江麗潔,田曉黎,袁強,劉巨釗,崔琦
(浙江中醫(yī)藥大學 藥學院,浙江 杭州 310053)
中藥衢枳殼為蕓香科Rutaceae 常山胡柚Citrus×aurantium‘Changshanhuyou’的干燥未成熟果實于7 月份果皮尚綠時采收,自果實中部橫切為兩半,曬干或低溫干燥而得[1]。衢枳殼習稱“胡柚片”,其藥用歷史可追溯至清代,在衢州地區(qū)做民間藥使用,也被作為枳殼銷往全國各地。衢枳殼于2016 年被納入《浙江省中藥炮制規(guī)范》地方慣用藥材來源品種,又于2018 年被浙江省經(jīng)濟和信息委員會收入“新浙八味”中藥材培育名單[2],成為常山地道的大宗中藥材?,F(xiàn)代藥理學研究表明,衢枳殼與《中國藥典》所收載枳殼的3 個不同來源種(品種)——酸橙C.×aurantium、代代酸橙C.×aurantium‘Daidai’和朱欒C.×aurantium‘Zhuluan’的理氣寬中功效無顯著差異,且其化學成分類似,符合《中國藥典》對枳殼藥材的質(zhì)量要求[3]。
柚C.maxima在我國很早就被作藥使用?!侗静菥V目》記載:“柚(氣味)酸、寒,無毒,有消食、鮮酒毒、治飲酒口氣,去腸胃惡氣、療妊不思食、口淡之功能”。常山胡柚是衢枳殼來源植物之一,為蕓香科柑橘屬Citrus植物柚與甜橙C.sinensis的雜交品種,分布于中國浙江省常山縣、江山市等地[4],是國家地理標志產(chǎn)品之一[5]。常山胡柚植株高5 m 左右;樹冠呈球形或半球形,無刺;單身復葉,葉片革質(zhì),橢圓形或卵形,有油點,無毛;花單生或為總狀花序,白色花瓣向外反展為長圓形;子房上無毛覆蓋,柱頭較大;柑果橙黃色,近球形至梨形(如圖1);胡柚皮又稱柚子皮、氣柑皮、橙子皮,果皮稍厚,光滑或稍粗糙,較易剝離,油胞下凹,大而疏,有柚子芳香[6-7]。
圖1 常山胡柚的成熟果實Figure 1 Mature fruit of C.×aurantium ‘Changshanhuyou’
常山胡柚的栽培選育歷史已有百余年之久,《中國南方果樹》記載:“最早在青石鎮(zhèn)的底鋪和澄潭兩村種植,現(xiàn)澄潭村胡家自然村仍有一株樹齡約90 年,當?shù)厝朔Q‘祖宗樹’的常山胡柚,還青枝綠葉,年年掛果”。浙江省常山縣為衢枳殼的主產(chǎn)區(qū),近年來,由于勞動力價格逐年上攀、農(nóng)戶管理不當?shù)仍?,導致衢枳殼產(chǎn)量降低、品質(zhì)參差不齊。本研究從常山胡柚栽培方面入手,在了解常山胡柚親本來源及自然栽培條件的基礎上,優(yōu)化常山胡柚栽培技術(shù)并規(guī)范田間管理制度,探究常山胡柚栽培條件對衢枳殼化學成分含量變化規(guī)律的影響,以提高衢枳殼的產(chǎn)量和品質(zhì)。
常山胡柚親本來源復雜,是一個天然雜交種。吳耕民等通過分析常山胡柚植物學性狀特征,認為常山胡柚為柚和甜橙的自然雜交品種[8];陳力耕等采用引物擴增法對常山胡柚及其同屬近親種群,如柚、柑橘C.reticulata、甜橙等進行隨機擴增多態(tài)性DNA 標記(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)分析,認為柑橘和柚是常山胡柚的起源親本[9];Xu 等對該種群可能的親本候選植物進行了轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacers,ITS)序列的研究,結(jié)果表明常山胡柚的ITS1B基因片斷與酸橙完全相同,ITS1A基因片段與柚完全相同[10]。趙維良等綜合常山胡柚及其同屬近親種群進行各項研究,認為常山胡柚的起源親本可能是柚和酸橙,確定了常山胡柚是由栽培及雜交產(chǎn)生,應為栽培變種[11]。
浙江省常山縣為常山胡柚的主產(chǎn)地。常山縣地處浙江省西部,錢塘江最大支流衢江的上游,地理坐標為118°41′51″~118°56′50″ E,28°49′47″~29°11′49″ N;年平均氣溫為17.3℃,無霜期為279 d,≥10℃平均有效積溫為5 514℃;年降水量在1 600~1 900 mm,年平均降水量為1 725.3 mm;年日照時數(shù)為1 898.6 h;屬亞熱帶季風氣候,四季分明,光照充足;土壤類型以黃壤、紅壤為主,土層深厚,土壤pH 值在5.5~6.5[12]。
2.3.1 造林地選擇 常山胡柚為亞熱帶常綠植物,具有耐寒、耐干旱、耐貧瘠的優(yōu)點,適宜生長在土壤深厚、水源充足、排水良好、土壤pH 值在5.5~5.6 的砂質(zhì)壤土中[13]。
2.3.2 苗木繁殖 在過去的栽培歷史中,常山胡柚都采用實生繁殖,因嫁接繁殖能更好地保持植株的優(yōu)良性狀,近十幾年大多采用嫁接繁殖。常山胡柚嫁接繁殖對砧木具有廣泛的適應性,酸橙、實生柚和香櫞C.medica都可作為砧木[13]。
2.3.3 整形修剪 常山胡柚的修剪要求符合因樹制宜、去密留疏、控制行間、通風透光的原則。幼年樹需在前兩年保留生長健壯、均勻分布的新梢作為主枝,選取強壯的分枝作為副主枝,使側(cè)枝群布局合理。成年樹只需將位置不當?shù)膹妱蓍L枝、病弱枝、枯枝等剪去即可[13]。
2.3.4 花果管理 4 月中旬至7 月上旬,做好花果管理:葉片數(shù)目遠大于花朵數(shù)目的胡柚樹應采取保果(花)措施,通過適度修剪、控制花量達到促發(fā)新梢的目的;多果樹采取促梢控果措施,主要包括疏除品質(zhì)差的果,如病蟲果、畸形果等,疏除部分小果、大果和粗皮果[14]。
2.3.5 水分管理 常山胡柚自開花期至結(jié)果期對土壤水分要求較高,土壤含水量需保持在25%左右。此外在常山胡柚采果一個月內(nèi)應控制好水分供應;遇干旱及寒潮天氣應提前灌水,以保護胡柚樹在極端條件下的正常生長需求;雨季或臺風季節(jié)應注意田間排水[14]。
2.3.6 土肥管理 重點使用有機肥,平衡各微量元素的含量,使氮、磷、鉀大量元素及鈣、鎂、鋅等微量元素供應全面,減少缺素癥發(fā)生[14]。常山縣多丘陵山地,常山胡柚的生長經(jīng)常受到干旱、土壤貧瘠等因素制約,做好土肥管理對常山胡柚生長十分重要[15]。
2.3.7 病蟲害防治 對于常山胡柚,病蟲害主要的防治重點包括蚧殼蟲、蚜蟲、葉螨等害蟲引起的蟲害[16],柑橘潰瘍病Citrusbacterial canker(由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種Xanthomonas citrisubsp.citri引起的)和柑橘黃斑病Mycosphaerella citri等病害[17-18]。果樹防治優(yōu)先采用農(nóng)業(yè)防治(主要包括冬季清園,夏季成蟲發(fā)生期捕殺天牛成蟲,樹干刷白等措施)、物理防治和生物防治,非必要不使用化學防治[19]。
常山胡柚在我國江西、福建、湖南、湖北等地都有迅猛發(fā)展,各地栽培技術(shù)大同小異,無明顯差別[20]。常山縣在原栽培技術(shù)的基礎上,針對常山胡柚樹冠郁蔽、內(nèi)膛空虛、通風不良、結(jié)果外移等問題,采用“三疏二改”技術(shù)(疏除大枝,鋸除樹冠內(nèi)部遮蔽性強的主枝;疏除過密樹,控制胡柚園郁閉度小于0.8;疏果,疏去多余果;改土,改偏施化肥為增施有機肥;改水,改善胡柚園灌溉技術(shù)),又通過果實套袋和IMP(有害生物綜合治理)防治技術(shù)減少農(nóng)藥和環(huán)境污染,實現(xiàn)常山胡柚無公害栽培[21-22]。栽培技術(shù)優(yōu)化后常山胡柚的果形更為美觀,果實大小均勻,可溶性固形物含量增多,固酸比提高,優(yōu)質(zhì)果率有明顯提升,遠優(yōu)于其他地區(qū)的常山胡柚[16,23]。常山胡柚具有抗逆性強、適應性好的優(yōu)點,在栽培過程中仍然需要不斷提高優(yōu)化栽培技術(shù)才能確保常山胡柚實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)。
趙四清等選擇山地、水田和沙灘地三種地形以及紅壤土、黃壤土、水稻土等土壤類型,開展土壤背景與胡柚生長情況調(diào)查。結(jié)果表明,在不同土壤環(huán)境下,常山胡柚果實、葉片中的化學成分存在較大的差異[24]。嚴曉麗等通過研究發(fā)現(xiàn),隨著常山胡柚果徑的增大,果實中所含的橙皮苷與柚皮苷的含量反而減少,而干燥后果徑小于4.5 cm 的衢枳殼所含的黃酮類物質(zhì)含量最多,藥材品質(zhì)最佳[25]。劉春榮等通過對不同落果期衢枳殼中黃酮類物質(zhì)含量和抗氧化活性進行比較,發(fā)現(xiàn)生理落果中的黃酮類物質(zhì)的含量高于人工疏果中的,小果和中果中的大于大果中的,衢枳殼提取物的抗氧化活性也是如此[26]。馮敬騫等測定不同產(chǎn)地的衢枳殼中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等的含量差異,并對其質(zhì)量進行綜合評價。結(jié)果表明常山縣的衢枳殼中的總黃酮含量最多,藥材質(zhì)量明顯優(yōu)于其他產(chǎn)地的[27]。目前此類研究較少,常山胡柚栽培條件對衢枳殼產(chǎn)量與品質(zhì)的影響的規(guī)律尚不明確。
常山縣作為原產(chǎn)地及道地產(chǎn)區(qū)具有一定的地域優(yōu)勢,衢枳殼作為其藥材品質(zhì)與該地自然條件及栽培條件密不可分。改變常山胡柚的土壤環(huán)境、做好常山胡柚果期管理等能顯著提高衢枳殼中黃酮類物質(zhì)的含量,提高衢枳殼藥材的品質(zhì),這對進一步推動中藥材質(zhì)量管理規(guī)范及中藥現(xiàn)代化進程大有裨益。
黃酮類物質(zhì)是衢枳殼最主要的藥效基礎物質(zhì),《浙江省中藥炮制規(guī)范》將衢枳殼中柚皮苷(C27H32O14)及新橙皮苷(C28H34O15)作為衢枳殼質(zhì)量指標性物質(zhì),規(guī)定衢枳殼中所含柚皮苷不得少于4.0%、新橙皮苷不得少于3.0%。衢枳殼中含有豐富的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等黃酮類物質(zhì)及揮發(fā)性成分[28],此外,還從常山胡柚中檢測到豐富的果膠、膳食維素、維生素等物質(zhì)[29]。
黃酮類化合物是一類具有多酚結(jié)構(gòu)的植物次生代謝物,由兩個芳香環(huán)(環(huán)A 和環(huán)B)通過一個含有三個碳原子的雜環(huán)(環(huán)C)連接而成的,如圖2。對黃酮類化合物的生物合成途徑已有較為清晰的認識:首先通過苯丙烷途徑將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酰-Co A,香豆酰-Co A 再進入黃酮合成途徑與3 分子丙二酰Co A 結(jié)合生成查爾酮,查爾酮被不同類別的酶催化產(chǎn)生其他黃酮亞基[30]。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異可將黃酮類化合物分為黃酮類(flavones)、黃酮醇(flavonols)、二氫黃酮(2H-flavanones)、異黃酮(isoflavones)、黃烷醇(flavanols)和花色素(anthoyanidins)六大類[31]。一些常見的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)及來源如表1所示。蕓香科植物中的黃酮類及二氫黃酮類化合物含量較多,衢枳殼中幾種主要的黃酮類化合物見表2,結(jié)構(gòu)見圖3。
圖2 黃酮類化合物的一般結(jié)構(gòu)(圖為作者自繪)Figure 2 Structure of flavonoid
圖3 衢枳殼中分離得到的主要黃酮類化合物結(jié)構(gòu)(圖為作者自繪)Figure 3 Main flavonoid structure isolated from Qu Aurantii Fructus
表1 常見黃酮類化合物Table 1 List of common flavonoid
表2 衢枳殼中主要黃酮類成分Table 2 Main flavonoid component in Qu Aurantii Fructus
揮發(fā)油也稱為精油,包括單萜和倍半萜以及其含氧衍生物,主要為醇、酮和醛等物質(zhì),在食品、化妝品和制藥工業(yè)中具有重要作用[34]。衢枳殼中含有的揮發(fā)油類物質(zhì)主要包括β-月桂烯、苧烯、石竹烯、α-石竹烯、吉瑪烯-D、γ-欖香烯等,其中苧烯在果皮中的相對含量最高[34-35]。研究表明,常山胡柚皮中揮發(fā)性成分非常豐富,約為果皮鮮質(zhì)量的0.5%~2.0%[36]。趙雪梅等采用水蒸氣蒸餾法和有機溶劑提取法從常山胡柚中檢測出揮發(fā)油物質(zhì)及揮發(fā)性成分共49 種,其中主要成分是萜烯類化合物,占檢測出揮發(fā)油物質(zhì)及揮發(fā)性總成分的93%,出油率為0.3%~0.9%[37]。
衢枳殼中還含有生物堿類、香豆素類等物質(zhì),從常山胡柚果皮中檢測到豐富的果膠、色素、纖維素等物質(zhì)。生物堿是天然存在的含氮的特殊代謝物,常應用于藥物、興奮劑、麻醉劑和毒藥的制備[38]。研究發(fā)現(xiàn)衢枳殼中含有辛佛林、N-甲基酪胺等生物堿類物質(zhì)[39]。香豆素是一種有機雜環(huán)化合物,具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、生物利用度高、溶解度高、毒性低等特點,在藥物研發(fā)中具有突出的先導作用[40]。衢枳殼含有的香豆素類主要為葡萄內(nèi)酯和傘形花內(nèi)酯等[29]。衢枳殼中的類檸檬素以配糖體的形式存在,具有良好的水溶性。胡柚皮中果膠含量約占整個果皮干質(zhì)量的35%,經(jīng)濟價值高。從常山胡柚中提取的天然色素安全穩(wěn)定,可以作為人工合成色素的替代品用于食品著色。常山胡柚皮中所含的膳食纖維約占胡柚皮的55%,其含量較其他柑橘屬植物果皮中的高[41]。
明確中藥材的物質(zhì)基礎是中藥現(xiàn)代化的一個重要環(huán)節(jié)。中藥衢枳殼最大的特點是富含黃酮類物質(zhì)且含量較高,具有較大的藥理研究潛力。對衢枳殼有效成分的研究是掌握其藥理作用機制的基礎,有利于提高衢枳殼的藥用精確性和科學性,為衢枳殼藥用價值開發(fā)提供科學的理論基礎。
2015 年版的《浙江省中藥炮制規(guī)范》中記載衢枳殼味苦、酸,為寒涼藥,歸脾、胃經(jīng),具有理氣寬中,行滯消脹、鎮(zhèn)咳化痰、清熱解毒等功效,常用于治療胸肋氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂等病癥?,F(xiàn)代藥理研究表明,衢枳殼具有抗氧化、降血脂、抗炎、抗菌、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[42]。衢枳殼的抗氧化、降血脂作用較為突出,相關(guān)研究較多。
黃酮類物質(zhì)為衢枳殼主要的化學物質(zhì),具有顯著的抗氧化活性。劉小娟等研究證明衢枳殼總黃酮對呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哮喘小鼠肺損傷能發(fā)揮抗炎作用和抗氧化應激作用,并抑制NF-κB 的核轉(zhuǎn)錄以發(fā)揮抗哮喘的作用[43]。王璐等根據(jù)《浙江省中藥炮制規(guī)范》并結(jié)合《中國藥典》(2020 年版)中所述的炮制方法,考察衢枳殼七種不同炮制品的抗氧化能力,結(jié)果表明炮制后樣品中柚皮苷、新橙皮苷雖有所下降,但部分炮制品抗氧化活性有所提高,其中煮制和麩制后的衢枳殼炮制品抗氧化能力較強[44]。對衢枳殼和枳殼抗氧化活性進行對比分析,發(fā)現(xiàn)兩者對DPPH、ABTS 自由基的清除能力都隨著黃酮質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強,且兩者的抗氧化活性沒有顯著差異,均具有很強的抗氧化能力[45-46]。
高脂血癥是指由于脂肪代謝異?;蛑巨D(zhuǎn)運異常,血漿中一種或多種脂質(zhì)升高或降低的全身性代謝紊亂,被認為是心腦血管疾病的主要危險因素之一[44]。目前已研發(fā)出很多能夠降血脂的西藥,但長期服用會對人體產(chǎn)生腹瀉、脂痢等很多不良反應,因此人們尋求從植物中提取天然產(chǎn)物以降血脂。Ying 等采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠,構(gòu)建衢枳殼給藥的藥代動力學和藥效學研究模型,實驗發(fā)現(xiàn)衢枳殼中的新橙皮苷、木犀草素和白藜蘆素具有明顯的藥代動力學和藥效學特性,有較強的體內(nèi)抗氧化活性,可以通過減少腸道脂質(zhì)吸收、抑制HMG-CoA 還原酶活性、調(diào)節(jié)胰腺脂肪酶活性發(fā)揮降血脂作用[47]。對衢枳殼和枳殼降血脂活性進行對比分析,發(fā)現(xiàn)兩者均能有效降低血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量,且衢枳殼的降血脂活性呈劑量依賴性[48-49]。
Li 等觀察衢枳殼提取物(QFAE)對五水硫酸銅誘導的轉(zhuǎn)中性粒細胞熒光斑馬魚Danio rerio模型和脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷小鼠Mus musculus模型的作用,發(fā)現(xiàn)兩者的炎癥因子水平減低,抗炎因子水平升高,表明QFAE具有良好的抗炎作用[50]。Jiang等建立肥胖誘導的非酒精性脂肪性肝病的大鼠Rattus norvegicus模型,口服給以QFAE 8 周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟病變明顯減輕;同時Western 印跡結(jié)果表明,衢枳殼提取物通過抑制磷酸化的NF-κB 和MAPK 通路而發(fā)揮保護肝臟和抗炎的作用[51]。
趙雪梅等通過水蒸氣蒸餾法提取常山胡柚皮中的揮發(fā)性成分進行抗菌實驗,結(jié)果表明常山胡柚的揮發(fā)油對真菌的抑制效果強于對細菌的抑制效果,對石膏樣毛癬菌Trichophyton gypsum和紅色毛癬菌T.rubrum表現(xiàn)出很高的敏感性[52]。衢枳殼為常山胡柚未成熟果實,也含有豐富的揮發(fā)性成分,因此可推測其具有良好的抗菌作用。Moon 等通過紙片擴散法對黃酮類化合物進行抑菌活性篩選,發(fā)現(xiàn)橙皮苷和柚皮苷在天然黃酮類化合物中的抑菌作用最強[53]。
常山胡柚中含有豐富的蔗糖和葡萄糖,但人們在長期實踐中發(fā)現(xiàn)糖尿病患者在食用胡柚后仍然保持穩(wěn)定的血糖,民間也一直流傳著吃胡柚不會得糖尿病的說法,人們猜測胡柚中含有能夠調(diào)節(jié)血糖的物質(zhì)[54]。Wang 等以糖尿病db/db 小鼠和INS-1 胰腺β細胞為體內(nèi)外模型,研究柚皮素和橙皮素對高糖環(huán)境下胰腺β細胞的保護作用及其作用機制,結(jié)果表明柚皮素和橙皮素通過調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路(AMPK)介導的p300 失活來抑制組蛋白乙?;源藢σ认佴录毎M行保護,延緩糖尿病進展[55]。
由于免疫失調(diào)使機體產(chǎn)生的疾病可分為免疫缺陷病和免疫增殖病。趙雪梅等通過研究發(fā)現(xiàn)常山胡柚提取物對T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的增殖反應均有不同程度的抑制作用,其中柚皮素、柚皮苷和檸檬苦素對免疫增殖反應的抑制作用較好,該研究首次報道胡柚皮中化學成分具有免疫生物活性[56]。李小楓等通過觀測橙皮苷衍生物Y-12(HY-12)不同濃度對免疫低下小鼠免疫系統(tǒng)的影響,研究發(fā)現(xiàn)HY-12 能增強體液免疫功能,抑制脂多糖誘導炎癥因子的表達,具有較強的抗炎活性[57]。
衢枳殼作為傳統(tǒng)中藥,有較為明確的藥用歷史。隨著對中醫(yī)藥現(xiàn)代化的不斷強調(diào),衢枳殼的藥用物質(zhì)基礎及針對不同病癥的不同靶點尚不明確,仍需要進一步的研究。衢枳殼藥效物質(zhì)發(fā)揮藥理作用機制的明確,有助于豐富衢枳殼的生物活性,提高其藥用價值。
中藥衢枳殼資源豐富,衢州年產(chǎn)衢枳殼3 000 t,超過全國枳殼產(chǎn)量的三分之一。本文就常山胡柚栽培技術(shù)、衢枳殼化學成分及其藥理作用做了總結(jié),簡單分析了常山胡柚栽培技術(shù)與衢枳殼化學成分與藥理作用的關(guān)系。常山胡柚自然條件下易生存,土壤條件、果徑大小、采摘時期、產(chǎn)地等都會影響衢枳殼藥效物質(zhì)的含量及活性,對衢枳殼藥材的品質(zhì)造成影響。黃酮類、揮發(fā)油類為衢枳殼發(fā)揮藥理作用的主要藥效物質(zhì)基礎。衢枳殼具有抗氧化、降血脂、抗炎、抗菌、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用,其抗氧化和降血脂的作用較為突出。衢枳殼與枳殼相比,有效物質(zhì)含量相似,兩者的抗氧化能力無顯著差異。衢枳殼的傳統(tǒng)方劑在治療氣滯食阻、食積不化等方面有很豐富的臨床應用經(jīng)驗,如枳殼湯、枳殼散等。國內(nèi)外學者對常山胡柚栽培技術(shù)、衢枳殼化學成分及其藥理活性有一定認識,但是就目前的研究現(xiàn)狀來看也存在一些問題:不同產(chǎn)地衢枳殼品質(zhì)差異的原因以及栽培條件對衢枳殼中化合物含量和活性影響的內(nèi)在聯(lián)系仍不清晰;對衢枳殼中除黃酮外的其他化學成分的研究以及衢枳殼藥效作用機制研究較少;衢枳殼的新藥開發(fā)幾乎沒有。在對衢枳殼的進一步研究中應堅持以中醫(yī)理論為指導,結(jié)合現(xiàn)代科學研究方法和先進技術(shù),更全面地探究其藥效物質(zhì)基礎發(fā)揮藥理作用的機制,將栽培條件與衢枳殼品質(zhì)相聯(lián)系,明確衢枳殼次生代謝產(chǎn)物積累的有效方法,充分實現(xiàn)其藥用價值,為衢枳殼資源開發(fā)利用及相關(guān)中藥復方制劑的生產(chǎn)與臨床應用提供科學依據(jù),為實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化做出貢獻。