曹書源，常 青，劉國純，羅明昊，汪 洋，何龍林

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，重慶 400050）

高血壓引發(fā)慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）和終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD），最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化甚至腎功能衰竭［1］，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的巨大威脅，目前在臨床治療中能夠阻止或逆轉(zhuǎn)腎纖維化的療法仍然有限［2，3］。近年來有研究表明，有氧運動或有氧運動聯(lián)合抗阻運動可以改善高血壓、增強腎臟抗氧化能力、減輕腎臟纖維化程度。Souza Michel Kendy等人［4］研究表明，抗阻訓(xùn)練可有效減輕5/6腎切除CKD模型大鼠的腎臟纖維化和炎癥；Shimojo Guilherme Lemos等人［5］證明有氧運動聯(lián)合抗阻訓(xùn)練可降低平均動脈血壓，減少去卵巢大鼠心臟炎癥因子TNF-α和IL-6表達，降低心臟和腎臟的脂質(zhì)過氧化水平，還增強心臟和腎臟的總抗氧化能力。有氧運動作為運動康復(fù)的重要手段之一，是改善原發(fā)性高血壓患者血壓的一種潛在的非藥物治療方法。但是關(guān)于有氧運動如何改善高血壓腎損傷的機制研究甚少，有待進一步的探討。

有氧運動訓(xùn)練可以通過下調(diào)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的活性來降低血壓。Silva SD等人研究［6］證實有氧訓(xùn)練降低自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）的動脈收縮壓，下調(diào)RAAS的血管收縮軸進而發(fā)揮腎臟保護作用，并且這些益處是可持續(xù)的。付常喜等人研究顯示［7］，8周跑臺運動后自發(fā)性高血壓大鼠有氧運動組的TGF-β和CTGF蛋白表達量下調(diào)，提示規(guī)律運動訓(xùn)練至少部分通過抑制TGF-β信號通路改善高血壓誘導(dǎo)的腎臟纖維化。綜上，有氧運動可以下調(diào)RAAS的血管收縮軸，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性。本研究旨在探討在持續(xù)有氧運動訓(xùn)練干預(yù)下，腎臟中的血管緊張素Ⅱ含量的變化，血管緊張素Ⅱ-血管緊張素1型受體-轉(zhuǎn)化生長因子β（AngⅡ-AT1R-TGF-β）通路的表達是否會隨之下調(diào)，并對比低、中有氧運動強度對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）腎臟纖維化影響的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

8周齡雄性SHR和同齡Wistar京都大鼠（WKY），均為SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2019-0009）。將大鼠隨機分為4組（n=6）：安靜WKY對照組（WKY-S）、安靜SHR對照組（SHR-S）、低強度運動組（SHR-L）和中等強度運動組（SHRM）。重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（實驗動物使用許可證：SYXK（渝）2018-0003）統(tǒng)一飼養(yǎng)，每籠約5只，室溫約22℃，正常光照周期（晝夜12∶12 h），濕度保持40%～45%，飲用水和飼料自由獲取，所有實驗環(huán)境達到特定的無病原體（SPF級）。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。

1.2 實驗設(shè)計與運動方案

根據(jù)《心血管研究動物運動和訓(xùn)練方案指南》［8］的要求，運動組大鼠經(jīng)過一周的適應(yīng)性訓(xùn)練后，SHR-L組、SHR-M組分別以14 m/min（最大有氧速度的35%）、20 m/min（最大有氧速度的50%）在0°坡度的運動跑步機上跑步［9］。運動訓(xùn)練組運動負荷為每天跑步60 min，每周跑步5 d，共14周。大鼠運動結(jié)束后72 h的上午，進行血壓、心率測定（避免急性運動的影響），三次測量結(jié)果計算平均值，之后取血和腎臟。

1.3 實驗取材與檢測指標

實驗14周后，所有實驗大鼠進行血壓、心率測定后，稱重，腹腔注射1%戊巴比妥麻醉。采用眼眶取血法，1 500 r/min離心10 min，分離血清，-80℃凍存。氧化酶法測定血清肌酐（serum creatinine，SCr），尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測定血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。對大鼠實施安樂死，取出腎臟，剝離筋膜后將腎臟分為兩部分，一部分用多聚甲醛浸泡固定后待切片病理組織學(xué)觀察，采用蘇木精與伊紅（HE）染色觀察腎組織形態(tài)，Masson染色觀察腎組織膠原沉積情況，計算腎臟膠原容積分數(shù)；另一部分腎臟用凍存管儲存并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱凍存，待Western blot檢測腎臟AngⅡ、AT1R、TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達。

1.4 血壓心率測定

智能無創(chuàng)血壓計-Softron BP-2010系列血壓計，測定尾動脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、心率（heart rate，HR）。

1.5 腎臟病理組織學(xué)觀察

腎臟病理組織學(xué)觀察組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋并利用病理切片機（RM2255，德國）制作4μm切片。用蘇木精與伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)，Masson染色膠原纖維，正置相差顯微鏡（Leica DM4B，德國）下選取10個視野，觀察膠原沉積情況，用圖像分析軟件（ImageJ 1.52v，美國）測量結(jié)締組織面積與所測視野面積的比值作為膠原容積分數(shù)（collagen volumetric fraction，CVF）。

1.6 蛋白表達量檢測

利用Western blot法檢測腎臟AngⅡ、AT1R、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、TGF-β和CTGF蛋白表達量。分離腎皮質(zhì)，勻漿后提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取50μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)7.5%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。兔抗鼠一抗4℃靜置孵育過夜，羊抗兔二抗37℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL發(fā)光成像，利用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并掃描各條帶灰度值。將各組與GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 有氧運動后SHR大鼠血壓水平變化

與WKY-S組比較，SHR-S組SBP、DBP和MAP均顯著性升高（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組血壓水平降低（P＜0.05），SHR-M組血壓水平降低相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，表1）。

2.2 有氧運動后SHR大鼠腎臟功能變化

腎臟功能檢測顯示，與WKY-S組比較，SHR-S組BUN和SCr升高（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組BUN和SCr下降（P＜0.05），SHR-M組BUN和SCr下降水平相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Changes of blood pressure and kidney function of SHR after aerobic exercise（±s，n=6）

Tab.1 Changes of blood pressure and kidney function of SHR after aerobic exercise（±s，n=6）

SBP：Systolic blood pressure；DBP：Diastolic blood pressure；MBP：Mean arterial pressure；Scr：Serum creatinine；BUN：Blood urea nitrogen；WKY-S：Sedentary wistar kyoto rats；SHR-S：Sedentary spontaneously hypertensive rats *P＜0.05 vs WKY-S；#P＜0.05 vs SHR-S；▲P＜0.05 vs SHR-L

Group SBP（mmHg） DBP（mmHg） MBP（mmHg） Scr（mol/L） BUN（mmol/L）WKY-S 108.6±5.42 82.0±4.07 90.6±4.53 29.79±2.51 6.09±0.55 SHR-S 154.0±11.01* 124.9±10.13* 134.5±5.43* 51.14±4.46* 10.71±0.73*SHR-L 141.3±10.42# 113.6±7.82# 123.3±8.31# 40.35±6.89# 8.28±0.37#SHR-M 125.6±10.72#▲ 95.3±6.50#▲ 102.9±5.00#▲ 30.69±2.01#▲ 5.94±0.89#▲

2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察與膠原容積分數(shù)（CVF）

四組大鼠腎臟HE染色與Masson染色顯示病理變化見圖1，腎實質(zhì)細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。WKY-S組腎小球和腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)中僅有少量膠原纖維；SHR-S組腎小球萎縮，腎小管管腔擴張，間質(zhì)增厚并存在大量膠原纖維，CVF高于WKY-S組（P＜0.05）；SHR-L組和SHR-M組腎小球、腎小管病變減輕，膠原纖維減少，CVF較SHR-S組分別降低（P＜0.05）。SHR-M組膠原纖維減少相較SHR-L組更明顯（表2）。

Fig.1 HE and Masson staining in renal tissues of rats in each group

2.4 AngⅡ、AT1R蛋白表達量的變化

與WKY-S組比較，SHR-S組AngⅡ、AT1R蛋白表達量上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組AngⅡ、AT1R蛋白表達下調(diào)（P＜0.05），SHR-M組AngⅡ、AT1R蛋白表達下調(diào)相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，圖2，表2）。

Fig.2 AngⅡand AT1R protein expressions in renal tissues of rats in each group

Tab.2 The levels of SHBG and LPSin rats（±s，n=10）

Tab.2 The levels of SHBG and LPSin rats（±s，n=10）

*P＜0.05 vs WKY-S；#P＜0.05 vs SHR-S；▲P＜0.05 vs SHR-L

Group Ang II AT1R Collagen volumetric fraction（%）WKY-S 1.00±0.08 1.00±0.22 3.34±1.82 SHR-S 3.05±0.22*4.53±0.60* 12.96±5.44*SHR-L 1.85±0.30#2.25±0.20# 6.72±2.37#SHR-M 1.44±0.28#▲1.27±0.24#▲ 3.56±1.36#▲

2.5 TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達量的變化

與WKY-S組比較，SHR-S組TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達量上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達下調(diào)（P＜0.05），SHR-M組TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達下調(diào)相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，圖3，表3）。

Fig.3 Expressions ofα-SMA，TGF-β，CTGF protein in renal tissues of rats in each group

Tab.3 The protein levels ofα-SMA，TGF-βand CTGF（±s，n=6）

Tab.3 The protein levels ofα-SMA，TGF-βand CTGF（±s，n=6）

*P＜0.05 vs WKY-S；#P＜0.05 vs SHR-S；▲P＜0.05 vs SHR-L

Group α-SMA TGF-β CTGF WKY-S 1.00±0.11 1.00±0.11 1.00±0.23 SHR-S 2.05±0.22*4.49±0.41*4.30±0.45*SHR-L 1.47±0.17#2.47±0.17#2.73±0.61#SHR-M 1.26±0.14#▲1.26±0.11#▲1.05±0.20#▲

3 討論

本研究結(jié)果表明：（1）14周的規(guī)律有氧運動可以降低SHR血壓，中等強度有氧運動降血壓效果更明顯。（2）SHR腎功能發(fā)生損傷，14周規(guī)律的有氧運動可以減輕SHR腎損傷程度且中等強度有氧運動較低強度有氧運動減輕腎損傷的作用更顯著。（3）SHR出現(xiàn)腎纖維化，經(jīng)過14周的規(guī)律有氧運動減輕了腎纖維化程度，中等強度有氧運動較低強度有氧運動減輕腎纖維化的效果更明顯。（4）運動后SHR腎臟AngⅡ-AT1R-TGF-β促纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到抑制，AngⅡ、AT1R、TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達下調(diào)，且中等強度有氧運動組較低強度有氧運動組下調(diào)效果更明顯。

運動可以改善高血壓狀態(tài)，且本研究在設(shè)置不同強度有氧運動的對比實驗中顯示，中等強度有氧運動組的降血壓效果更明顯。其他相關(guān)研究對此有相同性結(jié)論：竇麗的研究表明［10］持續(xù)有規(guī)律的有氧運動對SHR的降壓效果持續(xù)有效，且堅持運動數(shù)周后降壓效果更明顯。腎素-醛固酮-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS）活化會促進血管緊張素Ⅱ的血管收縮作用升高血壓［11］。李曄研究表明［12］長期中等強度跑臺運動對SHR大鼠血漿、胸主動脈、心臟和腎臟的內(nèi)皮素-1和血管緊張素Ⅱ的分泌均有明顯的下調(diào)作用，提示有氧運動對SHR的降壓作用是通過影響內(nèi)皮素-1和血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生和釋放來實現(xiàn)的。黃超清等人［13］通過12周的運動跑臺實驗，闡釋了運動訓(xùn)練能有效降低SHR的血壓和SHR腎損害的嚴重程度；Almeida，J.A等人［14］研究發(fā)現(xiàn)，高強度間歇有氧訓(xùn)練可降低SHR的血壓。本實驗在有氧運動可以下調(diào)AngⅡ活性的假設(shè)前提下，試圖闡明有氧運動可以通過抵抗AngⅡ的血管收縮作用來降低血壓，實驗結(jié)果提示腎臟中AngⅡ表達量降低和SHR的血壓下降明顯相關(guān)。本研究表明規(guī)律的有氧運動可以減輕SHR腎損傷程度，且中等強度有氧運動較低強度有氧運動減輕腎損傷的作用更顯著。但是牛衍龍等人［15］的研究表明，大鼠6周遞增負荷游泳訓(xùn)練后腎功能受損，出現(xiàn)蛋白尿，此現(xiàn)象的可能原因為過度訓(xùn)練誘導(dǎo)腎臟內(nèi)部及循環(huán)系統(tǒng)中RAAS持續(xù)興奮，下調(diào)Nephrin蛋白的表達，進而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)與功能異常。

通過組織病理學(xué)觀察和膠原容積分數(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)SHR出現(xiàn)腎纖維化，經(jīng)過14周規(guī)律的有氧運動減輕腎纖維化程度，中等強度有氧運動較低強度有氧運動減輕腎纖維化的效果更明顯。TGF-β通路被激活促進上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT），從而促進AngⅡ誘導(dǎo)腎臟纖維化［16］。AngⅡ作為促纖維化細胞因子，通過EMT有關(guān)的各種途徑調(diào)節(jié)腎細胞的增殖，細胞外基質(zhì)的合成和降解，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的下游靶標結(jié)締組織生長因子（CTGF）的表達［17］。Silva SD等人［6］實驗研究表明有氧運動訓(xùn)練可以通過下調(diào)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的活性，特異性降低SHR腎血管AngⅡ含量來降低血壓和改善腎臟纖維化。Ciampone S等人研究表明［18］，長期運動對AngⅡ受體表達產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，可以使腎臟中AT1R表達降低。在以上研究基礎(chǔ)上，本研究重點關(guān)注運動強度的差異對SHR腎纖維化的影響。實驗結(jié)果表明，中等強度有氧運動更有利于下調(diào)RAAS活性，降低SHR腎血管AngⅡ含量，減少通路下游血管緊張素Ⅰ型受體（AT1R）和AngⅡ的結(jié)合，抑制AngⅡ-AT1R-TGF-β通路上游的傳導(dǎo)，從而延緩SHR腎纖維化的發(fā)展進程。

王欣彤［19］在實驗研究中闡明血管緊張素Ⅱ-血管緊張素1型受體-結(jié)締組織生長因子（AngⅡ-AT1R-CTGF）的過度活躍是高血壓腎損害的重要原因，阻斷其中任何一個因子，不僅可以降血壓，而且還有腎臟保護作用。付常喜等人研究顯示［7］8周跑臺運動后SHR有氧運動組的TGF-β和CTGF蛋白表達量下調(diào)，從而改善高血壓誘導(dǎo)的腎臟纖維化。12周運動跑臺訓(xùn)練通過降低轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGFβ），磷酸化-Smad2/3（p-Smad2/3）的表達，減弱結(jié)締組織生長因子（CTGF）纖維化途徑，改善高血壓腎纖維化程度［13］。本研究設(shè)定低、中強度的有氧運動強度梯度，實驗結(jié)果表明，中等強度有氧運動更明顯地降低SHR的TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達，提示AngⅡ-AT1R-TGF-β信號通路被抑制，有效地減輕SHR的腎纖維化。但是Almeida JA等人［14］研究發(fā)現(xiàn)，8周高強度間歇有氧訓(xùn)練可降低SHR的血壓并下調(diào)RAAS活性。以上研究結(jié)果的差異可能與運動類型不同有關(guān)，需要進一步的實驗論證。

本課題組前期研究證明［9］，低中強度的運動訓(xùn)練可以激活SIRT1/3-AMPK通路，延緩SHR的病理生理進展，降低血壓，改善血管功能。SIRT1/3-AMPK通路激活可以對抗纖維化［20］，我們推測運動改善腎纖維化可能與SIRT1/3-AMPK通路有關(guān)，下一步準備進行驗證。本次研究只設(shè)計低中強度有氧運動組的對比實驗，對其他不同運動類型、不同運動強度比如高強度或高強度間歇性運動對高血壓腎損害影響的作用效果與機制，還有待科研人員開展進一步的研究，為臨床醫(yī)學(xué)疾病治療提供更全面、完整的參考依據(jù)。

綜上所述，AngⅡ-AT1R-TGF-β通路的過度活躍會導(dǎo)致SHR腎纖維化、腎功能進行性下降；有氧運動可以通過下調(diào)AngⅡ-AT1R-TGF-β信號通路抑制高血壓腎病大鼠腎臟纖維化并提高腎功能；中等強度的有氧運動可以更好地改善SHR腎功能損害、抑制SHR腎纖維化。