呂 晶，王琮民△，劉 鑫，閆紀(jì)琳

（1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，邯鄲 056038）

睡眠不良是日常生活中常見(jiàn)的現(xiàn)象，可導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知障礙，包括注意力下降、決策和記憶障礙［1-3］，海馬是腦內(nèi)認(rèn)知功能的重要區(qū)域。許多報(bào)道表明，睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）會(huì)導(dǎo)致海馬依賴的記憶障礙。例如，48 h SD可降低大鼠海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)［3］。齒狀回區(qū)（dentate gyrus，DG）在學(xué)習(xí)記憶尤其是在空間編碼中發(fā)揮重要的功能［4］。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）是重要突觸可塑性細(xì)胞模型。研究發(fā)現(xiàn)，3～4 h的SD降低了DG顆粒細(xì)胞的LTP［5］，同時(shí)SD也可抑制顆粒細(xì)胞依賴的神經(jīng)發(fā)生［6］。然而SD損害DG功能潛在的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚不明確。

去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）是誘導(dǎo)和維持LTP所必需的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。去甲腎上腺素能纖維主要起源于藍(lán)斑（locus coeruleus，LC），它們廣泛的投射到整個(gè)前腦區(qū)域，特別是海馬中［7］。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)在DG區(qū)去甲腎上腺素能投射最為密集，且beta-腎上腺素能受體（beta-adrenergic receptors，beta-AR）高度表達(dá)［7，8］。行為學(xué)研究表明，NE激活beta-AR是空間學(xué)習(xí)和記憶所必須，且DG中阻斷beta-AR不僅抑制空間學(xué)習(xí)還會(huì)損傷LTP的持久性［9，10］。然而，目前有關(guān)DG內(nèi)beta-AR對(duì)SD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶作用的研究報(bào)道較少。因此，本研究旨在研究beta-腎上腺素能信號(hào)對(duì)睡眠剝奪記憶障礙的干預(yù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試劑

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重250～300 g，由北京維通利華提供，許可證號(hào)：SCXK京2008-0011；剝奪桿式睡眠剝奪儀（上海新軟，XR-XS107）；腦立體定位儀（成都泰盟，DW-2000）；微量注射泵（日本Eicom，ESP-64）；石蠟切片機(jī)（金華華速科技，HS2046）；光學(xué)顯微鏡（萊卡，DMC5400）；異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO，I5627）購(gòu)買(mǎi)自sigma；腦源性神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng) 因 子（brain derived neurotrophic factor，BDNF，Ab108319）抗體購(gòu)買(mǎi)自abcam。c-Fos（2250）及b-actin（3700）抗體購(gòu)買(mǎi)自Cell signaling。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

動(dòng)物分為對(duì)照組，異丙腎上腺組（ISO），模型組（SD）和SD+ISO組。施加睡眠剝奪每日18 h，連續(xù)21 d，設(shè)備中的剝奪桿可以周期性地圍繞設(shè)備底部左右滑動(dòng)，每次滑動(dòng)時(shí)間30 s，速度3 m/min，間隔2 min，重復(fù)循環(huán)滑動(dòng)。期間飲食飲水自由。對(duì)照組不進(jìn)行處理。

1.3 微量注射針的植入及給藥

模型結(jié)束后，動(dòng)物麻醉，穩(wěn)定于儀器上，參照Pazinos和Watson大鼠腦圖譜［11］將外套管置于DG區(qū)上1.5 mm處（AP-3.4 mm；L/R-1.8 mm；H-2.5 mm），牙托水泥固定。術(shù)后休息3 d，將自制微量注射針（前端超出套管1.5 mm）植入套管內(nèi)并固定。每日行為學(xué)檢測(cè)之前，應(yīng)用微量注射泵將鹽水和ISO（2μg/μl溶于鹽水）通過(guò)注射管分別注射到ISO組，SD組和SD+ISO組DG區(qū)域，注射速度0.5μl/min，時(shí)間2 min，總體積1μl，滯留時(shí)間2 min。

1.4 大鼠行為學(xué)測(cè)試

Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）檢測(cè)空間學(xué)習(xí)能力。MWM分四個(gè)象限，圓形平臺(tái)放置在第III象限的中心。訓(xùn)練包括定位航行（1～4 d）和空間探索（第5日）實(shí)驗(yàn)。正式訓(xùn)練前，動(dòng)物先入水適應(yīng)2 min。定位航行實(shí)驗(yàn)中，大鼠每天分別從四個(gè)象限入水自由游泳，每次每只大鼠游泳時(shí)間限制120 s，若在此期間大鼠找到并爬上站臺(tái)穩(wěn)定站立10 s，則大鼠進(jìn)水至游上隱蔽平臺(tái)所逃逸時(shí)間記為逃避潛伏期，若120 s內(nèi)未游上站臺(tái)，潛伏期為120 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，將圓形平臺(tái)從游泳池中移除，記載2 min間動(dòng)物在每個(gè)象限的時(shí)間比和穿臺(tái)次數(shù)。整個(gè)訓(xùn)練中動(dòng)物的游泳速度也將計(jì)入最終統(tǒng)計(jì)。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

訓(xùn)練結(jié)束大鼠處死，取出一側(cè)腦組織，經(jīng)固定、濃度梯度遞減的乙醇溶液脫水、石蠟包埋、切為5μm的薄片、脫蠟、樣本處滴3%過(guò)氧化氫溶液，隨后微波熱源修護(hù)，燒杯內(nèi)緩沖液沸騰后停止加熱，重復(fù)上述步驟3次。隨后組織切片自然冷卻，應(yīng)用5%BSA封閉20 min，輕甩表面殘留液體。c-Fos一抗4℃過(guò)夜，第2日室溫下滴加二抗反應(yīng)20 min，最后顯色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡采集圖片。

1.6 免疫印跡

動(dòng)物處死并在顯微鏡下分離一側(cè)DG組織。組織內(nèi)加入RIPA裂解緩沖液，于冰上勻漿提取總蛋白，采用BSA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，提前配置濃縮和分離膠，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫下與5%脫脂牛奶孵育2 h，隨后PBST洗膜。分別加入含c-Fos（1∶1 000）和BDNF（1∶1 000）抗體4℃孵育過(guò)夜。洗滌后，應(yīng)用二抗（1∶1 000）在室溫下孵育2 h。用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，應(yīng)用image Lab軟件分析目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，將其二項(xiàng)蛋白條帶的灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海馬DG內(nèi)beta-AR對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶功能的影響

2.1.1 海馬DG內(nèi)beta-AR對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響 前4日大鼠逃避潛伏期作為定位航行指標(biāo)，代表大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，結(jié)果如表1所示，各組大鼠前4 d逃逸時(shí)間伴隨學(xué)習(xí)天數(shù)累加均逐漸減少。與對(duì)照組相比，SD組在第2～4日逃逸時(shí)間明顯增加（P＜0.01）；ISO組在第4日逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05），與ISO組相比，SD+ISO組第4日逃避潛伏期明顯增加（P＜0.05），然而與SD組相比，SD+ISO組逃逸時(shí)間降低，且在第3和4日具有顯著性差異（P＜0.01）。MWM水迷宮訓(xùn)練中四組大鼠游泳速度均無(wú)顯著性差異（P＞0.05，表2）。

Tab.1 Comparison of escape latency in various groups of rats（s，±s，n=6）

Tab.1 Comparison of escape latency in various groups of rats（s，±s，n=6）

SD：Sleep deprivation；ISO：Isoproterenol *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs SD group；△P＜0.05 vs ISO group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs1 d

Group 1 d 2 d 3 d 4 d Control 52.27±17.34 29.93±12.52▲ 20.92±7.18▲▲ 18.61±6.45▲▲ISO 61.22±32.24 39.69±6.08 23.09±6.75▲ 10.35±4.07*▲▲SD 77.95±15.35 64.78±31.56** 58.44±19.74**▲ 38.95±18.11**▲▲SD+ISO 73.40±29.76 45.85±19.78 29.75±12.98##▲▲ 19.77±5.99##△▲▲

Tab.2 Comparison of swimming speed in various groups of rats（mm/s，±s，n=6）

Tab.2 Comparison of swimming speed in various groups of rats（mm/s，±s，n=6）

Group 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d Control 159.14±17.63 145.60±26.45 121.36±16.53 105.24±16.53 186.92±40.22 ISO 178.62±39.77 165.32±29.54 140.23±27.99 92.22±23.95 190.17±37.89 SD 143.87±18.29 134.40±8.54 143.67±14.32 125.90±28.36 190.79±8.69 SD+ISO 154.83±32.62 143.69±19.74 128.72±15.99 108.13±24.81 192.71±60.60

2.1.2 海馬DG內(nèi)beta-AR對(duì)大鼠空間記憶能力的影響 第5日每個(gè)象限時(shí)間百分比及穿臺(tái)次數(shù)作為空間探索指標(biāo)，代表大鼠的空間記憶能力，結(jié)果顯示，第5日所有組動(dòng)物對(duì)第III象限均表現(xiàn)出顯著的偏愛(ài)，滯留時(shí)間最高（圖1）。如表3所示，與對(duì)照組相比，SD組III象限停留時(shí)間比例（P＜0.01）及穿臺(tái)次數(shù)（P＜0.05）均顯著降低。ISO組在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比稍高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），穿臺(tái)次數(shù)兩組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與ISO組相比，ISO+SD組穿臺(tái)次數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05），但I(xiàn)II象限滯留時(shí)間均顯著減少（P＜0.05）。與SD組相比，ISO+SD組穿臺(tái)次數(shù)雖無(wú)顯著變化（P＞0.05），但I(xiàn)II象限滯留時(shí)間顯著增加（P＜0.05）。四組間大鼠第5日游泳速度無(wú)顯著差異（P＞0.05，表2）。

Fig.1 Representative swimming traces in the spatial probe trial of MWM test

Tab.3 Comparison of the proportion of total time spent in each quadrant and number of platform crossing in various groups of rats（±s，n=6）

Tab.3 Comparison of the proportion of total time spent in each quadrant and number of platform crossing in various groups of rats（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs SD group；△P＜0.05 vs ISO group

Group Percentage of time spent in quadrant（%）（Quadrant）I II III（target） IV Number of platform crossing（Times/120 s）Control 18.83±5.92 18.12±6.85 43.57±7.98 19.48±6.36 8.67±3.01 ISO 11.86±8.15 15.96±3.21 49.81±2.96 20.95±6.63 8.16±4.28 SD 18.08±4.11 28.84±7.59* 31.33±3.20** 21.74±5.80 5.67±1.49*SD+ISO 18.01±4.06 17.94±8.59 40.00±5.90#△ 24.04±8.52 6.83±2.57

2.2 海馬DG內(nèi)beta-AR對(duì)c-Fos蛋白表達(dá)的影響

圖2免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，DG區(qū)c-Fos蛋白在所有組別胞漿和核中均有所表達(dá)，其中在對(duì)照組，ISO組及SD+ISO組表達(dá)較明顯。免疫印跡結(jié)果顯示（表4，圖3），與對(duì)照組相比，SD組動(dòng)物c-Fos表達(dá)明顯減少，ISO組大鼠c-Fos表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。SD+ISO組大鼠c-Fos蛋白水平較ISO組低（P＜0.05），但較SD組相比顯著增加（P＜0.05）。

Fig.2 The expressions of c-Fos detected by immunohistochemical staining（×20）

2.3 海馬DG內(nèi)beta-AR對(duì)BDNF蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡檢測(cè)DG區(qū)BDNF蛋白表達(dá)，結(jié)果如表4和圖3所示，與對(duì)照組相比，SD組DG區(qū)BDNF蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），與SD組相比，ISO+SD組中BDNF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。對(duì)照組、SD+ISO及ISO組三組大鼠BDNF水平之間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

Tab.4 Comparison of c-Fos and BDNF protein levels in the hippocampus DG in various groups of rats（±s，n=6）

Tab.4 Comparison of c-Fos and BDNF protein levels in the hippocampus DG in various groups of rats（±s，n=6）

*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs SD group；△P＜0.05 vs ISO group

Group c-Fos/b-actin BDNF/b-actin Control 0.725±0.174 0.726±0.881 ISO 0.867±0.240 0.612±0.306 SD 0.473±0.134* 0.392±0.102*SD+ISO 0.659±0.051#△ 0.540±0.129#

Fig.3 The expressions of c-Fos and BDNF detected by Western blot

3 討論

睡眠不足可對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生不利影響。多種研究都強(qiáng)調(diào)了SD會(huì)損害學(xué)習(xí)和記憶，特別是海馬依賴性記憶，如空間學(xué)習(xí)和記憶［1，12］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，SD大鼠在空間學(xué)習(xí)和記憶方面也表現(xiàn)出類似的損害。

海馬由不同的亞區(qū)組成，其中DG區(qū)對(duì)于編輯與分析空間位置記憶非常關(guān)鍵［4］。行為研究表明，LC激活后的NE釋放不僅能促進(jìn)記憶的形成和鞏固，對(duì)于DG中LTP的誘導(dǎo)和維持也是必不可少的，而這些過(guò)程中主要由beta-AR所介導(dǎo)［9，10］。已知beta-ARs高表達(dá)于DG突觸后部位的顆粒細(xì)胞內(nèi)［8］，且有研究發(fā)現(xiàn)，DG內(nèi)特異性阻斷beta-AR會(huì)抑制LTP的產(chǎn)生而導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)障礙［10］。因此，本研究探究在SD這一特殊情況下，DG內(nèi)beta-AR對(duì)空間學(xué)習(xí)和記憶的影響。本研究在DG內(nèi)微量注射beta-AR激動(dòng)劑，結(jié)果顯示，外源性激活beta-AR可明顯改善SD誘發(fā)的空間學(xué)習(xí)與記憶障礙。早期研究發(fā)現(xiàn)，beta-AR激動(dòng)劑增加DG顆粒細(xì)胞中電壓依賴性鈣通道的活性［13］。本研究室前期研究也發(fā)現(xiàn)，在海馬DG內(nèi)ISO激活beta-AR后可增加突觸傳遞效率及DG區(qū)局部谷氨酸的水平，進(jìn)而促進(jìn)大鼠主動(dòng)回避反應(yīng)的獲得［11］，因此，本研究結(jié)果提示，beta-AR改善SD大鼠空間認(rèn)知障礙可能與直接或間接影響DG區(qū)細(xì)胞興奮性進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸可塑性有關(guān)。

c-Fos作為即早基因一種，是目前最常用的神經(jīng)元激活標(biāo)志之一。很多研究表明，c-Fos在海馬中具有重要調(diào)節(jié)作用，調(diào)控神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)展及受損修復(fù)［14］。不僅如此，c-Fos還可調(diào)節(jié)長(zhǎng)期記憶的形成及神經(jīng)可塑性［15］，因此c-Fos表達(dá)常被作為神經(jīng)可塑性的代表蛋白。在海馬DG區(qū)c-Fos高度表達(dá)，且可在海馬依賴性物體識(shí)別學(xué)習(xí)記憶后表達(dá)明顯增加［16］。然而，DG區(qū)beta-AR是否可調(diào)節(jié)c-Fos影響海馬學(xué)習(xí)記憶功能尚不明確。本研究結(jié)果顯示，c-Fos在海馬DG區(qū)大量表達(dá)，且SD降低DG區(qū)c-Fos蛋白水平，表明SD降低神經(jīng)元活性。激活beta-AR后DG區(qū)c-Fos蛋白水平顯著增加，提示DG區(qū)beta-AR激活可調(diào)節(jié)c-Fos表達(dá)，增加神經(jīng)元活性改善SD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)。

BNDF作為廣泛研究的生長(zhǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮許多關(guān)鍵功能。很多研究表明，BDNF在中樞內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞再生、成熟以及突觸產(chǎn)生等過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控功能［17］。Mello-Carpes PB等人發(fā)現(xiàn)，NE激活beta-AR后，可通過(guò)增加海馬內(nèi)BDNF表達(dá)提高海馬依賴性新物體認(rèn)知記憶的鞏固［18］。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DG區(qū)突觸蛋白BDNF水平。結(jié)果顯示，SD會(huì)減少DG區(qū)BDNF水平，而ISO激活beta-AR后BDNF蛋白表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)，海馬內(nèi)灌注BDNF會(huì)恢復(fù)應(yīng)激誘發(fā)的空間記憶及LTP的損害［19］，而DG內(nèi)NE作用beta-AR也可通過(guò)影響B(tài)DNF表達(dá)調(diào)節(jié)突觸可塑性參與到應(yīng)激大鼠空間學(xué)習(xí)記憶中［9］。因此，本研究中海馬DG區(qū)beta-AR激活后改善SD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶，可能是通過(guò)增加突觸蛋白BDNF相關(guān)突觸可塑性機(jī)制完成的，然而其具體生理機(jī)制還有待繼續(xù)探究。

綜上所述，本研究表明，海馬DG中beta-AR的激活通過(guò)增加c-Fos和BDNF蛋白的表達(dá)來(lái)改善SD誘發(fā)的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙，本研究結(jié)果為改善SD誘發(fā)認(rèn)知功能障礙相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。