孫勝君 邢鈺馨

1 煙臺市煙臺山醫(yī)院檢驗科 山東 煙臺 264000； 2 濱州醫(yī)學院公共衛(wèi)生管理學院 山東 煙臺 264003

肺部感染的病原體在發(fā)達國家以病毒為主，而在發(fā)展中國家則以細菌為主[1]。當前，細菌培養(yǎng)法是臨床上細菌感染主要的病原學診斷方法，但存在檢測周期長、培養(yǎng)菌檢出率低、細菌死亡無法檢測等缺點[2]。所以，目前臨床上急需能夠特異、快速檢測感染細菌的方法。和傳統(tǒng)的PCR核酸擴增技術相比，環(huán)介導等溫擴增(isothermal amplification，LAMP)技術有特異性更強、敏感性更高、恒溫且擴增效率高、操作簡便快速等優(yōu)點[3]。本研究通過在細菌和非典型病原體檢測中應用LAMP 技術，旨在比較分析LAMP法與細菌培養(yǎng)法在下呼吸道病原體感染診斷中的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年12月至2020年4月在我院兒科和呼吸科確診的肺部感染住院患者152例，均在住院早期同時做肺泡灌洗液LAMP核酸檢測和病原體培養(yǎng)。其中，63例來自兒科，89例來自呼吸科。男77例，女75例，平均年齡為(41.9±5.4)歲。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 儀器與試劑 Phoenix100全自動細菌分析儀購自美國BD公司，恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀RTisochip-A購自博奧生物有限公司。所用培養(yǎng)基購自英國oxoid公司，鑒定板條購自美國BD公司，晶芯恒溫擴增芯片和晶芯核酸提取試劑購自博奧生物有限公司。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)標本采集 應用纖維支氣管鏡對患者進行常規(guī)檢查，在患者知情同意的基礎上再進行肺部活檢和刷檢。在活檢和刷檢前，先對患者實施支氣管肺泡灌洗操作，立即將BALF標本轉移至無菌培養(yǎng)瓶內，送至實驗室進行標本制備。

1.2.3 微生物鑒定 BALF標本采集2 h內分別接種于血平板、巧克力平板和腸道培養(yǎng)基。血平板和腸道培養(yǎng)基置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，巧克力平板置于35℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。先挑取優(yōu)勢菌落分純并培養(yǎng)24 h，再使用美國BD公司Phoenix100全自動細菌分析儀對分純后的細菌進行細菌鑒定。

1.2.4 LAMP核酸檢測 提取BALF標本中病原體核酸后，取20 μL恒溫擴增試劑加入34.5 μL提取核酸標本，震蕩混勻，加入基因芯片中封口，6 000 r/min離心30 s，置于晶芯Rtisochip-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀中在65℃反應50 min，然后自動測定歸一化曲線。

1.2.5 LAMP結果判定 擴增曲線為“S”型曲線為陽性，水平直線為陰性，起峰時間較長且擴增曲線不規(guī)則也判定為陰性，歸一化曲線顯示陰性對照為陰性，陽性對照為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩兩配對定性資料的比較應用McNemar檢驗(或校正的McNemar檢驗)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢出率的比較 152例標本使用LAMP法檢出細菌感染89例(陽性率為58.55%)，共計包含106個菌株，其中混合感染13例。使用細菌培養(yǎng)法檢出細菌感染55例(陽性率為36.18%)，共計包含60個菌株，其中混合感染5例。兩種檢測方法的病原菌檢出率比較，P<0.05(表1)。

表1 BALF的 LAMP法與培養(yǎng)法檢測結果的比較

2.2 兩種方法檢出病原體分布情況的比較 使用LAMP法病原體檢出率排在前3位的依次為肺炎鏈球菌(15.79%，24/152)、流感嗜血桿菌(14.47%，22/152)、肺炎支原體(13.82%，21/152)。使用培養(yǎng)法病原體檢出率排在前3位的依次為肺炎鏈球菌(7.89%，12/152)、銅綠假單胞桿菌(5.92%，9/152)、金黃色葡萄球菌(4.61%，7/152)。培養(yǎng)法對病原體檢出率低于LAMP法，僅檢出了肺炎鏈球菌和少量流感嗜血桿菌，P均<0.05(表2、3)。兩種方法對于培養(yǎng)條件要求不高的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的檢出率基本一致(表4、5)，對于肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽假單胞菌的檢出率完全一致。這說明，兩種檢測方法對培養(yǎng)條件要求不高的細菌的檢出率差異無統(tǒng)計學意義。LAMP法能檢測非典型病原體例如肺炎支原體(13.82%、21/152)和肺炎衣原體(0.66%、1/152)，而培養(yǎng)法不能檢出非典型病原體。LAMP法檢測出6例耐甲氧西林葡萄球菌，其中有2例是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，而培養(yǎng)法檢僅測出2例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(表6)。培養(yǎng)法將凝固酶陰性葡萄球菌作為污染菌處理，并未進行鑒定和耐藥性檢測，會漏檢一些耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌。

表2 LAMP法與培養(yǎng)法對于肺炎鏈球菌檢測結果的比較

表3 LAMP法與培養(yǎng)法對于流感嗜血桿菌檢測結果的比較

表4 LAMP法與培養(yǎng)法對于金黃色葡萄球菌檢測結果的比較

表5 LAMP法與培養(yǎng)法對于大腸埃希菌檢測結果的比較

表6 LAMP法與培養(yǎng)法對于耐甲氧西林葡萄球菌檢測結果的比較

2.3 兩種方法混合感染檢出率的比較 本研究將檢出兩種以上病原菌感染判定為混合感染，檢出一種病原菌判定為陰性，進行混合感染分析。兩種方法混合感染的檢出率比較，P<0.05(表7)。這說明，這兩種方法對于混合感染檢出率的差異有統(tǒng)計學意義，LAMP法檢測混合感染的能力高于培養(yǎng)法。

表7 入院首次BALF混合感染結果比較

3 討論

LAMP 技術作為一種新的下呼吸道病原體感染診斷手段，敏感性、特異性高，操作簡單、快速[4]，可以在臨床檢測中廣泛使用進行病原體鑒定，檢測對象包含最為常見的病原體。由于下呼吸道苛養(yǎng)菌在轉運過程中容易死亡，對培養(yǎng)基營養(yǎng)和環(huán)境要求高，并且使用的抗菌藥物容易抑制苛養(yǎng)菌的生長[5]，所以LAMP 法較之培養(yǎng)法在下呼吸道苛養(yǎng)菌的檢測方面顯現出非常明顯的優(yōu)勢，對于苛養(yǎng)菌的檢出率遠遠高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。

在混合感染中，培養(yǎng)法較之LAMP法少檢出的病原體主要為肺炎支原體、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌在體內并無相互抑制作用，但當流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌同時在體外培養(yǎng)時，肺炎鏈球菌可以抑制流感嗜血桿菌桿菌的生長[6]，所以LAMP 法對于混合感染的檢出率較高，有效避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法中優(yōu)勢菌、易于生長細菌對其他菌種的抑制作用。

在LAMP法中增加耐甲氧西林葡萄球菌基因測定，這對于指導醫(yī)生用藥有非常重要的意義。LAMP 法可以在早期明確病原體，有利于規(guī)范合理使用抗生素，縮短住院時間，節(jié)約醫(yī)療資源，特別是對于起病急、病程重的患者來說能有效降低死亡率。但LAMP 法當前僅能檢測出芯片中設定的13種病原體，對于病毒、真菌和少見條件致病細菌感染仍然無法檢測，仍需其他檢測手段作為后續(xù)補充，這也限制了LAMP 法的應用范圍。