徐仁鳳， 王正朝， 張正紅

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)動(dòng)與健康福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部光電醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福州 350007)

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)已成為全球不可忽視的一種慢性炎癥性疾病。慢性腎病在其初期無(wú)明顯臨床癥狀，不易被診斷；當(dāng)被診斷時(shí)，病人通常已處于腎病晚期。大量數(shù)據(jù)表明，腎纖維化是驅(qū)動(dòng)慢性腎病步向終末期腎功能衰竭的共同途徑和關(guān)鍵性病理特征[1]。腎纖維化的許多病理學(xué)原理與其他纖維化疾病相同，例如肝硬化、心肌病和肺纖維化。據(jù)估計(jì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家，因纖維性疾病而死亡的人數(shù)總計(jì)占死亡人數(shù)的1/2[2]。如果能夠減輕甚至逆轉(zhuǎn)腎纖維化的過(guò)程，就能改善慢性腎病患者的預(yù)后。目前的研究表明，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box transcription factor，F(xiàn)ox)家族O亞族1(FoxO1)與腎纖維化密切相關(guān)，可以抑制肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MF)激活與隨后細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的產(chǎn)生[3-5]。

由此可見(jiàn)，目前的研究已經(jīng)明確了FoxO1在腎纖維化中的作用及其可能的調(diào)控機(jī)制。有關(guān)FoxO1的深入研究將是腎纖維化發(fā)生機(jī)制研究的新切入點(diǎn)和新思路，將為慢性腎病的治療帶來(lái)一個(gè)新的前景。

1 叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1

Fox是一個(gè)蛋白質(zhì)超家族，該家族目前已發(fā)現(xiàn)100多個(gè)成員。其中，F(xiàn)oxO是Fox蛋白質(zhì)家族中的1個(gè)亞族，在哺乳動(dòng)物中由4個(gè)成員組成，即FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，它們共享一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即叉頭結(jié)合域[6]。而FoxO1是FoxO家族中最具代表性的成員，由FKHR基因編碼，包含4個(gè)功能域，分別是核定位信號(hào)域(nuclear localization signal domain，NLS)、N-端的核輸出信號(hào)域(nuclear export signal domain，NES)、轉(zhuǎn)錄激活域(transactivation domain，TA)和叉頭DNA結(jié)合域(forkhead domain，F(xiàn)KH)[7]。其中，F(xiàn)KH是最重要的功能域。在該結(jié)構(gòu)域及其附近，存在3個(gè)高度保守的PI-3K/Akt磷酸化位點(diǎn)，分別為T(mén)hr24、Ser256與Ser3193。

FoxO1作為人體最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在多種細(xì)胞類(lèi)型中廣泛表達(dá)，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，在細(xì)胞增殖、自噬、萎縮、凋亡、代謝、以及炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種病理生理過(guò)程中響應(yīng)細(xì)胞刺激并維持穩(wěn)態(tài)，充分發(fā)揮了其作用[7-11]。在子宮內(nèi)膜中，F(xiàn)oxO1已被證明能在保護(hù)懷孕母體妊娠期免受氧化損傷中發(fā)揮重要作用[12]，同時(shí)也參與月經(jīng)周期和早孕期間子宮內(nèi)膜的有效重塑[13]；抗糖尿病藥物AM251通過(guò)抑制FoxO1來(lái)降低PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)和G6酶(glucose 6-phosphatase，葡萄糖6磷酸酶)表達(dá)，控制肝中的血糖水平[14]；FoxO1激活劑姜黃素能通過(guò)上調(diào)p27和p21并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)來(lái)減少肺癌的增殖[15]。由于其廣泛且復(fù)雜的內(nèi)源性表達(dá)和功能，F(xiàn)oxO1可能是預(yù)防和治療疾病的重要靶點(diǎn)。

2 叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1的功能調(diào)控

FoxO1的功能依賴于調(diào)控其下游靶基因，包括凋亡和自噬相關(guān)基因、抗氧化應(yīng)激酶、細(xì)胞周期阻滯基因以及生長(zhǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子等[9]。不同靶點(diǎn)的表達(dá)與FoxO1的活性一致，直接或間接地誘導(dǎo)各種生理和病理變化。例如，在正常和病理?xiàng)l件下，F(xiàn)oxO1通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶和MnSOD(manganese superoxide dismutase，錳過(guò)氧化物歧化酶)等特定抗氧化酶的基因表達(dá)介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，這些酶主要是通過(guò)催化ROS(reactive oxygen species，活性氧自由基)的轉(zhuǎn)化來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[16,17]。然而，當(dāng)FoxO1位于細(xì)胞質(zhì)中而不在細(xì)胞核中時(shí)，它會(huì)被隔離，并且不能再控制其下游的靶點(diǎn)。

此外，F(xiàn)oxO1的活性主要受其上游的多種信號(hào)分子和其轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控。位于其上游的信號(hào)分子，包括PI-3K、Akt/PKB(protein kinase B，蛋白激酶B)、JNK(c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)、CBP(CREB-binding protein，CREB結(jié)合蛋白)、MAPK、Sirtuins、泛素E3連接酶和SIRT1(silent information regulator 1，沉默信息調(diào)節(jié)因子1)等，在氧化應(yīng)激和高糖等刺激下，它們會(huì)被激活或抑制，進(jìn)而調(diào)控隨后的轉(zhuǎn)錄后修飾[18]。其轉(zhuǎn)錄后修飾則主要包括磷酸化、泛素化、乙?；?、精氨酸甲基化和O-糖基化等，這些修飾主要是通過(guò)修飾FoxO1和14-3-3蛋白的特定位點(diǎn)，并通過(guò)影響它們的相互作用，以及FoxO1在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間的易位來(lái)調(diào)節(jié)FoxO1的活性[18-20]。磷酸化是FoxO1活性調(diào)控最常見(jiàn)的機(jī)制，而PI-3K/Akt通路磷酸化FoxO1是導(dǎo)致FoxO1失活的典型過(guò)程。高糖條件下，PI-3K/Akt通路被激活，上游激酶PI-3K的磷酸化進(jìn)一步磷酸化Akt，Akt則從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，使FoxO1的3個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化。FoxO1磷酸化促進(jìn)了其與14-3-3的相互作用，導(dǎo)致FoxO1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，并降低了它們的轉(zhuǎn)錄活性，以及在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)蛋白酶體誘導(dǎo)其降解來(lái)抑制FoxO1的活性[21,22]。

3 腎纖維化

腎纖維化(renal fibrosis)是腎在多種病因，例如發(fā)生炎癥反應(yīng)或急性損傷的刺激下自身修復(fù)機(jī)制被激活后修復(fù)過(guò)度的結(jié)果，是腎組織衰老和慢性腎炎的標(biāo)志，其主要特征是MF持續(xù)活化、ECM過(guò)度產(chǎn)生和沉積，即進(jìn)行性實(shí)質(zhì)破壞，進(jìn)而導(dǎo)致組織功能逐漸喪失和瘢痕組織形成，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[23-26](Fig.1)。

Fig.1 Main signaling pathways of regulatory mechanism during the renal fibrosis Renal fibrosis is a synergic process mediated by multiple signaling molecules involving multiple signaling pathways, including TGF-β/Smad, Wnt/β-catenin, PI-3K/Akt and JNK/STAT3, etc. TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin are the two most classical signaling pathways

腎損傷后吸引白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞聚集，導(dǎo)致局部炎癥微環(huán)境形成。在這種環(huán)境中，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生破壞組織的分子，例如活性氧(ROS)，并誘導(dǎo)促纖維細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和 Wnt1[24]。TGF-β和 Wnt1與細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合，并發(fā)起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致靶基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步增強(qiáng)MF分化，以及膠原蛋白質(zhì)和纖維連接蛋白質(zhì)等ECM的產(chǎn)生和分泌。隨著ECM持續(xù)沉積，基體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并變硬，形成纖維化。而在分子水平上，腎纖維化是一個(gè)由多種信號(hào)分子介導(dǎo)的多種信號(hào)通路參與的協(xié)同過(guò)程，包括TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin、PI-3K/Akt、JNK/STAT3和Notch信號(hào)通路等。其中，TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin是最經(jīng)典的2個(gè)信號(hào)通路。

TGF-β/Smad信號(hào)是腎纖維化最主要的驅(qū)動(dòng)因素，在各種腎疾病模型的許多細(xì)胞類(lèi)型中都發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smad信號(hào)通路被激活且TGF-β含量顯著上升[17]。TGF-β是引起纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，主要通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)促進(jìn)腎纖維化：誘導(dǎo)α-SMA(α-smooth muscle actin，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)、III型膠原和纖維連接蛋白質(zhì)等間充質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)，刺激ECM合成；防止ECM降解；介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)歷上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)或腎小管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷內(nèi)皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EndMT)，以及直接誘導(dǎo)其他腎細(xì)胞[27,28]。

在Wnt信號(hào)激活的細(xì)胞中，β-聯(lián)蛋白(β-catenin)在胞漿中不斷積累并最終易位至胞核內(nèi)，成為T(mén)細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)的轉(zhuǎn)錄共激活因子，激活促纖維化基因，例如Snail1和MMP7(matrix metalloproteinase 7，基質(zhì)金屬蛋白酶7)，使它們大量表達(dá)，加速成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[29]。Wnt/β-Catenin信號(hào)參與調(diào)節(jié)腎小球硬化和足細(xì)胞功能障礙。

4 叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1與腎纖維化

Luo等[17]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在多種因素誘導(dǎo)的腎纖維化的開(kāi)始和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可以促進(jìn)足細(xì)胞凋亡、節(jié)段性腎小球硬化和肌成纖維細(xì)胞激活，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)ECM重塑。事實(shí)上，氧化應(yīng)激在許多疾病中的作用都?xì)w因于ROS的積累。在正常人體中低水平的ROS是一直在產(chǎn)生的，而且無(wú)害。但是，許多過(guò)量和強(qiáng)烈的刺激物會(huì)導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)功能障礙和ROS的積累，ROS會(huì)直接損傷蛋白質(zhì)、氨基酸和核酸等分子，從而導(dǎo)致毒性和氧化應(yīng)激，最終會(huì)導(dǎo)致炎癥、纖維化、功能障礙和凋亡[30-32]。

因此，作為已確定的抗氧化因子，F(xiàn)oxO1在腎纖維化的發(fā)展過(guò)程中必定發(fā)揮了重要作用。目前的一些研究也證明了這一點(diǎn)：在糖尿病腎病中，F(xiàn)oxO1/TXNIP-TRX激活的調(diào)節(jié)作用可以通過(guò)抑制細(xì)胞ROS的產(chǎn)生來(lái)保護(hù)高糖誘導(dǎo)的腎近端管細(xì)胞損傷[14]；給藥自由基清除劑TEMPOL，通過(guò)調(diào)節(jié)PI-3K/Akt/FoxO1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)預(yù)防腎損傷[33]。

FoxO1可通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)控腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展，這部分將詳細(xì)介紹FoxO1在腎纖維化中的作用及其調(diào)控(Fig.2)。

Fig.2 Contribution and regulation of FoxO1 during the renal fibrosis The activity of FoxO1 is primarily regulated by post-translational modifications including phosphorylation, acetylation and ubiquitination. FoxO1 is involved in the pathogenesis of renal fibrosis through multiple signaling pathways, including PI-3K/Akt, SIRT1, STAT, and Wnt/β-catenin signaling pathways

4.1 FoxO1/STAT信號(hào)調(diào)節(jié)TIF和腎小管凋亡

在動(dòng)物模型中，STAT1的激活與腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)和EMT密切相關(guān)[34]；而在高糖條件下，F(xiàn)oxO1的再表達(dá)降低了系膜細(xì)胞STAT1的表達(dá)[35]。此外，沉默STAT1還能逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，與位于細(xì)胞核中的FoxO1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)[36]。Huang等[37]通過(guò)小鼠腎特異性過(guò)表達(dá)Pax2-FoxO1模型發(fā)現(xiàn)，腎特異性過(guò)表達(dá)Pax2-FoxO1使導(dǎo)致糖尿病小鼠腎功能損害的p-STAT1的表達(dá)顯著降低，從而延緩腎的TIF和凋亡；同時(shí)，在HK-2細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1-KD促進(jìn)p-STAT1的表達(dá)，導(dǎo)致EMT和固有凋亡通路的激活。相反，在高糖條件下，F(xiàn)oxO1-KD明顯減弱HK-2細(xì)胞的EMT和凋亡。綜上所述，F(xiàn)oxO1對(duì)腎內(nèi)TIF和凋亡的保護(hù)作用可能靶向STAT1信號(hào)，這是糖尿病腎病長(zhǎng)期治療的一個(gè)新策略。

4.2 SIRT1/FoxO1信號(hào)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂肪毒性

沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (silent information regulator 1，SIRT1)/FoxO1是機(jī)體調(diào)控氧化應(yīng)激的主要信號(hào)通路。SIRT1作為FoxO1上游分子，激活后通過(guò)抑制FoxO1磷酸化和乙酰化，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)[38]。SIRT1 /FoxO1信號(hào)活化上調(diào)機(jī)體SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)含量，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善缺血再灌注引發(fā)的骨骼肌損傷和線粒體功能障礙，并減輕嚴(yán)重?zé)齻笫蠹毙阅I損傷以及衰老導(dǎo)致的腎足細(xì)胞功能障礙[15,39]。Meng等[40]研究表明，SIRT1可通過(guò)去乙酰化激活FoxO1,減輕H2O2所致的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制成骨細(xì)胞凋亡。Yang等[41]研究發(fā)現(xiàn)，TMZ通過(guò)FoxO1去乙?；瑴p輕SIRT1依賴型途徑中的氧化應(yīng)激，從而抑制高糖對(duì)EMT的誘導(dǎo)作用。此外，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物異常觸發(fā)細(xì)胞功能障礙，稱(chēng)為脂肪毒性。SIRT1丟失與PPARα(perixisome proliferation-activated receptor alpha，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α)減少引起的脂質(zhì)代謝異常有關(guān)[41]。一些臨床和動(dòng)物研究表明，脂肪毒性會(huì)誘導(dǎo)腎疾病的發(fā)生和進(jìn)展，包括糖尿病腎病[42-43]；FoxO1亦可提高SIRT1的表達(dá)水平[44]。因此，可以通過(guò)SIRT1/FoxO1信號(hào)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂肪毒性來(lái)調(diào)節(jié)腎纖維化。

4.3 FoxO1/β-Catenin抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路

在腎纖維化中，骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞通過(guò)TGF-β誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變(MMT)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[1]。激活Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路引起足細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而引起毛細(xì)血管壁塌陷以及 ECM沉積，最終導(dǎo)致腎小球硬化[45]。TCF和FoxO1是與β-聯(lián)蛋白相互競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的2個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)，導(dǎo)致TGF-β對(duì)靶細(xì)胞的作用不同，甚至相反[20]。當(dāng)β-聯(lián)蛋白與TCF結(jié)合后會(huì)激活許多靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)和纖維連接蛋白質(zhì)等，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致ECM不斷沉積，加重腎損傷；而當(dāng)β-聯(lián)蛋白與FoxO1結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，促使細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下存活。小分子抑制劑ICG-001可以阻止β-Catenin/TCF相互作用，將β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)移到與FoxO1結(jié)合，從而減少β-Catenin/TCF介導(dǎo)的促纖維作用，同時(shí)增強(qiáng)FoxO1對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用，從而增強(qiáng)TGF-β的抗炎作用[23]。因此，促進(jìn)β-Catenin/Foxo1結(jié)合將抑制β-Catenin/TCF的相互作用，從而阻止TGF-β的促纖維化作用，增加自身的抗炎功能。此外，β-Catenin/Foxo1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的促纖維化蛋白質(zhì)表達(dá)也有抑制作用[23]。

4.4 PI-3K/Akt/FoxO1通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及糖脂代謝

PI-3K/Akt信號(hào)通路主要通過(guò)Akt下游蛋白質(zhì)調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達(dá)(例如mTOR、GSK-3β、eNOS和FoxO1等)來(lái)調(diào)控炎癥反應(yīng)[46]。PI-3K/Akt/FoxO1信號(hào)分子活化后，通過(guò)激活CREB(cAMP-response-element-binding protein，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)、NF-κB p65和AP-1(activator protein-1，激活蛋白-1)等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響促炎、抗炎反應(yīng)平衡和免疫應(yīng)答，最終影響休克、膿毒癥和缺血再灌注損傷等炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展[47]。因此，可以通過(guò)抑制PI-3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減緩炎癥反應(yīng)和纖維化的程度。此外，胰島素是調(diào)控機(jī)體內(nèi)部糖脂代謝的重要激素，而PI-3K/Akt信號(hào)通路是胰島素傳導(dǎo)的主要通路。FoxO1是其下游轉(zhuǎn)錄因子，受胰島素信號(hào)負(fù)調(diào)控[20]。因此，F(xiàn)oxO1可以通過(guò)PI-3K/Akt信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)自噬因子和糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)脂肪和葡萄糖的代謝[9]，從而在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用。最新研究表明，在未對(duì)側(cè)腎切除術(shù)的單側(cè)缺血再灌注損傷的小鼠模型中，Akt1的缺失導(dǎo)致腎纖維化和腎小管去分化減弱，這個(gè)現(xiàn)象獨(dú)立于 TGF-β1/Smad 信號(hào)，反而與糖原合成酶激酶-3β、Snail和β-聯(lián)蛋白途徑有關(guān)[48]，表明FoxO1可能在這一過(guò)程中發(fā)揮了作用。

5 問(wèn)題與展望

綜上所述，F(xiàn)oxO1與腎纖維化密切相關(guān)，可以通過(guò)上述的多種信號(hào)通路參與腎纖維化的進(jìn)程。另外，關(guān)于FoxO1與TGF-β/Smad通路在腎纖維化中的研究目前幾乎沒(méi)有。但相關(guān)研究表明，在前列腺癌細(xì)胞PC3中，過(guò)表達(dá)FoxO1可以上調(diào)Smad4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，且過(guò)表達(dá)Smad4顯著增強(qiáng)FoxO1對(duì)PC3細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用[49]；在軟骨分化過(guò)程中，TGFβ通過(guò) Smad 信號(hào)刺激FoxO1核易位，促進(jìn)FoxO1的表達(dá)和活性，并且 FoxO1 是響應(yīng) TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)的 COL2 和 ACAN 表達(dá)所必需的[50]。這些研究表明，F(xiàn)oxO1/Smad可能在腎纖維化中發(fā)揮了作用。因此，深入研究FoxO1與腎纖維化之間的內(nèi)在分子機(jī)制，有助于為腎纖維化的病理研究提供依據(jù)，同時(shí)為腎纖維化的預(yù)防和治療提供新的理論支持。