薛沾枚， 張 艷， 劉雪松， 郝敬友， 蘇 景， 唐 偉，劉彥凱， 孫洪杰， 徐 麗， 張 備， 史同瑞*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.哈爾濱綠達生動物藥業(yè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150039；3.黑龍江省動物疫病控制中心，黑龍江哈爾濱 150069）

呼吸系統(tǒng)疾病能夠引起畜禽機體免疫力低下繼而容易觸發(fā)其他傳染病的發(fā)生，常伴有咳嗽、氣喘、呼氣困難等癥狀，重則導致死亡，患病動物生產(chǎn)性能下降、養(yǎng)殖成本增高、經(jīng)濟效益減少（孟賢蕾，2020）。治療畜禽由細菌感染所引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病時，常使用抗生素，但易產(chǎn)生抗生素耐藥性并造成動物體內藥物殘留；病毒性呼吸系統(tǒng)疾病常以預防為主，但常伴隨細菌和寄生蟲等的繼發(fā)感染，提升高發(fā)病率和高死亡率（朱明霞，2016）。因此，開發(fā)具有抗呼吸道病原、副作用小的中草藥替代品具有重要的意義（王玉芳，2016）。改良清肺顆粒方劑是由板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗組成，經(jīng)發(fā)酵、水提煎煮、濃縮、干燥制粒等工藝而成，具有化痰止咳的功效。顆粒劑便于用藥，能夠最大的發(fā)揮藥效（Zhang，2021）。為保證藥物在生產(chǎn)、貯存、運輸中的質量，控制顆粒劑的穩(wěn)定性是控制質量的重要部分，不僅能保留方劑中藥物有效成分使其充分發(fā)揮藥物療效，又能確保臨床應用的療效性（劉錦泉，2012）。本試驗對濕法制粒而成的改良清肺顆粒進行穩(wěn)定性試驗，為其在生產(chǎn)、運輸、貯藏及使用上提供理論支持和科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥物及試劑 改良清肺顆粒，以板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗為處方（批號分別為20200415，20200416，20200417），由哈爾濱綠達生動物藥業(yè)有限公司研制；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷 （批號：20083104），購自成都普菲德生物技術有限公司；石油醚、乙酸乙酯，購自北京迪科馬科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

1.1.2 試驗儀器 高效液相色譜儀（LC-20AT，RF-20A）、InertSustain C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），購自島津（中國）有限公司；漩渦振蕩器（VortexQL902），購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子分析天平（MS104TS/02），購自梅特勒-托利多（上海）有限公司；隔膜真空泵（GM-0.33A），購自天津市津騰實驗設備有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海旭冠電子科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薄層色譜鑒別 取改良清肺顆粒1 g，加入70%甲醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液作為供試品溶液。取改良清肺顆粒陰性樣品顆粒，制備方法同上。取葶藶子對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液作為對照品溶液。再吸取上述溶液5 μL，點于聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯:甲醇:水（7:2:1）為展開劑，2%三氯化鋁為顯色劑，熱風吹干，置于365 nm紫外燈下觀察。

1.2.2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為InertSustain C18，流動相為甲醇∶0.02%磷酸＝7∶93， 流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為245 nm，進樣量為10 μL。

1.2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取2 mg槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品，放入50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，充分搖勻，制備成濃度為40 μg/mL的對照品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液制備 稱取適量顆粒劑樣品，甲醇溶解，超聲處理30 min，10000 r/min離心6 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.2.4 線性關系考察 精密稱取對照品溶液移置容量瓶中，甲醇定容，制成1 mL含對照品2.5、5、10、20、40 μg的溶液，上樣量10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.5 精密度試驗 精密量取對照品配制濃度為40 μg/mL的溶液，上樣量10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，連續(xù)上樣6次，計算相對標準標準差（RSD）。

1.2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在上述色譜條件下，分別間隔2 h進樣，共測定12個時間點，測定峰面積，計算RSD值。

1.2.2.7 重復性試驗 取同一批供試品溶液，連續(xù)制備6份，在上述色譜條件下，測定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷平均含量，計算RSD值。

1.2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量提取液，共6份，分別精密加入槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品適量，分別進樣l0 μL，計算樣品的加樣回收率。

1.2.3 水分檢測 根據(jù)2020版《中國獸藥典》（四部）通則0832水分檢測法中烘干法測定水分，顆粒劑水分規(guī)≤8%（中國獸藥典委員會，2020）。

1.2.4 粒度檢測 根據(jù)2020版《中國獸藥典》（四部）通則0982粒度檢測法中雙篩法測定粒度，顆粒劑粒度項下規(guī)定≤15%。

1.2.5 溶化性檢測 根據(jù)2020版 《中國獸藥典》（四部）通則0104檢測溶化性，顆粒劑溶化性項下規(guī)定以顆粒劑5 min內全部溶化，肉眼觀察無雜質無異物為符合標準。

1.2.6 影響因素試驗

1.2.6.1 光照試驗 隨機選取3個不同批次的改良清肺顆粒成品，去除包裝，適量均等稱取，平鋪置于培養(yǎng)皿內密閉容器中，將穩(wěn)定性檢測箱光源強度設置為（4500±500）lx，于第0、5、10天同一時間段，根據(jù)2020年版《中國獸藥典》顆粒劑項檢查。

1.2.6.2 高溫試驗 隨機選取3個不同批次的改良清肺顆粒成品，去除包裝，適量均等稱取，平鋪置于培養(yǎng)皿內密閉容器中，置于60℃環(huán)境下，于第0、5、10天同一時間段，根據(jù)2020年版《中國獸藥典》顆粒劑項檢查。

1.2.6.3 高濕試驗 隨機選取3個不同批次的改良清肺顆粒成品，去除包裝，適量均等稱取，平鋪置于培養(yǎng)皿內密閉容器中，放置在NaCl飽和液飽和的干燥器中（濕度為74%），于第0、5、10天同一時間段，根據(jù)2020年版《中國獸藥典》顆粒劑項檢查。

1.2.7 加速穩(wěn)定性試驗 隨機選取將3批不同批次的改良清肺顆粒成品，裝入鋁箔袋，密封包裝，放置于溫度為40℃，濕度為（75±5）%的恒溫培養(yǎng)箱中， 放置6個月， 分別于第0、1、2、3、6個月取樣，根據(jù)2020版《中國獸藥典》顆粒劑項下要求檢測性狀、鑒別、粒度、水分、溶化性和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量。第0個月之后取樣與其進行對比檢測。

1.2.8 長期穩(wěn)定性試驗 將3批不同批次的改良清肺顆粒成品，裝入鋁箔袋，密封包裝，放置于溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±10）%的條件下，放置12個月，每個月相同時間取樣，根據(jù)2015版《中國獸藥典》顆粒劑項下檢測性狀、鑒別、粒度、水分、溶化性和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量情況。第0個月之后取樣與其進行對比檢測。

1.3 統(tǒng)計與分析 用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，通過單因素方差進行差異顯著性檢驗。結果以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜 置紫外燈（254 nm）下視檢。供試品色譜中與槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品和南葶藶子對照藥材色譜位置相同，顯相同的淺紫紅色斑點，陰性對照無干擾。詳細結果見圖1。

圖1 改良清肺顆粒薄層色譜圖

2.2 方法學研究

2.2.1 線性關系考察 經(jīng)測定得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品標準曲線為y＝22074x-33975（R2＝0.9999），結果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量在2.5～40 μg/mL內線性關系良好（圖2、圖3）。

圖2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷標準曲線

圖3 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷標準品液相色譜圖

2.2.2 精密度考察 連續(xù)6次進樣，記錄峰面積。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品峰面積的RSD為0.74%，結果表明，建立測定方法的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性考察 在24 h內連續(xù)進樣測定，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量RSD為0.65%，表明供試品溶液在室溫條件下，24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復性考察 重復測定的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷平均含量為4.50 mg/L，RSD為0.69%，表明測定方法的重復性良好。

2.2.5 加樣回收率考察 結果見表1，平均回收率為98.53%，RSD為0.50%（n＝6），表明方法的準確性良好。

表1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷加樣回收率試驗結果

2.3 影響因素試驗結果

2.3.1 光照對改良清肺顆粒穩(wěn)定性影響 將改良清肺顆粒放置在（4500±500）lx光照強度下照射，于第5、10天后經(jīng)肉眼觀察外觀性狀未發(fā)現(xiàn)明顯變化，顏色為棕黃色，經(jīng)口味苦。放置第5天和第10天后水分及粒度檢測無明顯變化，較第0天相比水分有所增加但符合規(guī)定。放置第5、10天后取樣槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量無明顯變化（P＞0.05），結果表明光照環(huán)境對改良清肺顆粒的性狀、水分、粒度、溶化性、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量影響不明顯（表2）。

表2 光照對改良清肺顆粒穩(wěn)定性的影響結果（n=3）

2.3.2 高溫對改良清肺顆粒穩(wěn)定性影響 將改良清肺顆粒放置在60℃環(huán)境下，于第5天后經(jīng)肉眼觀察外觀性狀未發(fā)現(xiàn)明顯變化，顏色為棕黃色，經(jīng)口味苦，10 d后觀察顏色較之前比顏色偏淺，經(jīng)口味苦。隨著時間增加第10天后與最初相比水分減少0.52%（P＜0.05），粒度無明顯變化，顆粒劑中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量降低9%（P＜0.05）（表3）。

表3 高溫對改良清肺顆粒穩(wěn)定性的影響結果（n=3）

2.3.3 高濕對改良清肺顆粒穩(wěn)定性影響 將改良清肺顆粒放置在NaCl飽和液飽和的干燥器中（濕度為74%），于第5天經(jīng)觀察外觀性狀未發(fā)生明顯變化，顏色為棕黃色，經(jīng)口味苦。放置第10天后顏色變深為棕褐色，經(jīng)口味苦。隨著時間的增加放置第5天與第0天相比水分含量、粒度及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量差異顯著，水分提高5.23%，含量降低0.9%（P＜0.05）；第10天后水分與第0天相比水分提高19.37%（P＜0.01），粒度和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量分別降低9.3%和3%（P＜0.05），溶化性較第0天相比逐漸變差但符合規(guī)定。結果表明高濕環(huán)境對改良清肺顆粒的水分含量影響極大，對粒度和顆粒劑中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量有顯著影響，對溶化性影響不明顯（表4）。

表4 高濕對改良清肺顆粒穩(wěn)定性的影響結果（n=3）

2.4 加速試驗結果 將改良清肺顆粒在溫度為（40±2）℃，濕度為（75±5）%環(huán)境中放置6個月，于第1、2、3、4、5、6月后取樣檢測，外觀觀察顆粒劑顏色、水分含量、粒度、溶化性、含量均未發(fā)生明顯變化，各項指標均符合規(guī)定，表明顆粒劑穩(wěn)定性良好。

2.5 長期試驗結果 將改良清肺顆粒放置室溫貯存12個月，于每個月同一時間取樣檢測，外觀觀察顏色無明顯變化，顏色為棕黃色味苦，水分含量、粒度、溶化性、含量均未發(fā)生明顯變化，各項指標均符合規(guī)定，表明顆粒劑穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 改良清肺顆粒的含量測定 中草藥顆粒劑為中草藥湯劑基礎上發(fā)展起來的常用中草藥劑型，其優(yōu)點是便于攜帶、運輸、貯藏（郭靜，2020）。中草藥提取物的成分復雜，大多數(shù)為親水成分，因此穩(wěn)定性研究是顆粒劑研發(fā)與生產(chǎn)中的關鍵部分（曾春姣，2019）。中草藥顆粒劑如果貯藏不當會發(fā)生吸潮、沉淀、變質等現(xiàn)象，對藥物的有效成分及含量造成影響，導致藥物極易失效，從而產(chǎn)生毒副作用影響臨床應用效果（謝平，2020）。中草藥顆粒劑質量可控是中草藥制劑研究的根本要求，但通常存在藥物不穩(wěn)定性的問題，這也是限制中草藥制劑發(fā)展的主要原因之一（郎吉瑞，2020）。本試驗根據(jù) “獸用中藥、天然藥物制劑研究技術指導原則”對改良清肺顆粒的有效含量進行研究，改良清肺顆粒為中成藥，由板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗5味藥組成，葶藶子為清肺處方藥劑中的“君藥”，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷為葶藶子提取物中主要有效成分之一，含量高，具有專屬性。為保證改良清肺顆粒藥物穩(wěn)定性，本試驗選取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量進行檢測 （劉冬菊，2020；李玉平，2012）。

3.2 環(huán)境對改良清肺顆粒穩(wěn)定性的影響 影響因素試驗能夠檢測出對顆粒劑藥物穩(wěn)定性影響的環(huán)境條件，使藥物能夠更合理的貯存及包裝。萬壽菊顆粒穩(wěn)定性研究結果表明在儲存中應避免高溫、光照、堿、酸（楊云裳，2009）。本研究選取光照、高溫、高濕三種因素進行顆粒劑穩(wěn)定性考察 （李玥，2019）。結果表明，高濕是影響改良清肺顆粒的重要因素，將改良清肺顆粒放置在濕度75%的環(huán)境下，放置5 d和10 d后，經(jīng)檢查水分含量均超過了8%，粒度超過了15%，可見濕度對顆粒的穩(wěn)定性影響較大，因此改良清肺顆粒適宜在低濕度環(huán)境中保存（周曉霞，2011）。

3.3 時間對改良清肺顆粒穩(wěn)定性的影響 為研究改良清肺顆粒的長期貯存的穩(wěn)定性及適宜保存期，對改良清肺顆粒進行加速試驗和長期試驗（周曉霞，2011）。在為期6個月的加速試驗中，外觀顏色始終為棕黃色，顆粒流動性良好，經(jīng)檢測水分含量、粒度、溶化性均符合2015版《中國藥典》顆粒劑項標準，改良清肺顆粒中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量未發(fā)生明顯變化，表明改良清肺顆粒的穩(wěn)定性良好。在為期12個月的長期試驗中，每間隔一個月進行檢測，顆粒劑的流動性相比較好，未發(fā)現(xiàn)顆粒劑有凝結粘連現(xiàn)象，水分含量未發(fā)生明顯增加，粒度、溶化性良好，顆粒劑中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量未發(fā)生明顯變化 （杜宇，2019）。因此，貯存時間對改良清肺顆粒穩(wěn)定性影響較?。▌V義，2019）。

4 結論

改良清肺顆粒是顏色為棕黃色，經(jīng)口味苦的固體顆粒劑，顆粒劑中藥物含量穩(wěn)定，水分含量、粒度、溶化性均符合2015版《中國藥典》，室溫貯存12個月未見明顯變化，但在貯存過程中應注意避免高濕對改良清肺顆粒穩(wěn)定性的影響。