王鑫文，吳靜楠，郭紅瑞，張松梅，鄧成松，魯金強(qiáng)，鄒豐才，張以芳，柴 俊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.德宏州尚善品味農(nóng)業(yè)有限公司，云南梁河 679200）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬流行性腹瀉（PED）是養(yǎng)豬業(yè)中最常見、危害較嚴(yán)重的病毒性腹瀉病，具有高傳染性、高致病性和季節(jié)性暴發(fā)特征[1]。仔豬由于生理機(jī)能尚未發(fā)育完善，體內(nèi)抗體水平低，通常最易感染PEDV[2]。疫苗免疫在PED 防控中起重要作用，但近年來免疫豬只也頻繁發(fā)生PED。相關(guān)報(bào)道和多項(xiàng)研究已證實(shí)，PEDV 目前已發(fā)生基因突變出現(xiàn)新的變種，并且這種基因突變主要發(fā)生在S1基因，這或是造成免疫失敗的原因[3]。

PEDV 為尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的，單股正鏈有囊膜結(jié)構(gòu)的RNA 病毒，基因組長(zhǎng)約28 kb，包括2 個(gè)非編碼區(qū)和7 個(gè)開放閱讀框（ORF）。這7 個(gè)開放閱讀框編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M、N）與3 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF1a、ORF1b 和ORF3）[4-5]。其中，S基因全長(zhǎng)4 152 bp，其編碼的S 蛋白是位于病毒粒子表面的纖突蛋白[4]，在PEDV與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合和入侵宿主細(xì)胞過程中起著巨大作用，同時(shí)還與介導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體有著重要聯(lián)系，被認(rèn)為是能夠抵抗PEDV 的主要抗原。根據(jù)其他冠狀病毒S 蛋白序列可以將PEDV 人為劃分為S1（1～735 aa，抗原區(qū)）和S2（736～1 383 aa，膜融合區(qū)）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。研究[5-7]表明，S1 結(jié)構(gòu)域易發(fā)生變異，能夠更好地適合多種宿主細(xì)胞，更能體現(xiàn)病毒變異情況。因此研究S1基因有利于了解、分析毒株特點(diǎn)與變異趨向[5-6]。本研究對(duì)2017 年以來采自云南省疑似PED 發(fā)病豬只的病料樣品進(jìn)行PEDV 檢測(cè)，然后對(duì)檢出的陽性樣品進(jìn)行S1基因測(cè)序分析，以期為PED 防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采自云南省12 個(gè)地區(qū)部分豬場(chǎng)腹瀉仔豬的糞便樣品120份、小腸組織樣品62份，共計(jì)182份（表1）。

表1 腹瀉仔豬樣品信息

1.2 主要試劑和儀器

RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DL 2 000 和DL 5 000 DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程有限公司；2×EasyTaqSuper Mix、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、PMD19-T 載體、AMP、IPTG、X-gal，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LB 肉湯、LB 瓊脂，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。試驗(yàn)所用儀器，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 中PEDV 毒株N基因保守區(qū)和CV777 株全基因序列（登錄號(hào)AF353511），分別設(shè)計(jì)PEDV 檢測(cè)引物（F、R）和S1基因擴(kuò)增測(cè)序引物（SF1/SR1、SF2/SR2），由昆明擎科生物科技有限公司合成。檢測(cè)引物序列見表2。

表2 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.4 總RNA 提取，目的基因擴(kuò)增、克隆及基因測(cè)序

根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，配制cDNA 反轉(zhuǎn)錄體系（20.0 μL）：5×TransScript All-in-One SuperMix For PCR 4.0 μL、RNase-free water 8.0 μL、Total-RNA 8.0 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃30 min，85 ℃ 5 s。產(chǎn)物于-20 ℃保存。PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系（25.0 μL）：2×EasyTaqSuper Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，F(xiàn)、R 引物各1.0 μL，模板1.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。S1基因前段（SF1/SR1）PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54.6 ℃ 30 s，72 ℃ 100 s，34 個(gè)循環(huán)。后段（SF2/SR2）PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，擴(kuò)增34 個(gè)循環(huán)。DNA 產(chǎn)物用膠回收試劑純化，連接至pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定，并送昆明擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 S1 基因序列分析

利用DNAstar 軟件對(duì)測(cè)序獲得的兩段S1基因進(jìn)行拼接，獲得2 376 bp 序列；利用MEGA7.0 及itol 在線軟件，進(jìn)行同源性、氨基酸變異位點(diǎn)分析，以及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建、修飾和標(biāo)定。利用DNAstar中的Jameson-Wolf 法進(jìn)行抗原性變化分析。參考序列與疫苗株信息見表3。

表3 PEDV S1 基因序列參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

對(duì)2017—2022 年云南省12 個(gè)地區(qū)的182 份腹瀉仔豬樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果在9 個(gè)地區(qū)的110 份樣品中檢出PEDV 陽性，樣品陽性率為61.20%。選取代表性樣品進(jìn)行基因測(cè)序及拼接，共獲得9 個(gè)樣品的S1序列，分別命名為YN-QJ-2017（曲靖）、YN-MZ-2018（蒙自）、YN-XW-2018（宣威）、YN-JS-2019（建水）、YN-DLXG-2020（大理）、YN-LJ-2020（麗江）、YN-BS-202（保山）、YN-CJ-2021（澄江）、YN-XW-2022（宣威）。

2.1 樣品RT-PCR 檢測(cè)

樣品RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，在778 bp 左右位置出現(xiàn)清晰的特異性條帶，與預(yù)期相符。

2.2 S1 基因擴(kuò)增純化、克隆及鑒定

對(duì)檢測(cè)陽性的樣品，用引物S1F/S1R、S2F/S2R，對(duì)S1全基因序列分兩段進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果在約1 516、1 187 bp 位置可見清晰的特異性擴(kuò)增條帶（圖2），與預(yù)期目的片段大小一致。對(duì)純化的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆、鑒定及測(cè)序，得到與預(yù)期結(jié)果一致的大小約1 516 bp 和1 187 bp（圖3）的目的片段，從而確定重組質(zhì)粒pMD-19-S1-1 和pMD-19-S1-2構(gòu)建成功。

2.3 S1 基因核苷酸遺傳進(jìn)化分析

S1基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖4）顯示，所構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹主要分為兩個(gè)大分支，即G1 和G2基因群，其中G1基因群包括G1a亞群（經(jīng)典株）、G1b 亞群（變異株），G2 基因群包括G2a 和G2b亞群。本研究獲得的9 份樣品S1基因可分為1 份G1a 亞群（YN-QJ-2017）、1 份G1b 亞群（YNXW-2022）和7 份G2b 亞群。其中，YN-QJ-2017與國(guó)內(nèi)疫苗株SD-M、CV777-hlj 和P5-V 親緣關(guān)系最近，7 份G2b 基因亞群樣品與2011—2018 年的4 株北美洲毒株、1 株韓國(guó)毒株、18 株國(guó)內(nèi)流行毒株（包括3 株云南株）和2 株國(guó)內(nèi)疫苗株位于同一個(gè)分支，與國(guó)內(nèi)市售G2 基因群疫苗株（AJ1102、L/W/L）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而該分支也包含了國(guó)內(nèi)外最近幾年的許多主要流行毒株。

2.4 S1 基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析

對(duì) 9 份陽性樣品與35 株代表性PEDV 參考毒株進(jìn)行S1基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析。結(jié)果顯示：2 份G1 基因群樣品與7 份G2 基因群樣品的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為93.1%～93.6% 和91.1%～91.9%。7 份G2b 基因亞群樣品與CV777、CH-S 及CV777、P5-V、KPEDV-9、83P-5、SD-M 及DR13 等疫苗株的親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，它們間的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為91.3%～93.1%和89.4%～92%；與AJ1102和L/W/L 疫苗株以及國(guó)內(nèi)的高致病性變異強(qiáng)毒株CHYJ130330、變異減毒株FL2013、云南流行毒株YNP6 等參考毒株位于不同分支，它們間的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為96.1%～98.7%和89.9%～97.9%；而與同一分支的美國(guó)變異強(qiáng)毒株USA-Colorador-2013 以及國(guó)內(nèi)的TW-Pingtung-63、CH-hubei-2016、CH-JLDH-2016 等變異流行毒株親緣關(guān)系最近，它們間的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.5%～99.2%和96.5%～98.6%，說明存在共同祖先，具有密切關(guān)系；與3 株云南參考株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性較高，分別為97.6%～98.8%和96.2%～98.2%；與同一分支的國(guó)內(nèi)疫苗株GD-B和XJ-DB2 的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性較高，分別為97.0%～97.7%和95.6%～97.6%。

2.5 S1 基因與疫苗株氨基酸突變位點(diǎn)分析

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知；處于G1 基因群的陽性樣品YN-XW-2022 與同群的疫苗株存在較多一致的突變位點(diǎn)，與G2 基因群疫苗株和陽性樣品在第2、15、361、370、522、554、599、724、729 和771 位發(fā)生了一致的突變，分別為R→K、P→S、I→T、E→Q、A→S、T→S、G→S、N→S、N→S、Y→S，此外在第3、42、71、87、152、168、226、306、333 和568 位還發(fā)生了與G1 和G2 基因群疫苗株均不一致的突變位點(diǎn)，分別為I→N、Q→H、I→L、S→A、K→R、I→L、G→S、D→G、A→V、K→N；處于G2 基因群的7 份陽性樣品與AJ1102、XJ-DB24等4 株疫苗株在第13、139、289 和363 位發(fā)生了不一致的突變位點(diǎn)，分別為V→L、N→D、I→M、A→T。這提示，現(xiàn)有的G2 基因群疫苗株對(duì)現(xiàn)有流行毒株不能提供完全保護(hù)甚至發(fā)生免疫失敗現(xiàn)象。

2.6 S1 蛋白抗原位點(diǎn)變化分析

S1 蛋白主要抗原中和位點(diǎn)存在于COE 和SS2 區(qū)域。陽性樣品與疫苗株（CV777、LW/L、AJ1102）的S1 抗原位點(diǎn)分析結(jié)果（圖6）顯示：處于G1 分支的2 份樣品與同源經(jīng)典疫苗株CV777相比抗原性差異較小，但YN-QJ-2017 株S1 蛋白主要抗原中和表位COE 區(qū)域在第605～613 位明顯增加，第540～548 位明顯減少。處于G2 分支的疫苗株與陽性樣品YN-MZ-2018、YN-JS-2019、YNDLXG-2020 和YN-CJ-2021 在第240～254 位明顯減少，與YN-XW-2018 在第320～326 位明顯減少，與YN-JS-2019 在第389～404 位明顯減少；在COE區(qū)域，YN-CJ-2021 的第502～510 位，YN-LJ-2020的 第529～537、605～613 位，YN-JS-2019 的第540～548 位明顯減少。這可能導(dǎo)致云南省流行毒株與疫苗株在抗原性上存在差異。

3 討論

2010 年以來，PED 的暴發(fā)流行給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。Zuo 等[15]對(duì)2012—2017年從云南省采集的435 份豬腹瀉樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PEDV 樣品陽性率逐年上升。本研究從2017—2022年陽性樣品中擴(kuò)增得到9 份樣品PEDVS1基因，且樣品來源豬群均已接種CV777、AJ1102 和L/W/L 株疫苗，說明這些疫苗株未能對(duì)PEDV 流行提供很好的預(yù)防。通過S1基因遺產(chǎn)進(jìn)化和同源性分析得知，9 份PEDV 陽性樣品位于G1 基因群和G2b基因亞群。這兩種基因型毒株也導(dǎo)致了美國(guó)和韓國(guó)PED 疫情暴發(fā)。李曉成等[8]分析2017 年我國(guó)豬群腹瀉疫病流行狀況，發(fā)現(xiàn)PEDV 為主要病原，其中G2 基因群占90%，說明G2 基因群是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行株；楊漢春等[9]對(duì)我國(guó)部分省份進(jìn)行PEDVS1基因檢測(cè)也得出相同的結(jié)論?？梢钥闯觯颇鲜『蛧?guó)內(nèi)其他地區(qū)當(dāng)前的PEDV 流行株基本一致。從疫苗株的S1 蛋白氨基酸突變位點(diǎn)分析來看，2份G1 基因群樣品和7 份G2 基因群樣品與各自同群的疫苗株均存在較多相同的突變位點(diǎn)，但也存在不一致的突變位點(diǎn)。值得注意的是，G1 基因群樣品YN-XW-2022 與G2 基因群樣品和疫苗株在第1～163 位存在10 處一致的突變位點(diǎn)，同時(shí)也存在9 處與G1 和G2 基因群毒株都不一致的突變位點(diǎn)。這提示PEDV 流行毒株在疫苗免疫和繁育過程中可能發(fā)生了G1 和G2 基因群的基因重組或變異現(xiàn)象。Cuo 等[10]對(duì)PEDV 流行毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化和基因型分析，發(fā)現(xiàn)存在G1 和G2 基因群重組毒株。王若木等[11]研究G2 基因型PEDV 疫苗免疫后的毒株遺傳進(jìn)化特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)PEDV 毒株在免疫壓力下S1 蛋白氨基酸序列發(fā)生了獨(dú)特的突變。從這方面看，流行毒株S1 蛋白的這一系列變化可能會(huì)導(dǎo)致云南省PED 免疫失敗。

PEDV S 蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合、入侵宿主細(xì)胞以及介導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體有著重要聯(lián)系，是研發(fā)疫苗的首要目的蛋白；不同毒株S基因間存在不同程度的核苷酸插入、缺失和突變等現(xiàn)象，進(jìn)而影響其抗原性[12-13]。Chen 等[14]通過PEDV 變異株基因序列分析，首次公布了PEDV 變異株的主要變異區(qū)為S1基因。朱海俠等[12]通過分析4 株分離株與疫苗株P(guān)EDVS1基因主要抗原表位區(qū)抗原位點(diǎn)變化，推測(cè)抗原表位變化可能是影響PEDV 感染的主要原因。因此，通過PEDVS1基因主要抗原表位區(qū)的位點(diǎn)變化，結(jié)合遺傳進(jìn)化和同源性分析，比較分離株與疫苗株S1基因的差異，可推測(cè)現(xiàn)有疫苗的保護(hù)情況。本研究發(fā)現(xiàn)，陽性樣品與不同基因群的3 株疫苗株相比，在S1 蛋白主要抗原中和表位區(qū)COE 區(qū)域和以外區(qū)域均出現(xiàn)了不同程度變化，提示現(xiàn)有疫苗對(duì)云南省PEDV 流行毒株不具有較好的免疫效果，迫切需要研發(fā)能保護(hù)豬只免受新型PEDV 攻擊，并且安全、有效以及低價(jià)的疫苗[15-16]。

4 結(jié)論

綜上所述，云南省部分地區(qū)同時(shí)流行G1 基因群和G2b 基因亞群兩種PEDV 基因型毒株，但G2b 為優(yōu)勢(shì)流行基因亞型，其與同群的北美洲毒株有密切親緣關(guān)系；云南流行株和疫苗株間存在較遠(yuǎn)的遺傳親緣關(guān)系，已發(fā)生了部分氨基酸突變，尤其在抗原表位區(qū)，推測(cè)現(xiàn)有疫苗株對(duì)云南省部分PEDV 流行毒株不具有較好的保護(hù)效果，這很可能是導(dǎo)致現(xiàn)在PED 控制不理想的原因。