◎ 程菲兒，劉惠卿，張文靜

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030001）

自由基是機(jī)體在進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生包含一個(gè)非成對(duì)電子的原子團(tuán)[1]。機(jī)體健康時(shí)產(chǎn)生清除自由基的酶類如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等保持體內(nèi)平衡[2]。年齡增長及外部條件作用（如煙酒、輻射、紫外線和農(nóng)藥等）會(huì)使體內(nèi)自由基過量，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、機(jī)體老化，誘發(fā)心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[1]。抗氧化劑的攝入可減少機(jī)體內(nèi)過多自由基造成的危害，其來源可分為天然和人工合成兩類。天然抗氧化劑從果蔬及動(dòng)物體內(nèi)獲得，如多酚、維生素等，它們具有抗氧化、消炎、防衰老、抑菌和降血糖血脂等功效，相比人工合成毒性低、效果好[3]。

原花青素（Proantho Cyanidins，PC）和原兒茶酸（Protocatechuic Acid，PCA）是兩種抗氧化性較強(qiáng)的天然抗氧化劑，對(duì)自由基的猝滅作用較強(qiáng)。PC 是一類多酚化合物，在葡萄籽、藍(lán)莓等植物中大量存在，其含有的多電子酚羥基結(jié)構(gòu)，具有較高的抗氧化活性[4]。低聚PC 能減少線粒體毀壞阻斷細(xì)胞衰老進(jìn)程，增加機(jī)體抗氧化性能；在衰老小鼠體內(nèi)，PC 能顯著增強(qiáng)抗氧化酶類的活性延緩小鼠的衰老速度[5-6]。PCA 是存在于果蔬中的酚酸類物質(zhì)，能與細(xì)胞中活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）結(jié)合使其猝滅，降低ROS 含量，減緩細(xì)胞損傷和凋亡[7]；還具有抗炎的作用，降低腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β）等促癌因子的生成，減緩炎癥反應(yīng)[8]。

研究表明，復(fù)配后的天然抗氧化劑之間能相互促進(jìn)，產(chǎn)生顯著的協(xié)同抗氧化效果[3]。通過對(duì)天然抗氧化劑的種類、濃度等進(jìn)行優(yōu)化，探究協(xié)同抗氧化能力，有助于降低生產(chǎn)成本，避免抗氧化劑過多使用所帶來的安全問題，對(duì)于開發(fā)高效、低毒、低成本的抗氧化劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素、原兒茶酸，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 自由基），美國Sigma 公司；三氨基甲烷-鹽酸緩沖液（Tris-HCl）、鄰苯三酚和無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectramax i3x 多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器上海有限分公司；SP-1910UVPC 型紫外可見分光光度儀，上海光譜儀器有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS210S型電子天平，德國賽多利斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制和復(fù)配

將PC 溶液制備成10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1和50 mg·L-1的梯度質(zhì)量濃度，將PCA 配成2 mg·L-1、4 mg·L-1、5 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1的梯度質(zhì)量濃度。將PC 與PCA 分別按質(zhì)量比1 ∶3、1 ∶1 和3 ∶1 進(jìn)行復(fù)配，用于后續(xù)清除率測(cè)定。

1.3.2 自由基清除率的測(cè)定

DPPH 在517 nm 處測(cè)定吸光值。DPPH 清除率計(jì)算公式為

式中：A1為加入樣液后DPPH 溶液的吸光值；A2為加入樣液后無水乙醇的吸光值；A0為加入蒸餾水后DPPH 溶液的吸光值。

超氧陰離子320 nm 處測(cè)定吸光度，超氧陰離子清除率計(jì)算公式為

式中：A1為樣液、鄰苯三酚和Tris-HCl 混合溶液的吸光值；A2為樣液、蒸餾水和Tris-HCl 混合溶液的吸光值；A0為以蒸餾水、鄰苯三酚和Tris-HCl 混合溶液的吸光值。

1.3.3 Isobologram 分析法

實(shí)驗(yàn)計(jì)算出PC 和PCA 各自的半數(shù)清除濃度及95%置信限，并計(jì)算出復(fù)配物的半數(shù)清除濃度。繪制PC 和PCA 的IC50值和95%置信度，將樣品復(fù)合后得到的IC50值繪入坐標(biāo)內(nèi)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩種原料的相互作用

實(shí)驗(yàn)通過計(jì)算相互作用指數(shù)γ評(píng)價(jià)復(fù)配能力。復(fù)配物的理論IC50add值計(jì)算公式為

式中：Q為A、B 兩種抗氧化劑單獨(dú)作用時(shí)的效價(jià)比，即Q=IC50A/IC50B；K1、K2分別為抗氧化劑A、B 在復(fù)配體系中所占的比例，K2=1-K1。

通過上述實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛩愠鰪?fù)合物實(shí)際上消滅50%自由基時(shí)所需的濃度，即IC50mix值。得到PC 和PCA 復(fù)配后理論上猝滅50%自由基所需的濃度，即IC50add值[9]。將二者進(jìn)行比較，若IC50mix＜IC50add，即可證明兩種樣品復(fù)配之后具有協(xié)同抗氧化活性。

復(fù)配物之間協(xié)同作用的強(qiáng)弱用γ值來表示，計(jì)算公式為

式中：IC50Amix、IC50Bmix分別為復(fù)配體系中A、B兩種抗氧化劑各自的IC50值；IC50A、IC50B分別為A、B 兩種抗氧化劑單獨(dú)作用時(shí)的IC50值。若γ=1，表示相互作用為相加；若γ＜1，表示二者之間存在協(xié)同，γ值越低藥物之間的協(xié)同作用越強(qiáng)；若γ＞1，表示相互作用為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 PC 和PCA 清除自由基的能力

由圖1（a）可知，PCA 的濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，清除率為28.98%，PC 濃度為50 mg·L-1時(shí)，清除率為41.59%。PC 與PCA 的半數(shù)清除濃度分別為60.32 mg·L-1、 17.53 mg·L-1。猝滅超氧陰離子自由基的強(qiáng)弱順序?yàn)镻CA ＞PC。由圖1（b）可知，PC、PCA 消滅自由基的比例與濃度成正比，最后達(dá)到穩(wěn)定。當(dāng)PCA 的濃度是10 mg·L-1時(shí)，它能消滅78.44%的DPPH，而此時(shí)PC 的清除率僅為39.20%。當(dāng)PC 的濃度為50 mg·L-1時(shí)，其清除率達(dá)到85.62%。PC 和PCA 的IC50值分別為13.66 mg·L-1和5.80 mg·L-1。清除DPPH 自由基的強(qiáng)弱順序?yàn)镻CA ＞PC。

圖1 PC 和PCA 對(duì)自由基的清除率圖

2.2 Isobologram 法評(píng)價(jià)PC 和PCA 的相互作用

2.2.1 PC 和PCA 復(fù)配后對(duì)自由基清除率的測(cè)定

PC 和PCA 復(fù)配后對(duì)于自由基的清除率如表1 所示。二者復(fù)配的實(shí)際的IC50mix值見表2。

表1 不同比例PC 和PCA 對(duì)DPPH、超氧陰離子自由基的清除率表

表2 PC 和PCA 復(fù)配后清除DPPH、超氧陰離子自由基的IC50mix 值表

2.2.2 復(fù)配后的Isobologram 分析圖

根據(jù)表1、表2 繪制復(fù)配物對(duì)DPPH 自由基、超氧陰離子自由基清除率的等輻射分析，如圖2 所示，PC 和PCA 復(fù)配后作用點(diǎn)均位于相加線及95%置信區(qū)的下方，這表明二者之間為協(xié)同作用。

圖2 PC 和PCA 復(fù)配后清除自由基的Isobologram 分析圖

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算復(fù)配組對(duì)DPPH 自由基、超氧陰離子自由基理論上的IC50add值，將IC50mix值與IC50add值進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

表3 PC 和PCA 復(fù)配后的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表

由表3 可知，對(duì)于自由基指標(biāo)下的每一個(gè)復(fù)配比的理論IC50mix值都比實(shí)驗(yàn)IC50add值小，各組合的γ值也均小于1。即證明PC與PCA按不同比例重新組合后，復(fù)合物清除自由基的效果比樣品單獨(dú)作用時(shí)強(qiáng)，具有協(xié)同效果。結(jié)果表明，PC 和PCA 復(fù)配對(duì)超氧陰離子的清除能力更強(qiáng)，其相互作用指數(shù)可達(dá)0.28。在清除DPPH 自由基時(shí)，PC ∶PCA 復(fù)合后的抗氧化性次序?yàn)? ∶1 ＞1 ∶1 ＞1 ∶3；在清除超氧陰離子自由基時(shí)，復(fù)配組的抗氧化性的次序?yàn)? ∶1 ＞3 ∶1 ＞1 ∶3。

3 討論

PC 和PCA 都具有較強(qiáng)的抗氧化效果。本研究將PC 和PCA 復(fù)配，利用等輻射分析法并輔助相互作用指數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而較為全面地分析了復(fù)配的協(xié)同抗氧化作用。等輻射分析法又稱Isobologram 分析法，被稱為評(píng)價(jià)藥物間相互作用的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。通過繪制等輻射分析圖，從而說明樣品間的相互作用，可以簡單、有效地評(píng)估樣品在復(fù)配后的聯(lián)合應(yīng)用效果。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到的γ值對(duì)得到復(fù)合抗氧化劑產(chǎn)生最佳抗氧化效果的復(fù)配比提供一定的參考依據(jù)。通過Isobologram 分析法得到PC 和PCA 復(fù)配后的抗氧化效果優(yōu)于兩種單一成分，在對(duì)不同的自由基產(chǎn)生作用時(shí)，復(fù)配比不同，結(jié)果也不同。周甜甜等[10]在關(guān)于落葉松樹皮與藍(lán)莓花青素的協(xié)同抗氧化研究中，得到的γ值集中在0.5 ～0.9，協(xié)同作用最強(qiáng)時(shí)，γ值為0.54。而PC 和PCA 復(fù)配后清除自由基時(shí)，其γ值甚至可以達(dá)到0.28，充分證明了PC 和PCA 協(xié)同抗氧化性較強(qiáng)。龔艷振等[11]在關(guān)于天然抗氧化劑復(fù)配研究進(jìn)展中提到，抗氧化劑復(fù)配后在一起發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)理主要有修復(fù)再生或新生、偶聯(lián)氧化、吸收氧氣以及抗氧化劑之間的相互作用等。段方娥等[12]對(duì)在辣椒素與槲皮素、蘆丁協(xié)同抗氧化作用的研究中提到辣椒素與槲皮素、蘆丁復(fù)合后的協(xié)同抗氧化性強(qiáng)于單一成分，其可能機(jī)制是抗氧化性相對(duì)較弱的辣椒素能修復(fù)再生抗氧化性強(qiáng)的槲皮素和蘆丁，反應(yīng)體系中出現(xiàn)了完整的氧化還原回路，使得復(fù)配物的協(xié)同抗氧化性增強(qiáng)。PC 和PCA 復(fù)配后對(duì)于自由基清除率增強(qiáng)，也可能是因?yàn)檠趸芰^弱的PC 對(duì)抗氧化能力較強(qiáng)的PCA 產(chǎn)生了一定的修復(fù)作用，使得復(fù)配之后的復(fù)合相較于兩種單一作用有較好的協(xié)同抗氧化效果。多酚類物質(zhì)與其他抗氧化劑復(fù)配后發(fā)生協(xié)同作用的機(jī)理可以解釋為基于氧化還原電位差的偶聯(lián)氧化。而PCA 也是一種抗氧化性較強(qiáng)的多酚類物質(zhì)，有理由推斷其與PC 發(fā)生協(xié)同抗氧化的機(jī)理是因?yàn)榘l(fā)生了偶聯(lián)氮化。

4 結(jié)論

PC 和PCA 在對(duì)于自由基的清除中均能發(fā)揮出很強(qiáng)的作用，但是由于反應(yīng)體系不同，因此抗氧化效果也會(huì)存在一定的差異。PC 和PCA 在復(fù)配后的抗氧化活性強(qiáng)于單一組分，并且二者復(fù)配比的差異也對(duì)復(fù)合物的協(xié)同抗氧化效果有所影響。因此，在后續(xù)的研究中需要進(jìn)一步探討復(fù)合抗氧化劑的最佳配比，使其發(fā)揮出最大的協(xié)同抗氧化性，從而能更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，為其他酚類物質(zhì)復(fù)合抗氧化劑的開發(fā)提供一定的參考價(jià)值。