王 恒，王海萍，周美春，陳慧敏，周春翠，吉楊丹，劉 曦，臧貴勇

(1.黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558013；2.黔南州婦幼保健院，貴州 都勻 558000；3.黔南民族醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000)

痛風是一種嚴重危害人類健康的代謝性疾病。其主要病因是由于長期嘌呤代謝障礙，血尿酸增高，尿酸沉積在關節(jié)囊、滑膜等關節(jié)組織導致的急性炎癥反應，引起組織損傷的臨床綜合征[1]。在痛風發(fā)病過程中，白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α作為主要的炎癥因子能激活下游的很多信號通路，在痛風性關節(jié)炎炎癥反應中起重要作用[2]。目前用于治療痛風性關節(jié)炎的藥物主要為秋水仙堿、苯溴馬隆、別嘌醇、糖皮質(zhì)激素等，但不良反應很多[3]。民族民間中有許多治療痛風臨床效果良好的藥方，但作用機制及安全性沒得到實證[4]。本課題擬以挖掘民族良方為目的，建立大鼠痛風關節(jié)炎模型，以不同濃度水族抗痹癥方灌胃干預，觀察其是否具有治療痛風性關節(jié)炎的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 尿酸鈉購自于Sigma公司，批號：BCCF5862；白介素1-β，批號：20201228、白介素6，批號：20201227、腫瘤壞死因子-α ELISA，批號：20201229試劑盒均購自于北京誠林生物公司；尿酸測定試劑盒，批號：202001025購自于南京建成生物工程研究所有限公司。秋水仙堿片(規(guī)格：0.5 mg)購于云南植物藥業(yè)有限公司。顯微鏡E200型(日本尼康)，酶標儀MR-96A型(深圳邁瑞)等。

1.2 抗痹癥方的制備 由于該配方為保密方，故只列舉其中兩種藥材刺五加、雷公藤。按照其配方組成用53度白酒浸泡3個月以上所制成的酒劑。

1.3 實驗動物與分組 清潔級SD雌性大白鼠60只，體質(zhì)重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)。隨機分為6組，即空白對照組，模型對照組，陽性對照組(秋水仙堿，9 mg/kg)，抗痹癥方(5 ml/kg)、中(2.5 ml/kg)、低(1.25 ml/kg)劑量治療組，每組10只。

1.4 建模及灌胃 痛風性關節(jié)炎建模：除空白對照組外，其他各組均用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，用6號注射針右側(cè)踝關節(jié)后側(cè)從30～40°方向插入至跟腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml尿酸鈉溶液(50 mg/ml)注入關節(jié)腔內(nèi)?？瞻讓φ战M同樣采用6號注射針右側(cè)踝關節(jié)后側(cè)從30～40°方向插入至跟腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml生理鹽水注入關節(jié)腔內(nèi)。秋水仙堿治療組給予9 mg/kg秋水仙堿灌胃，水族抗痹癥方高、中、低劑量組分別給5、2.5、1.25 ml/kg劑量灌胃，空白對照組和模型給予蒸餾水20 ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠足踝關節(jié)腫脹率的測算 造模前1 h及造模后24 h、7 d后測量關節(jié)周徑，并計算腫脹率。腫脹率(%)=(造模后關節(jié)周徑-造模前關節(jié)周徑)/造模前關節(jié)周徑×100%。

1.5.2 大鼠血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量測定 末次給藥1 h后，股動脈取血，靜置，離心，取上清液，在-20℃下保存待測。血清尿酸采用比色法，白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量采用ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠足踝關節(jié)腫脹率及血清尿酸的結果 造模24 h，各組大鼠腫脹率未見明顯差異。與模型組比較，造模后7 d陽性組、水族抗痹癥方中、高劑量組大鼠腫脹率明顯減輕(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清尿酸含量明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，陽性組、水族抗痹癥方低、中、高劑量組大鼠血清尿酸含量明顯下降(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠足踝關節(jié)腫脹率及血清尿酸的比較

2.2 各組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量測定的結果 與空白組比較，模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性組、抗痹癥方高劑量組大鼠血清白介素1-β含量明顯下降(P<0.05)；陽性組、抗痹癥方中、高劑量組大鼠血清白介素6含量明顯下降(P<0.05)；陽性組、抗痹癥方低、中、高劑量組大鼠血清腫瘤壞死因子-α含量明顯下降(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的比較

2.3 各組大鼠踝關節(jié)滑膜病理切片觀察的結果 見圖1，正常組(圖1A)關節(jié)滑膜結構層次分明，細胞排列整齊，未見炎細胞浸潤；模型組(圖1B)踝關節(jié)滑膜見明顯充血、水腫，滑膜可見大量淋巴細胞等炎細胞浸潤，可見少許纖維細胞增生；與模型組相比，陽性組、水藥抗痹癥方不同劑量組(圖1C、圖1D、圖1E、圖1F)大鼠關節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞浸潤情況相對減輕，未見纖維細胞增生；其中，陽性組與高劑量組滑膜充血、水腫情況以及炎細胞浸潤最輕。

圖1A正常組 圖1B模型組 圖1C陽性組

圖1D低劑量組 圖1E中劑量組 圖1F高劑量組

3 討論

近年來，由于中國經(jīng)濟水平快速提升，群眾生活及飲食習慣發(fā)生了極大的改變，痛風發(fā)病率亦相應地上升[5]。患者體內(nèi)尿酸升高，并且達到過飽和狀態(tài)時，會以結晶形式析出并沉積在關節(jié)腔內(nèi)，導致痛風性關節(jié)炎的發(fā)作。炎癥因子在痛風性關節(jié)炎的發(fā)病、發(fā)展過程中起到重要作用[6]。痛風性關節(jié)炎患者關節(jié)液中存在大量的單核細胞-巨噬細胞，吞噬尿酸結晶時會釋放大量白介素1-β與腫瘤壞死因子-α等細胞因子，可增加前列腺素類物質(zhì)的合成而產(chǎn)生疼痛性感覺，并進一步激活環(huán)氧化酶使炎癥擴大[7-8]。其中，IL-1β可以與受體結合，使滑膜細胞、內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的細胞因子如IL-6等，加速了炎細胞在尿酸鹽沉積關節(jié)周圍浸潤[9]。IL-6是具有多種功能的炎性細胞因子，在痛風性關節(jié)炎炎癥反應中關鍵成分。在痛風性關節(jié)炎急性期IL-6呈明顯高表達，并且與病情活動性呈正相關，它不僅能增加滑膜炎性細胞浸潤，還在反復發(fā)病中起到促進軟骨細胞凋亡的作用[10]。

通過大鼠踝關節(jié)局部注射尿酸鹽晶體混懸液復制急性痛風性關節(jié)炎模型，已經(jīng)被證實具有操作簡便，可控性高，重復性好的優(yōu)勢，目前應用最多[11]。梁莎等[12]報道該方法造模后大鼠病理切片顯示關節(jié)腔內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，以及出現(xiàn)關節(jié)滑膜水腫等變化，與本實驗造模后模型組大鼠病理表現(xiàn)一致。而且本實驗模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均不同程度升高，造模后24 h內(nèi)大鼠踝關節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹、皮膚發(fā)紅，功能障礙等急性炎癥表現(xiàn)，表明大鼠痛風性關節(jié)炎模型復制成功。本實驗造模24 h，各注射組大鼠腫脹度未見明顯差異。造模后7 d后，陽性組、水族抗痹癥方中、高劑量組大鼠與模型組比較腫脹度明顯減輕(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組、抗痹癥方高劑量組大鼠血清白介素1-β含量明顯下降(P<0.05)；陽性組、抗痹癥方中、高劑量組大鼠血清白介素6含量明顯下降(P<0.05)；陽性組、水族抗痹癥方低、中、高劑量組大鼠血清尿酸、腫瘤壞死因子-α含量明顯下降(P<0.05)。踝關節(jié)鏡下病理觀察可見，與模型組相比，陽性組、水藥抗痹癥方不同劑量組(圖1C、圖1D、圖1E、圖1F)大鼠關節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞浸潤情況相對減輕，未見纖維細胞增生；其中，陽性組與高劑量組滑膜充血、水腫情況以及炎細胞浸潤最輕。本實驗證實抗痹癥方不同劑量組均可降低痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹情況，還可通過降低血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量的作用，減輕關節(jié)滑膜炎癥反應。水藥抗痹癥方在大鼠痛風性關節(jié)炎癥狀和炎癥因子方面效果顯著，值得繼續(xù)深入研究。

由于本方提供者不愿意公開藥方組成，因此沒有對組方特點進行分析，本組方中的中藥材需要制成酒劑或者酊劑才能發(fā)揮療效，本實驗所用劑量換算成人用量每天40、20、10 ml，課題組前期已做了其急性毒性實驗[13]，此劑量在安全范圍內(nèi)。本實驗亦證實該方具有降低血清尿酸的效果，為今后民族方藥開發(fā)與利用奠定了理論基礎。