張品正， 梁 娜， 常銘杰， 王旭瑩， 李金澤， 王亞寧， 孫凡麗，陳紫蕓， 尚 璇， 郭志義，*

(1)華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 唐山 063200；2)河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 唐山 063200；3)華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系，唐山 063200)

真核基因表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)的核心問(wèn)題，基因表達(dá)模式的改變是機(jī)體發(fā)育、疾病發(fā)生的根本原因。在前列腺癌發(fā)病進(jìn)程中，涉及到多種基因的調(diào)控，是一個(gè)較好的基因表達(dá)調(diào)控的研究模型。在前列腺癌的研究中，雄激素受體(androgen receptor，AR)是報(bào)道最多的靶基因[1-2]。在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，AR作為最重要的主效基因而得到廣泛研究；而且依據(jù)AR表達(dá)模式的不同，前列腺癌可以劃分為兩種截然不同的發(fā)展階段。在發(fā)病早期，通過(guò)降低患者體內(nèi)雄激素水平可以有效地抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)雄激素剝脫治療，前列腺癌會(huì)演變?yōu)椴皇苄奂に厥荏w調(diào)節(jié)的前列腺癌，稱之為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistance prostate cancer, CRPC)[3]。這其中的基因表達(dá)模式的改變以及機(jī)制尚不清楚。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Studies，GWAS)研究表明，位于染色體8q24區(qū)域的SNP位點(diǎn)rs6983267與前列腺癌高度相關(guān)[4、5]。該位點(diǎn)可轉(zhuǎn)錄出一段長(zhǎng)鏈非編碼RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(colon cancer associated transcript 2， CCAT2)，該RNA分子首先在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)，并表明與直結(jié)腸癌細(xì)胞系的染色體不穩(wěn)定性以及增殖相關(guān)[6]。研究表明，CCAT2在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，這從生物學(xué)角度給出了GWAS結(jié)果的一種解釋。有研究表明G型的CCAT2在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，可能與前列腺癌轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)[7]。

作為前列腺癌的經(jīng)典主效基因AR與新近(2013年)基于大數(shù)據(jù)的GWAS發(fā)現(xiàn)非編碼CCAT2基因是否存在關(guān)聯(lián)？二者的基因表達(dá)調(diào)控模式如何？這是一個(gè)非常有趣的科學(xué)問(wèn)題。作為經(jīng)典的前列腺癌研究模型——雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和雄激素非依賴型去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系DU145為研究模型，分別表現(xiàn)為AR基因表達(dá)的高低。本研究應(yīng)用該研究模型，采用過(guò)表達(dá)和敲低遺傳學(xué)策略，研究彼此影響的調(diào)控關(guān)系。研究的結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄水平二者間存在在一個(gè)相互調(diào)控的關(guān)系，這個(gè)相互調(diào)控與前列腺癌的不同階段相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞系DU145和LNCaP由本實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海生工有限公司合成；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine? 3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；針對(duì)CCAT2的siRNA (5′GUGCAACUCUGCAAUUU AAUU3′)購(gòu)自上海吉瑪基因公司；DH5α大腸桿菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；RT-PCR試劑盒(RR037A)為大連寶生物公司產(chǎn)品；AR基因的shRNA(TRCN0000314657)購(gòu)自SIGMA公司。報(bào)告基因(E1910) 購(gòu)自普洛麥格公司。CCK8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒(MF128-1)購(gòu)自聚合美公司。AR抗體(WL00223)購(gòu)自萬(wàn)類生物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

DU145細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞用含有10%血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)基，在含有5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度為60%～70%，轉(zhuǎn)染前1 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)Lip3000說(shuō)明書確定質(zhì)?；蛘遱iRNA的加入量。轉(zhuǎn)染方法依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染4 h后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，24 h后提取RNA或者進(jìn)行報(bào)告基因分析。

1.3 RNA提取和qPCR

采用Trizol法提取RNA，并用RQ-DNAse對(duì)RNA消化處理，對(duì)樣本進(jìn)行RT-PCR。采用賽默飛Quantstudio 6熒光PCR儀進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析(相關(guān)引物見Table 1)。

1.4 報(bào)告基因分析

將細(xì)胞用裂解液裂解，取20 μL裂解液加入100 μL ARII報(bào)告基因試劑，測(cè)得熒光值L，繼續(xù)加入Stop&Glo試劑，檢測(cè)熒光值R。L/R的比值為最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 基因載體構(gòu)建

以DU145細(xì)胞基因組DNA為模板，采用高保真酶擴(kuò)增AR基因啟動(dòng)子序列(-2 334 ～ +719)，引物序列如下，上游引物CCCCTCGAGACTTACTCTCAACCTGACTAATCTG：下游引物CCCAAGCTTTTTGGCTACTGAAGACCTGACT。應(yīng)用XhoⅠ和Hind Ⅲ多克隆酶切位點(diǎn)克隆到pGL3-Basic載體中，命名為pGL3-Basic-AR。AR編碼序列應(yīng)用XhoⅠ和Hind Ⅲ多克隆酶切位點(diǎn)克隆到pcDNA6載體中，引物序列如下，上游引物CATGGTACCATGGTGAGCAAGG GCGAGGA：下游引物CTGCAGAACCACCACACTGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC。CCAT2基因序列以DU145細(xì)胞基因組為模板應(yīng)用EcoRⅠ多克隆位點(diǎn)克隆到pcDNA3.1載體中，引物序列如下，上游引物GAATTCCCGAGGTGATCAGGTGGACTTTC:下游引物GAATTCGTCTTCTGGGCTGATGTTGC，分別命名為pcDNA3.1-GS、pcDNA3.1-TS。

1.6 Western印跡檢測(cè)

收集細(xì)胞，冰PBS洗滌細(xì)胞3遍,加入裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解細(xì)胞30 min。懸液用12 000 r/min離心20 min, 取上清液。使用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，用裂解液將各組蛋白質(zhì)調(diào)整至相同濃度,加入5×上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。加入變性后的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳(10%分離膠)分離，濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上。PBS配置的5%(體積分?jǐn)?shù))牛奶室溫封閉1 h。一抗經(jīng)一抗稀釋液稀釋,體積比為1 : 1 000，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST漂洗3次,每次5 min。羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次10 min。配置ECL化學(xué)發(fā)光試劑，混勻后滴在PVDF膜上，使用曝光系統(tǒng)拍照。采用Image J軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞活性CCK8(Cell Counting Kit-8)分析

將200 ng質(zhì)粒、50 pmol siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后加入10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm吸光度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)滿足方差齊性和正態(tài)性分布時(shí)，用t檢驗(yàn)和方差分析，當(dāng)不滿足方差齊性和正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)檢。檢效水準(zhǔn)α為0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雄激素非依賴型細(xì)胞DU145和雄激素依賴型細(xì)胞LNCaP中AR與CCAT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異

在DU145和LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CCAT2的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、siRNA以及AR基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(雄激素非依賴型細(xì)胞DU145中)和shRNA(雄激素依賴型細(xì)胞LNCaP中)，應(yīng)用qPCR方法檢測(cè)相關(guān)RNA表達(dá)。結(jié)果顯示，在DU145細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AR后，CCAT2表達(dá)量上升2.9倍(Fig.1A)。在LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針對(duì)AR的shRNA后，AR表達(dá)下降至原來(lái)的0.48，說(shuō)明shRNA有效。結(jié)果顯示，敲低AR后CCAT2的表達(dá)下降(Fig.1B)。在2種細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染G型CCAT2分子(pcDNA3.1-GS)，AR的mRNA表達(dá)量分別上升2.6倍和1.5倍(Fig.1C,D)；過(guò)表達(dá)T型CCAT2基因(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TS)，DU145細(xì)胞中AR的mRNA表達(dá)量下降至原來(lái)的0.23(Fig.1C)；LNCaP細(xì)胞中AR的mRNA水平變化不顯著(Fig.1D)。沉默CCAT2，DU145細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞中AR的mRNA水平下降(Fig.1E,F)。

2.2 啟動(dòng)子相對(duì)活性與相關(guān)靶基因表達(dá)差異

將AR啟動(dòng)子片段(-2334～+719)驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因(pGL3-Basic-AR)質(zhì)粒分別與GT型CCAT2(pcDNA3.1-GS/pcDNA3.1-TS)共同轉(zhuǎn)入DU145與LNCaP細(xì)胞中。報(bào)告基因結(jié)果顯示，DU145細(xì)胞中G型CCAT2激活A(yù)R的轉(zhuǎn)錄活性(5.4倍)，U型CCAT2抑制AR轉(zhuǎn)錄活性(0.45)(Fig.2A)。LNCaP細(xì)胞中G型CCAT2激活A(yù)R的轉(zhuǎn)錄活性，U型CCAT2無(wú)明顯激活作用(Fig.2B)。在DU145細(xì)胞中，G-CCAT2激活MYC(5倍)、CTNNB1(2.93倍)以及TCF7L2(2.01倍)。LNCaP細(xì)胞中的變化率接近1(Fig. 2C)。在雄激素非依賴型的DU145中過(guò)表達(dá)AR，則激活MYC(1.43倍)，CTNNB1(1.45倍)，TCF7L2不明顯(0.95)。在LNCaP敲低AR后，相關(guān)靶基因mRNA水平的變化率分別為：MYC(0.4)，CTNNB1(1.44倍)，TCF7L2(2.1倍)，說(shuō)明在LNCaP細(xì)胞中AR激活MYC，抑制CTNNB1與TCF7L2 (Fig.2D)。

2.3 G-CCAT2促進(jìn)AR蛋白表達(dá)與細(xì)胞活性水平

本文在2種細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)CCAT2質(zhì)粒,應(yīng)用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞活性的變化。結(jié)果表明，LNCaP細(xì)胞中G-CCAT2促進(jìn)細(xì)胞活性。DU145細(xì)胞中G-CCAT2促進(jìn)細(xì)胞活性1.5倍，T-CCAT2抑制細(xì)胞活性。在CCAT2對(duì)AR蛋白的表達(dá)影響方面，G-CCAT2在LNCaP細(xì)胞中激活A(yù)R的表達(dá)(Fig.3)。

Fig.3 Effects of CCAT2 on protein levels of AR and cells viability The expression plasmids and siRNA of CCAT2 were transfected into prostate cancer cells (LNCaP and DU145). (A-B) Western blotting was used for AR protein level detection under over-expression or knock-down (si-CCAT2) of CCAT2 . The GAPDH was used as a loading control .The protein levels were normalized to GAPDH levels(B). (C)Androgen-dependent prostate cancer cells LNCaP cells were pre-treated with over expression or knock-down for 24 hours. The cell viability was measured by CCK8 assay. (D) DU145 cells were pre-treated with over expression or knock-down of CCAT2 for 24 hours. The cell viability was measured by CCK8 assay. The data were presented as the means ± SD. The statistical differences were analyzed with Student’s t-test or ANOVA. *P < 0.05

3 討論

基因表達(dá)調(diào)控是生命的特征之一，疾病的發(fā)生一般都伴有相關(guān)基因表達(dá)模式的改變。本研究中，在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了前列腺癌經(jīng)典主效基因——雄激素受體(androgen receptor，AR)與基于全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)大數(shù)據(jù)而發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼基因結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(colon cancer associated transcript 2， CCAT2)存在相互調(diào)控。

雄激素受體(androgen receptor，AR)為類固醇受體，屬于類型I，可以與雄激素結(jié)合。AR是正常的前列腺發(fā)育以及前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子[1-3]。據(jù)報(bào)道AR在前列腺癌生長(zhǎng)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，且不同的AR抑制劑可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡或者老化[8]，說(shuō)明AR對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的控制是多方面的。抑癌基因TP53抑制AR的表達(dá)[9]。AR與細(xì)胞周期抑制因子P21以及相關(guān)細(xì)胞通路例如MAPK都關(guān)系密切[10-11]。有報(bào)道AR協(xié)同翻譯起始因子eIF5A2誘發(fā)前列腺癌的轉(zhuǎn)移，與腫瘤的惡性程度相關(guān)；而敲低eIF5A2會(huì)逆轉(zhuǎn)此過(guò)程[12]。近年的研究表明，AR的增生與突變(例如V7突變)在激素非依賴的前列腺癌發(fā)生發(fā)展也發(fā)揮著重要作用[13、14]。

基于大數(shù)據(jù)分析的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)顯示，染色體8q24區(qū)域內(nèi)的SNP位點(diǎn)rs6983267與包括前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤相關(guān)，其中尤其與前列腺癌發(fā)生的相關(guān)性最高[15]。由于此SNP位點(diǎn)所在區(qū)域?yàn)榛蛏衬畢^(qū)，因此，此SNP位點(diǎn)被認(rèn)為可以作為增強(qiáng)子(enhancer)激活下游癌基因MYC的轉(zhuǎn)錄[16]，并認(rèn)為可能是直結(jié)腸癌發(fā)生的原因之一；另有研究表明，包含此SNP位點(diǎn)的基因組轉(zhuǎn)錄出一段長(zhǎng)鏈非編碼RNA，因?yàn)槭紫仍诮Y(jié)腸癌中被研究，因此命名為CCAT2(colon cancer associated transcript 2)[6]，與直結(jié)腸癌的染色體不穩(wěn)定性等相關(guān)。CCAT2大多集中于結(jié)腸癌的研究，可能與最先在直結(jié)腸癌的發(fā)現(xiàn)有關(guān)[6]，例如結(jié)腸癌的染色體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤的發(fā)生、能量代謝和轉(zhuǎn)移活性等相關(guān)，基因涉及到MYC，mir145等的表達(dá)[17-18]。然而，依據(jù)GWAS的結(jié)果，與此SNP(rs6983267)相關(guān)度最高的是前列腺癌(結(jié)腸癌排在第二位)。目前，也有一些零星的CCAT2與前列腺癌的報(bào)道，但與前列腺癌經(jīng)典的主效基因AR的研究尚無(wú)報(bào)道。AR與一些其他經(jīng)典的癌基因都有報(bào)道，例如MYC,CTNNB1和microRNA等[19-21]。由此可見，作為前列腺癌發(fā)生的經(jīng)典主效基因，AR的研究以及與其他癌基因的相關(guān)性研究是廣泛的。依據(jù)AR以及對(duì)雄激素反應(yīng)的不同，前列腺癌可以分為兩個(gè)不同階段。雄激素剝奪療法( androgen deprivation therapy,ADT)是前期控制疾病發(fā)展的重要治療手段，其發(fā)現(xiàn)與使用是前列腺癌治療的一個(gè)里程碑事件。通過(guò)控制雄激素來(lái)抑制AR信號(hào)的活性，可以有效地控制前列腺癌的發(fā)展[22]。通過(guò)激素剝奪治療，前列腺癌一般會(huì)發(fā)展為不受雄激素調(diào)控的去勢(shì)抵抗性前列腺癌( castration resistant prostate cancer,CRPC)，惡性程度更高、難以治愈，生存期僅有14～30個(gè)月。DU145細(xì)胞系被認(rèn)為是處在早期的CRPC，其AR蛋白水平低；而LNCaP細(xì)胞系A(chǔ)R水平相對(duì)較高，為前列腺癌發(fā)病早期的經(jīng)典模型。AR與CCAT2之間是否存在調(diào)控關(guān)系？二者的調(diào)控關(guān)系是否在不同的前列腺癌發(fā)生發(fā)展中有不同的表現(xiàn)，并在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用？

GWAS的結(jié)果表明，SNP位點(diǎn)rs6983267的G為危險(xiǎn)因子，而T為保護(hù)因子。在直結(jié)腸癌研究中CCAT2的結(jié)果也與GWAS一致，作為非編碼RNA，有學(xué)者推測(cè)可能由于其結(jié)構(gòu)的差異[6]。本文分別克隆了全長(zhǎng)CCAT2的G型與T型基因，將CCAT2表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入經(jīng)典前列腺癌研究模型LNCaP(雄激素依賴型，AR表達(dá))和DU145細(xì)胞(雄激素非依賴型，AR低表達(dá))中，檢測(cè)AR基因mRNA的變化，結(jié)果表明，G型CCAT2可以激活A(yù)R的表達(dá)(Fig. 1C,D)，對(duì)比雄激素依賴型與非依賴型的前列腺癌細(xì)胞系的結(jié)果顯示，在DU145細(xì)胞(雄激素非依賴型)中G型CCAT2具有更強(qiáng)的激活作用(Fig.1C)，表明危險(xiǎn)因子G可能通過(guò)非編碼基因CCAT2激活A(yù)R的表達(dá)發(fā)揮作用，這個(gè)作用在前列腺癌的激素依賴型與非依賴型都存在，符合GWAS中G是危險(xiǎn)因子的結(jié)果。直結(jié)腸癌中，G型CCAT2與染色體的不穩(wěn)定相關(guān)[6]，提示CCAT2在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用可能是組織特異性的。體外的啟動(dòng)子相對(duì)活性分析也表明，G-CCAT2激活A(yù)R的啟動(dòng)子活性(Fig.2A,C)。在相對(duì)惡性的雄激素非依賴型DU145細(xì)胞系中，U-CCAT2分子(即T-CCAT2的轉(zhuǎn)錄本)會(huì)抑制AR的表達(dá)(Fig.1C)，而在雄激素依賴型的細(xì)胞系LNCaP中，U-CCAT2的作用不明顯，說(shuō)明T的保護(hù)作用可能在惡性的激素非依賴型前列腺癌中更為明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道，CCAT2在前列腺癌的轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮作用[7]，提示CCAT2的作用可能與前列腺癌的不同發(fā)展時(shí)期相關(guān)。CCAT2對(duì)AR蛋白質(zhì)水平的變化基本上與RNA水平變化是一致的(Fig.3A,B)。

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，有研究表明，癌基因MYC與lncRNA形成互相調(diào)控的環(huán)網(wǎng)(loop)[13]，在正常生理?xiàng)l件以及在腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期發(fā)揮作用；AR與CTNNB1形成一個(gè)平衡環(huán)網(wǎng)，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。在初步研究了新癌基因CCAT2對(duì)經(jīng)典癌基因AR的影響，接著本文研究AR對(duì)CCAT2的調(diào)控，探討二者是否也存在相互調(diào)控。本文在AR高表達(dá)的LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)入shRNA來(lái)沉默AR(Fig. 1B)，在DU145過(guò)表達(dá)AR(Fig.1A)，結(jié)果表明，AR激活CCAT2的轉(zhuǎn)錄(Fig.1A,B)；說(shuō)明在CCAT2調(diào)控AR的同時(shí)，AR也對(duì)CCAT2的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，提示二者存在相互調(diào)控。

根據(jù)本文的研究結(jié)果，初步認(rèn)為AR與CCAT2基因在轉(zhuǎn)錄水平存在相互調(diào)控，在前列腺癌的發(fā)展例如CRPC的進(jìn)程可能發(fā)揮作用，由于二者在前列腺癌的重要地位，探討二者的關(guān)系以及基因調(diào)控的機(jī)制是重要的，不但可以作為分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的研究模型也會(huì)對(duì)前列腺癌的防治提供線索。作為經(jīng)典的前列腺癌主效基因AR與基于大數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)的CCAT2基因，二者的相關(guān)性理應(yīng)成為研究的內(nèi)容之一，其他例如MicroRNA與AR的相關(guān)性研究就有深入的報(bào)道[23-24]；然而，目前尚未見到AR與CCAT2的相關(guān)性研究報(bào)道，本文認(rèn)為可能有如下的原因。首先，CCAT2畢竟是新發(fā)現(xiàn)的RNA基因，在傳統(tǒng)以醫(yī)學(xué)的功能性為研究目標(biāo)中并未成為研究的重點(diǎn)；同時(shí)，CCAT2的表達(dá)量很低，甚至于某些學(xué)者并未能在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)[25]；同時(shí)其啟動(dòng)子為聚合酶Ⅲ型而不是常見的聚合酶Ⅱ型[6,26]等存在一些研究上的現(xiàn)實(shí)困難；最后本文認(rèn)為，目前的研究大多是基于功能學(xué)的研究，即著眼于分子生物學(xué)理論與技術(shù)的應(yīng)用，并不著重于分子生物學(xué)的基礎(chǔ)例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控的專門研究。目前，CCAT2的研究也正在得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)可，盡管仍無(wú)TCGA的新數(shù)據(jù)，但在NCBI，GeneCards等都已經(jīng)有了相關(guān)的詞條，其與經(jīng)典AR基因的相關(guān)性研究也會(huì)逐漸進(jìn)入研究者的視線。課題組對(duì)其啟動(dòng)子[26]以及多態(tài)性的檢測(cè)技術(shù)[27-28]都做了一定的初步探討，對(duì)二者在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的研究不但可以作為分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究的一個(gè)良好模型，也會(huì)對(duì)前列腺癌的防治提供一定的數(shù)據(jù)與提示。

在發(fā)現(xiàn)二者的相關(guān)性后，由于CCAT2研究數(shù)據(jù)的缺乏，本文也在功能學(xué)上進(jìn)行了必要的補(bǔ)充性研究，例如細(xì)胞活性的研究(Figure3-C、D)，數(shù)據(jù)表明與AR的相關(guān)性是一致的。在CCAT2對(duì)AR蛋白水平的研究上略有出入,例如在DU145細(xì)胞中G-CCAT2對(duì)AR蛋白的激活作用不明顯(Figure3-A、B)，這可能與翻譯表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，包括具有一定的時(shí)間延后以及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的機(jī)制存在有關(guān)；同時(shí)，DU145作為雄激素非依賴型細(xì)胞系，AR表達(dá)極低以及可能存在不同的表位，這些都可能是CCAT2對(duì)AR蛋白水平的調(diào)控未能表現(xiàn)為如同RNA水平變化的原因。因此，AR與CCAT2的調(diào)控是相對(duì)復(fù)雜的，可能有多種因子的參與，還包括表觀遺傳修飾以及染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變等，有待于進(jìn)一步的深入研究。研究表明，CTNNB1與MYC在前列腺癌中發(fā)揮重要作用，也與AR和CCAT2有關(guān)。例如AR與MYC共存在，與β-聯(lián)蛋白(β-Catenin)相互作用等[19,29]；CCAT2與Wnt信號(hào)途徑與MYC也存在互相調(diào)控[6]。本文的結(jié)果顯示，AR會(huì)促進(jìn)MYC的表達(dá)(Figure 2-D)，在DU145細(xì)胞系中G-CCAT2激活MYC(5倍)，說(shuō)明在相對(duì)惡性程度高的前列腺癌中，AR與CCAT2的互相調(diào)節(jié)可能造成了癌基因MYC的表達(dá)[19,29]，引發(fā)進(jìn)一步疾病的發(fā)展。在DU145細(xì)胞中G-CCAT2也促進(jìn)了Wnt途徑CTNNB1與TCF7L2的表達(dá)；而雄激素依賴型的LNCaP則變化不明顯(Figure 2-B)。因此，AR與CCAT2的調(diào)控可能涉及到的因子超過(guò)了Wnt途徑以及MYC基因的范圍，而且，本文的研究也只局限在這些相關(guān)基因的mRNA水平，其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究?；虮磉_(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，各種因果關(guān)系均存在。AR的調(diào)控還可能有其他通路或者涉及到翻譯的調(diào)控，共同形成這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡。前列腺癌的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，除了AR、PSA等外還有例如TP53等的突變，也是經(jīng)典前列腺癌細(xì)胞系的特征之一。作為2個(gè)經(jīng)典的前列腺癌研究模型，二者在基因表達(dá)譜上是有差異的，例如雄激素依賴型LNCaP細(xì)胞中，抑癌基因TP53為野生型，而在雄激素非依賴型的DU145細(xì)胞系中，TP53為雙突變型[30-31]。是否有P53或其他因子的作用，有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，研究初步揭示了前列腺癌中AR與CCAT2之間存在相互調(diào)控作用(cross-talk)。在代表2種不同前列腺癌發(fā)展的經(jīng)典細(xì)胞模型中，二者的調(diào)控作用機(jī)制不同，提示CCAT2與AR的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變可能是前列腺癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究為GWAS的生物學(xué)解釋，前列腺癌的治療以及真核基因的表達(dá)與調(diào)控提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。盡管本文揭示了2個(gè)重要因子的調(diào)控關(guān)系以及可能在前列腺癌發(fā)展中的作用，但我們的研究仍是初步的，不但局限于轉(zhuǎn)錄水平而且局限于細(xì)胞研究模型，有待于未來(lái)進(jìn)一步的深入研究。