS2 菌株（圖2），占55.3%，從安陽縣、湯陰縣、滑縣、文峰區(qū)、北關(guān)區(qū)、殷都區(qū)、龍安區(qū)7 個(gè)縣區(qū)采集樣品中分離到（表1）。在17 份關(guān)節(jié)液標(biāo)本中，分離出11 株SS 菌株，其中6 株為SS2 菌株；21 份腦標(biāo)本中，分離出16 株SS 菌株，其中10 株為SS2 菌株；在18 份肺標(biāo)本中，分離出11 株SS 菌株，其中5 株為SS2 菌株。

表1 SS 分離株來源情況

2.3 生化鑒定

為進(jìn)一步確認(rèn)SS2 分離菌株的生化特性，挑選經(jīng)PCR 鑒定為SS2 的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵、V-P 等生化試驗(yàn)。結(jié)果（表2）顯示，棉子糖、乳糖、七葉苷發(fā)酵試驗(yàn)為陽性，甘露糖、阿拉伯糖、山梨糖、菊糖、松三糖、甘露醇、D-核糖、甘油發(fā)酵試驗(yàn)及V-P 試驗(yàn)均為陰性，在高鹽肉湯（6.5%）和肉湯（pH9.6）中均不能生長(zhǎng)，全部符合SS2 的生化特點(diǎn)。

表2 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

為分析SS2 對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，使用16 種抗菌藥物藥敏紙片檢測(cè)SS2 分離菌株的藥敏情況。結(jié)果（表3）顯示：全部21 株SS2 菌株對(duì)氨芐西林和頭孢曲松敏感，20 株對(duì)頭孢呋辛敏感，19 株對(duì)阿莫西林和頭孢噻肟敏感；而全部21 株SS2 菌株對(duì)卡那霉素、阿米卡星和磺胺異惡唑耐藥，20 株對(duì)慶大霉素和四環(huán)素耐藥，19 株對(duì)阿米卡星耐藥。

表3 21 株SS2 分離菌株對(duì)16 種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

SS 是導(dǎo)致豬鏈球菌病最主要的病原，能通過黏膜或傷口等傳播途徑感染人，從而對(duì)人類生命健康構(gòu)成致命威脅。近年來，SS 主要引起兩種人類疾病，即敗血癥合并感染性休克和腦膜炎，而且此類疾病的發(fā)病率也越來越高。因此，按照國(guó)家“人病獸防、關(guān)口前移”的總要求，了解SS 的地域性亞型分布以及生化特征和藥物敏感性對(duì)防治SS 人畜感染，減少畜牧業(yè)損失和促進(jìn)人類健康都具有重要意義。

SS 的血清型可分為35 種，不同亞型對(duì)人和豬的致病力也強(qiáng)弱不一[4]。目前有6 種血清亞型被重新分類，其中32 和34 亞型歸類為Streptococcus orisratti，20、22 和26 亞型歸類為Streptococcus parasuis，33 亞型歸類為Streptococcus ruminantium[10]。SS2 亞型致病力極強(qiáng)，可由病豬傳染給人，引起人急性膿毒性休克，預(yù)后極差，因此需在診療過程中明確感染的SS 類型，以便早發(fā)現(xiàn)、早治療。PCR 技術(shù)的發(fā)展及全基因組測(cè)序的應(yīng)用使人們能夠進(jìn)一步鑒別和明確SS 的亞型類別[11]。本研究從56 份病豬樣品分離出38 株SS，在關(guān)節(jié)液、腦組織和肺組織中均有檢出，其中21 株被進(jìn)一步鑒定為SS2 亞型，占全部SS 分離菌株的55.3%，分布在安陽縣、滑縣、湯陰縣、文峰區(qū)、北關(guān)區(qū)、殷都區(qū)、龍安區(qū)7 個(gè)縣區(qū)。這提示SS2 是安陽市SS 優(yōu)勢(shì)流行亞型，且流行范圍較廣。

生化試驗(yàn)顯示，糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性者細(xì)菌生長(zhǎng)良好，能發(fā)酵糖產(chǎn)酸；陰性者不生長(zhǎng)，不發(fā)酵糖也不產(chǎn)酸。SS 對(duì)糖發(fā)酵的陽性反應(yīng)普遍包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和膽汁七葉苷等，部分菌株陽性反應(yīng)還包括棉子糖、甘露醇等。糖發(fā)酵生化試驗(yàn)結(jié)果提示，棉子糖、乳糖、七葉苷發(fā)酵試驗(yàn)為陽性，說明SS2 可正常生長(zhǎng)，這均符合SS2 的生化特點(diǎn)。

考慮到SS2 的高致病性，進(jìn)一步研究了SS2分離菌株對(duì)16 種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果全部21株SS2 菌株對(duì)卡那霉素、阿米卡星和磺胺異惡唑耐藥，20 株對(duì)慶大霉素和四環(huán)素耐藥，19 株對(duì)阿米卡星耐藥，表明SS2 分離菌株存在多重耐藥性。因此，臨床治療時(shí)，需考慮細(xì)菌的耐藥情況，最好通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感抗菌藥物，避免盲目用藥，貽誤病情。另外，應(yīng)制定合適的抗菌藥物組合，避免使用耐藥藥物，對(duì)高敏的抗菌藥物應(yīng)合理搭配，以保障治療的有效性。最后，在預(yù)防和治療鏈球菌病過程中，同一種抗菌藥物使用時(shí)間不宜過長(zhǎng)，應(yīng)輔以組合用藥，避免耐藥性加重。

本研究了解了河南安陽市豬群中的SS2 地域性分布及其藥物敏感性，對(duì)該地區(qū)豬鏈球菌病防控具有借鑒意義。