賀 靜，吳柳嬌

(1. 昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2. 云南省第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)遺傳科，云南 昆明 650032)

0 引 言

地中海貧血又稱為海洋性貧血或珠蛋白生成障礙性貧血，是一種威脅人類健康的致死、致殘的常見遺傳性疾病，主要分布在瘧疾高發(fā)的熱帶和亞熱帶地區(qū).β-地中海貧血(地貧)在我國主要分布于長江以南的廣大地域，其中廣西、廣東、海南和云南為高發(fā)地區(qū).其基因突變具有高度的異質(zhì)性，不同種族人群的基因突變類型不同.β-地貧的臨床癥狀輕重不一，可分為輕型、中間型、重型[1]，其致病原因是由于β-珠蛋白基因的點(diǎn)突變或微小缺失而影響基因的轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯，導(dǎo)致β-珠蛋白鏈的生成減少患者紅細(xì)胞中過多的α-珠蛋白鏈沉淀、氧化應(yīng)激、紅細(xì)胞過早死亡，骨髓中無效紅細(xì)胞生成和紅系擴(kuò)張，最終導(dǎo)致貧血[2].到目前為止，已經(jīng)在HBB基因的三個(gè)外顯子、剪接位點(diǎn)和其他調(diào)控元件中發(fā)現(xiàn)了200多個(gè)突變.對于重型β-地貧患者臨床上主要采取長期規(guī)范輸血、成分輸血等方法進(jìn)行對癥治療，這些短效的治療方法無法根治，且長期反復(fù)輸血和無效紅細(xì)胞的生成會(huì)導(dǎo)致鐵負(fù)荷過高、脾腫大、骨骼改變、生長遲緩、纖維硬化和肝硬化、心力衰竭、內(nèi)分泌疾病等，還可能會(huì)引發(fā)感染和過敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡[3].

目前，造血干細(xì)胞移植是唯一治愈β-地中海貧血的方法，但是，由于移植物抗宿主疾病和缺乏免疫匹配的供者，這種移植技術(shù)受到了限制[4].對于缺乏供者的患者來說，移植自體的、經(jīng)過基因矯正的造血干細(xì)胞是一種潛在的替代選擇[5].CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins9，CRISPR/Cas9)是一個(gè)基因組編輯工具，它的出現(xiàn)為治療人類疾病，特別是遺傳疾病提供了一條較好的途徑.近年來，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對β-地貧患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Piuripotent Stem Cells, IPSCs)進(jìn)行基因矯正，矯正后的IPSCs可正常用于造血分化，并恢復(fù)HBB基因的表達(dá)，或通過重新激活γ-珠蛋白基因的表達(dá)而減輕β-地中海貧血的臨床癥狀，從而為β-地中海貧血的治療提供了一個(gè)潛在的選擇.

1 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括sgRNA(single-guide)和Cas9核酸酶兩部分，是一種細(xì)菌免疫系統(tǒng)，可以裂解噬菌體或質(zhì)粒DNA，使特定基因組DNA位點(diǎn)的插入或缺失成為可編輯的靶點(diǎn)[6].

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的序列特異性靶標(biāo)識(shí)別首先依賴于堿基對PAM序列的識(shí)別，然后依賴于sgRNA的20個(gè)核苷酸的延伸與DNA目標(biāo)位點(diǎn)之間雜交，在靶位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double Strand Break，DSB)，CRISPR/Cas9產(chǎn)生的DSB將觸發(fā)細(xì)胞DNA修復(fù)過程，包括非同源末端連接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)介導(dǎo)的易錯(cuò)DNA修復(fù)和同源重組修復(fù)(Homology Direct Repair，HDR)介導(dǎo)的無錯(cuò)DNA修復(fù)，NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)可以快速連接DSB，但在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生少量插入和缺失突變，這些突變可以幫助我們破壞或取消靶基因或基因組元件功能.HDR介導(dǎo)的無錯(cuò)DNA修復(fù)比NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)更為復(fù)雜，且無錯(cuò)DNA修復(fù)需要一個(gè)含有同源性的供體DNA序列作為修復(fù)模板[7].

2 CRISPR/Cas9技術(shù)與其他基因編輯技術(shù)的比較

基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為操縱基礎(chǔ)研究和基因治療中基因表達(dá)的強(qiáng)大工具，鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENS)和CRISPR/Cas9是過去十年中基因編輯中最常用的三種工具，在這三種技術(shù)中，CRISPR/Cas9技術(shù)是該領(lǐng)域最新的參與者；ZFN是第一個(gè)也是最成熟的基因編輯工具，其有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：鋅指DNA結(jié)合區(qū)和DNA裂解區(qū)，DNA結(jié)合域識(shí)別并結(jié)合特定的目標(biāo)DNA序列，這種結(jié)合使切割結(jié)構(gòu)域能夠斷裂雙鏈DNA，從而通過非同源末端連接或同源重組修復(fù)來觸發(fā)DNA的修復(fù)過程，該方法需要不同的鋅指核酸酶的組合來確?；蚓庉嫷男蛄刑禺愋?，且ZFN在設(shè)計(jì)和成本方面要求很高.TALENS中的DNA結(jié)構(gòu)域是由33～35個(gè)氨基酸模塊組成的TAL效應(yīng)器，每個(gè)模塊識(shí)別單個(gè)核苷酸，與ZFN類似，TALEN也使用Fork1來切割目標(biāo)DNA，由于TALEN的分子比ZFN大得多，它可能會(huì)影響分子進(jìn)入細(xì)胞的效率，TALEN需要制造許多對來測試它們的切割效率，此外，DNA的甲基化和組蛋白乙?；赡軙?huì)影響它們的效率[8].

與ZFN和TALENS相比，CRISPR/Cas9有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，ZFN和TALENS是建立在蛋白質(zhì)引導(dǎo)的DNA切割基礎(chǔ)上的，這需要復(fù)雜和耗時(shí)的蛋白質(zhì)工程、選擇和驗(yàn)證；相比之下，CRISPR/Cas9技術(shù)只需要一個(gè)較短的可編輯的gRAN來進(jìn)行DNA的靶向，相對便宜，易于設(shè)計(jì)和制造，通過使用Cas9和幾個(gè)不同的靶點(diǎn)的gRNA，CRISPR/Cas9能夠同時(shí)誘導(dǎo)多個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)的基因組修飾[7].基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的有效性，它是治療地中海貧血的一種有前途的、可行的和安全的方法[9].許多的研究報(bào)告表明，CRISPR/Cas9技術(shù)比ZFN和TALENS具有更好的靶向效率，但其效率仍因細(xì)胞類型和研究實(shí)驗(yàn)室而異.

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在β-地中海貧血中的應(yīng)用

3.1 誘導(dǎo)胎兒血紅蛋白的表達(dá)

3.1.1 HPFH突變誘導(dǎo)胎兒血紅蛋白產(chǎn)生

正常成人在出生后HBG基因表達(dá)逐漸關(guān)閉，表現(xiàn)為胎兒γ-珠蛋白表達(dá)減少，而成人β-珠蛋白表達(dá)增加，對于β-地中海貧血患者來說使血紅蛋白完成胎兒到成人的轉(zhuǎn)換，可以結(jié)合患者體內(nèi)過多的α-珠蛋白鏈，地貧的癥狀就會(huì)得到緩解.例如，在遺傳性胎兒血紅蛋白增高癥(Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin，HPFH)中，這是一種良性的遺傳條件，HPFH包括大量的基因突變，這可能是由于γ-珠蛋白基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的小片段缺失或點(diǎn)突變破壞或重新創(chuàng)造了一些調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)，或者是破壞了β-珠蛋白基因的啟動(dòng)子.突變會(huì)重新激活體內(nèi)HBG基因的表達(dá)，導(dǎo)致Hb F在體內(nèi)高水平表達(dá)，常見的HPFH突變?nèi)鐖D1所示，HPFH與β-地中海貧血相關(guān)基因突變共遺傳可減輕地貧的臨床表現(xiàn)[10].

對于如何應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)來實(shí)現(xiàn)HPFH突變而減輕地貧的臨床癥狀，在TRAXLER等人[10]的研究中，進(jìn)行了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，以突變HBG1和HBG2基因啟動(dòng)子中存在的13個(gè)核苷酸序列(HBG1和HBG2轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的-114至-102位)，從而誘導(dǎo)了自然發(fā)生的HPFH相關(guān)突變，編輯后的祖細(xì)胞產(chǎn)生Hb F水平升高的紅細(xì)胞，為β-地中海貧血的基因組編輯介導(dǎo)的治療確定了一個(gè)潛在的DNA靶點(diǎn).但在未來的研究中還需優(yōu)化HGB1和HBG2 CCAAT box-DR位點(diǎn)在人類造血干細(xì)胞中的定位，并將潛在有害的靶外突變降至最低.在Ye等人[11]的研究中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在正常的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中刪除了13kb的β-珠蛋白位點(diǎn)，以模擬自然發(fā)生的HPFH突變，在細(xì)胞內(nèi)的靶向缺失達(dá)到了31%，與未缺失的細(xì)胞相比，γ-珠蛋白的表達(dá)顯著增加，且沒有檢測到任何的脫靶效應(yīng).在Liu等[12]的研究中，發(fā)現(xiàn)TGACCA序列的突變能夠誘導(dǎo)HPFH的發(fā)生，BCL11A可以通過鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別序列TGACCA，通過編輯TGACCA序列可阻止BCL11A結(jié)合并重新激活γ-珠蛋白的表達(dá).

3.1.2 靶向調(diào)控激活胎兒血紅蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)因子

增加γ-珠蛋白的表達(dá)可以改善輸血依賴型的β-地中海貧血，γ-珠蛋白是一種與α-珠蛋白構(gòu)成異位四聚體胎兒血紅蛋白，在β-地中海貧血中，γ-珠蛋白的表達(dá)可以替代其缺失的功能，因此，提高γ-珠蛋白的表達(dá)具有較大的治療意義.有幾種轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件調(diào)節(jié)胎兒到成人的血紅蛋白的轉(zhuǎn)換過程，包括BCL11A、ZBTB7A、KLF1、DNMT1、MYB、HRI，在這些元件中，BCL11A和ZBTB7A已經(jīng)被證明是小鼠模型和人類細(xì)胞中γ-珠蛋白基因沉默的主要調(diào)節(jié)因子.調(diào)節(jié)機(jī)制如圖2所示[13].

圖2 γ-珠蛋白表達(dá)的相關(guān)調(diào)控機(jī)制Fig.2 Related regulation mechanism of γ-globin expression

BCL11A通過與其他已知的γ-珠蛋白抑制物結(jié)合來抑制胎兒血紅蛋白的表達(dá)，并能與β-珠蛋白基因位點(diǎn)控制區(qū)LCR的相互作用，因此，通過敲除BCL11A來治療β-地中海貧血是一種潛在的有效策略，BCL11A在造血干細(xì)胞的自我更新、B淋巴細(xì)胞的成熟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用，真正具有挑戰(zhàn)的是僅抑制BCL11A在紅系細(xì)胞中的表達(dá)，因?yàn)樽钄郆CL11A具有超出珠蛋白控制的關(guān)鍵生理作用；重要的是，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)紅系增強(qiáng)子序列，該增強(qiáng)子的失活只在紅系細(xì)胞中導(dǎo)致BCL11A的抑制和γ-珠蛋白的誘導(dǎo)[13].

以往的研究證據(jù)表明，對BCL11A基因外顯子2編碼區(qū)的基因組修飾并不是一種實(shí)用的治療方法，因?yàn)樗诹馨桶l(fā)育和造血干細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要的作用.針對這一問題的研究表明，針對性的滅活BCL11A紅系特異性增強(qiáng)子可能是一種替代性的策略，Khosravi等人的研究中，在第二個(gè)內(nèi)含子的BCL11A增強(qiáng)子中，基于CRISPR/Cas9的一個(gè)小的基因組缺失，也能夠激活成人到胎兒血紅蛋白的反向轉(zhuǎn)換和胎兒血紅蛋白的合成.在Huang等人[14]的研中，發(fā)現(xiàn)γ-珠蛋白基因的沉默需要紅系特異性的elF2α激酶HRI，并確定了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ATF4，是一個(gè)受HRI調(diào)節(jié)的蛋白，是一種新的γ-珠蛋白調(diào)節(jié)因子，通過與其增強(qiáng)子結(jié)合直接刺激γ-珠蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL11A的轉(zhuǎn)錄，但其中值得注意的是，在該研究中，HRI缺陷小鼠表現(xiàn)出正常的BCL11A水平，這表明了具有物種選擇性調(diào)節(jié).在Niu等人[15]的研究中，一名β-地中海貧血患者接受了CTX001治療，CTX001是針對患有嚴(yán)重β-地中海貧血患者采用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯的針對同一BCL11A增強(qiáng)子的自體CD34+細(xì)胞的造血干細(xì)胞療法，在進(jìn)行治療一年后，患者的骨髓和血液中的等位基因編輯水平都很高，胎兒血紅蛋白含量增加，輸液獨(dú)立，消除了血管閉塞發(fā)作.但在患者輸注CTXOO1后，患者出現(xiàn)了不良事件，包括中性粒細(xì)胞減少的肺炎、膿毒癥、腹痛等，還觀察到了淋巴細(xì)胞減少的非嚴(yán)重不良事件，原因可能是導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞恢復(fù)的延遲；且在該項(xiàng)研究中，這些結(jié)果對于其他患者的普適性還有待研究.

3.2 糾正珠蛋白基因的表達(dá)

在β-地貧患者中發(fā)現(xiàn)了200多種不同類型的Hb基因突變，這種突變可能位于DNA片段中的任何位置，其中包含三個(gè)外顯子、剪接位點(diǎn)和其他調(diào)節(jié)元件，治愈β-地貧等遺傳性疾病的理想方法是糾正導(dǎo)致這種疾病的突變.近年來，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在特定位點(diǎn)來制造特定的DSB和HDR以糾正特定的基因突變已經(jīng)成為首選的方法.在人類的多能干細(xì)胞中，同源重組基因打靶尤為困難，CRISPR技術(shù)的最新發(fā)展為提高同源重組率提供了新的途徑，使用ssODNs代替供體載體修復(fù)HBB基因突變，并插入帶有Cas9基因的選擇標(biāo)記，這避免了使用供體載體作為HDR模板時(shí)遇到的問題.ssODNs對HDR更有效、細(xì)胞毒性更低[15].

Cai等人[16]的研究為利用CRISPR/Cas9技術(shù)來糾正各種Hb突變成為一種通用的策略提供了原理證明，在其研究中使用了兩個(gè)有效的引導(dǎo)RNA和一個(gè)DNA模板，該研究證明了這種通用的方法能夠糾正各種Hb基因突變，恢復(fù)β-珠蛋白的產(chǎn)生.對β-地中海貧血患者體內(nèi)的IPSCs進(jìn)行基因編輯可以為治療這種疾病提供一條新的途徑，糾正IPSCs的致病突變可以恢復(fù)正常功能，并為移植提供了豐富的來源.在Xie等人[17]的研究中，利用了CRISPR/Cas9技術(shù)，有效地糾正了患者來源的IPSCs中的HBB突變，且在矯正的基因中沒有檢測到非靶點(diǎn)效應(yīng)，細(xì)胞保持了完全的多能性，并顯示出正常的核型，從而證明了未來基于干細(xì)胞的基因治療在單基因疾病中的應(yīng)用邁出了關(guān)鍵的一步.在Niu等人[15]的研究中，設(shè)計(jì)了針對HBB基因CD41/42突變的CRISPR/Cas9，證明了ssODNs與CRISPR/Cas9結(jié)合能夠糾正β-地中海貧血IPSCs中的HBB基因CD41/42突變.重要的是在該項(xiàng)研究中，根據(jù)全外顯子測序，沒有在矯正的IPSCs的外顯子中檢測到高突變負(fù)荷，這對未來的臨床應(yīng)用是必不可少的，這為那些骨髓與潛在捐贈(zèng)者不匹配的人提供了一種新的治療選擇.

3.3 抑制α-珠蛋白基因的表達(dá)

基于α-珠蛋白鏈與β-珠蛋白鏈不平衡所致的無效紅細(xì)胞生成和溶血的β-地貧的病理生理，當(dāng)α-地貧合并β-地貧時(shí)，過多的游離的α-珠蛋白就會(huì)大大的減少，從而在很大程度上減輕了患者的臨床癥狀[18]，在Mettananda等人[18]的研究中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對原代人類造血干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，刪除了MCS-R α-珠蛋白的增強(qiáng)子，并導(dǎo)致α-地中海貧血，當(dāng)編輯的CD34+細(xì)胞分化為紅系細(xì)胞時(shí)，觀察到α-珠蛋白表達(dá)的預(yù)期減少和β-地貧患者細(xì)胞中病理性珠蛋白鏈?zhǔn)Ш獾募m正，異種移植后的CD34+細(xì)胞中有一部分是長期再生造血干細(xì)胞[19]，這表明了這種方法有可能轉(zhuǎn)化為治療β-地貧的方法.

4 CRISPR技術(shù)應(yīng)用于地貧治療存在的問題

在CRISPR技術(shù)應(yīng)用于臨床之前，必須滿足許多條件，它的編輯效率和遞送效率必須足夠大，才能達(dá)到臨床上有意義的結(jié)果，且永久性的非預(yù)期變異所產(chǎn)生的不良事件應(yīng)該最小化[20].

4.1 脫靶效應(yīng)

脫靶效應(yīng)(off-target effect)是目前CRISPR/Cas9面臨的最大問題，即在基因組的非目標(biāo)位置產(chǎn)生非必要的突變.目前已經(jīng)有關(guān)于CRISPR/Cas9應(yīng)用在血液病學(xué)中基因治療，并取得里程碑式的研究進(jìn)展，但伴隨其脫靶效應(yīng)等問題，依然是CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于臨床的一個(gè)障礙[21].非靶標(biāo)突變是一個(gè)主要的安全問題，基因修改是永久性的，如果突變發(fā)生在重要的位點(diǎn)，將會(huì)產(chǎn)生毀滅性的后果.

有研究表明，通過改變它們的長度、二級結(jié)構(gòu)或化學(xué)成分，通過延長雙鏈長度來修改sgRNA結(jié)構(gòu)，并將胸腺嘧啶連續(xù)序列中的第四個(gè)胸腺嘧啶突變?yōu)榘奏せ蝤B嘌呤，可以顯著提高細(xì)胞的基因敲除效率[22-23].近年來，許多改良的廣泛靶向性的工程化Cas9蛋白已被開發(fā)出來，例如Cas9切口酶或Fok1與降解的sgRNA融合來執(zhí)行ssDNA的斷裂，這可以顯著的降低WT Cas9變體的脫靶效應(yīng).同時(shí)也可以通過改變CRISPR/Cas9核酸酶的PAM識(shí)別位點(diǎn)而不損失靶向特異性來增加CRISPR/Cas9核酸酶的靶向能力，具有改變PAM靶向性的Cas9核酸酶的不同變體，如VQR和VRER變體在人類細(xì)胞中表現(xiàn)出更強(qiáng)的特異性，其他的變體還包括xCas9，它可以識(shí)別比自然Cas9更廣泛的PAM序列[24].在Xie等人[25]的研究中，為解決CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶效應(yīng)，使用了最新的高保真的SpCas9-HF1來靶向特定患者的IPSCs.Gehrke等人[26]利用工程化的人APOBE3A(eA3A)結(jié)構(gòu)域來減少非靶向突變，該結(jié)構(gòu)域根據(jù)TCR>TCY>VCN層級優(yōu)先使特定基序中的胞苷脫氨基，與人類細(xì)胞中廣泛使用的堿基編輯器3(BE3)融合相比，eA3A-BE3融合在TC基序中對胞苷的活性相似，但在其他序列背景下對胞苷的編輯大大減少，eA3A-BE3糾正β-地貧啟動(dòng)子突變的精度比BE3高得多(>40倍)，并且eA3A-BE3在已知的BE3非靶點(diǎn)上顯示出較低的突變頻率.

4.2 遞送效率

基于CRISPR/Cas9的治療轉(zhuǎn)化為活體應(yīng)用是不小的壯舉，在臨床上有效使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍然是主要的障礙.將Cas9蛋白導(dǎo)入胞漿和細(xì)胞核是CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用的主要障礙，到目前為止，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在體內(nèi)和體外成功地應(yīng)用于質(zhì)粒DNA、mRNA或功能性的蛋白復(fù)合物中.

在許多的研究中，腺相關(guān)病毒(Adeno Associated Virus, AAV)是體內(nèi)常用的遞送載體，不同的AAV血清型為特定細(xì)胞類型提供了更高的傳遞效率，從而允許組織/器官靶向.由于AAV引起的免疫反應(yīng)可能會(huì)限制其應(yīng)用.但AVV還可以驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)，并可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因整合的發(fā)生率較低，這促進(jìn)了組織中持久的基因編輯，因此有很高的偏離目標(biāo)突變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，這需要長期滅活Cas9活性的方法，以防止體內(nèi)長期引入雙鏈斷裂，并降低染色體異常的風(fēng)險(xiǎn).根據(jù)體外編輯的干細(xì)胞類型，基因編輯機(jī)制可以通過電穿孔、顯微注射、細(xì)胞穿透肽和納米顆粒等化學(xué)方法以及基于病毒的載體來進(jìn)行傳遞[27].

到目前為止，基于編輯最具挑戰(zhàn)性的方面是它的傳遞性、特異性和有效性，體外的方法可以在受控的環(huán)境中進(jìn)行，易于使用多種方法進(jìn)行有效的設(shè)計(jì)，這可能是將精確的基因編輯藥物帶入臨床的更直接的方式，體內(nèi)的方法將面臨不受控制的目標(biāo)外事件的挑戰(zhàn)，如果使用持續(xù)表達(dá)Cas9的策略可能會(huì)帶來長期處于基因編輯中的風(fēng)險(xiǎn)，從而增加脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn).在這種背景下，選擇合適的遞送工具，高度特異性的基因定位工具是一個(gè)防止意外變異和減少潛在的免疫反應(yīng)的一個(gè)潛在方法[19,28].

5 結(jié)語與展望

CRISPR/Cas9技術(shù)用于地中海貧血的治療主要包括以下幾個(gè)方面：

1)通過誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的小片段缺失或點(diǎn)突變以及刪除β-珠蛋白基因的啟動(dòng)子來誘導(dǎo)Hb F升高，從而減輕地貧的臨床癥狀；

2)通過調(diào)節(jié)胎兒血紅蛋白的轉(zhuǎn)錄因子或順式作用元件如BCL11A、ZBTB7A、KLF1、DNMT1、MYB、HRI等，從而誘導(dǎo)γ-珠蛋白的表達(dá)來替代β-地中海貧血中的功能缺失；

3)在特定位點(diǎn)來制造特定的DSB和HDR,以糾正特定的基因突變；

4)通過刪除α-珠蛋白基因的增強(qiáng)子來減少過多游離α-珠蛋白基因的表達(dá)，從而減輕因α-鏈和β-鏈不平衡所致β-地貧患者的臨床癥狀.

β-地貧是一種給我國帶來巨大公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)的遺傳性疾病，因此，探索新方法來治療疾病，改善患者的生活質(zhì)量成為了迫切的需要.近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)在地貧中的應(yīng)用為β-地貧的治療打開了一扇新的大門，該技術(shù)能夠用于治療β-地貧，緩解β地貧患者的臨床癥狀，但是由于該技術(shù)存在一系列的脫靶效應(yīng)和遞送效率的問題，在未來的研究當(dāng)中，基于低脫靶效應(yīng)和高遞送效率的CRISPR/Cas9技術(shù)與干細(xì)胞技術(shù)的結(jié)合，為β-地貧的治療帶來了更多的希望.