吳靜寧，劉紫威，楊 博，蔡 宸，祁志美，3*

（1.中國科學(xué)院 空天信息創(chuàng)新研究院 傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國科學(xué)院大學(xué) 電子電氣與通信工程學(xué)院，北京 100049；3.中國科學(xué)院大學(xué) 光電學(xué)院，北京 100049）

1 引 言

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）傳感器因其免標(biāo)記、非侵入性、高靈敏度和原位檢測的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生化分析中，主要采用被稱為Krestchmann結(jié)構(gòu)的SPR棱鏡激發(fā)結(jié)構(gòu)［1］。根據(jù)光學(xué)傳感信號的不同，SPR傳感器可分為強(qiáng)度型/角度型、相位型、偏振干涉型和波長型。20世紀(jì)80年代后，表面等離子體共振成像（Surface plasmon resonance imaging，SPRi）［2］和表面等離子體顯微鏡（Surface plasmon microscopy，SPM）［3］被相繼提出并得到蓬勃發(fā)展。1999年，Giebel小組用棱鏡激發(fā)結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振顯微鏡（Surface plasmon resonance microscopy，SPRM）在不同的入射角度對金魚膠質(zhì)活細(xì)胞進(jìn)行了成像，并對細(xì)胞/基質(zhì)的距離進(jìn)行了量化［4］。細(xì)胞膜與基質(zhì)之間的黏附情況得以以高對比度可視化，垂直分辨率在納米范圍內(nèi)。但由于表面等離子體（Surface plasmas，SPs）的傳播和斜入射造成的像差，橫向分辨率表現(xiàn)不佳。通過優(yōu)化棱鏡形狀和掃描成像方式可以減小像差［5］。除了像差問題外，棱鏡激發(fā)結(jié)構(gòu)的角度掃描型SPRM還有其他固有缺點(diǎn)。當(dāng)改變?nèi)肷浣嵌葧r，SPR芯片上的照明區(qū)域會發(fā)生變化，這個問題可以通過增加一對固定的反射鏡和角度可控的反射鏡來解決［6］。此外，對于常規(guī)顯微系統(tǒng)，高倍物鏡的工作距離更短，即要求物鏡更靠近樣品表面，而棱鏡的尺寸限制了物鏡與樣品之間的距離，由此也限制了棱鏡型SPRM的分辨率。1998年，H.Kano等人提出使用高數(shù)值孔徑顯微物鏡激發(fā)SPR［7］，這種新型結(jié)構(gòu)的SPRM從2000年開始迅速發(fā)展［8-9］。通過增加信號接收方向來彌補(bǔ)SPs傳播帶來的圖像模糊［10-12］，高數(shù)值孔徑物鏡型SPRM的空間分辨率可接近衍射極限，在單細(xì)胞、單病毒［13］、單納米粒子［14］、單分子［15-16］等成像檢測方面展現(xiàn)出極大潛力。但由于高數(shù)值孔徑物鏡中存在偏振相關(guān)衰減和光學(xué)相差，菲涅爾模型不再適用于物鏡型SPRM，使得其中SPR的變化難以被定量解釋，需要進(jìn)行復(fù)雜的參數(shù)矯正［17］，物鏡型SPRM的量化分析方法還有待進(jìn)一步的研究。

聚苯乙烯微球合成成本低、粒徑小、疏水性強(qiáng)、分散性好，還具有相對穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，在分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，在表面成像檢測研究中也發(fā)揮出重要的尺度比對與表征作用［13-14，16-19］。本文使用一種新 型的高光譜表面等離子體共振顯微鏡（Hyperspectral surface plasmon resonance microscopy，HS-SPRM）對聚苯乙烯微球進(jìn)行成像，它將波長檢測型的棱鏡SPRM與高光譜成像系統(tǒng)相結(jié)合。不同于角度掃描型SPRM，波長檢測型SPRM不需要頻繁改變?nèi)肷浣嵌龋菑墓庾V中提取與消逝場內(nèi)介質(zhì)等效折射率密切相關(guān)的共振信息。高光譜成像系統(tǒng)可以提供樣品圖像中每個像素點(diǎn)的光譜，這使得HS-SPRM具備在二維空間內(nèi)像素級的光譜分析能力。使用基于不同偏振的光譜校正方法對聚苯乙烯微球的高光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像優(yōu)化，對比SPR成像結(jié)果與反射式明場顯微鏡圖像，發(fā)現(xiàn)二者存在明顯差異。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品

金膜SPR傳感芯片制備：玻璃基片依次用丙酮、乙醇、去離子水超聲、清洗后烘干，然后在潔凈的玻璃基片上依次濺射3 nm鉻和40 nm金。

聚苯乙烯微球樣品片制備：購置的聚苯乙烯微球（直徑9.0～9.9 μm，質(zhì)量濃度5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用去離子水稀釋后滴加在金膜SPR傳感芯片表面，靜置至液體自然風(fēng)干。

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置

反射式明場顯微圖像采集自蔡司金相顯微鏡（Axio Imager A2m）。SPR高光譜數(shù)據(jù)采集自實(shí)驗(yàn)室自研的HS-SPRM裝置，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。寬帶白光經(jīng)多模光纖接入準(zhǔn)直器中，得到較為準(zhǔn)直的平行光束。平行光束經(jīng)過偏振片和孔徑光闌進(jìn)入基于Kretschmann結(jié)構(gòu)的棱鏡型SPR激發(fā)結(jié)構(gòu)，帶有檢測樣品的SPR傳感芯片通過折射率匹配液與45°/45°/90°玻璃棱鏡耦合，反射光通過凸透鏡進(jìn)行成像，這里稱為一級成像。推掃式高光譜成像儀（GaiaField Pro-V10E，四川雙利合譜公司）通過鏡筒與物鏡組合成高光譜顯微成像光路，垂直放置。調(diào)節(jié)平面反射鏡的位置與角度，可使一級成像光進(jìn)入高光譜顯微成像裝置中。保證物鏡的工作距離恰好位于一級成像透鏡的像平面上，就能獲得對焦清晰的樣品SPR圖像。

圖1 高光譜SPR顯微成像系統(tǒng)裝置示意圖。LS：激光泵浦寬帶光源；MF：多模光纖；CD：準(zhǔn)直器；LP：線性偏振片；AD：孔徑光闌；L：f=30 mm雙膠合消色差透鏡；M：平面反射鏡；IP：L的像平面；OBJ：物鏡；HSI：推掃型高光譜成像裝置。Fig.1 Schematic diagram of HS-SPRM system（LS：laser-pumped broadband light source；MF：multimode optical fiber；CD：collimating device；LP：linear polarizer；AD：aperture diaphragm；L：f=30 mm achromatic cemented-double lens；M：mirror；IP：the image plane of L；OBJ：objective lens；HSI：hyperspectral imaging device）.

準(zhǔn)直器、偏振片和孔徑光闌是固定在同一個帶有刻度的旋轉(zhuǎn)臺上，可通過調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)臺調(diào)整并讀取入射角度（入射光與棱鏡直角面法線的夾角）。棱鏡可以水平移動，因此可以調(diào)整入射光照射在樣品上的光斑位置。一級成像透鏡的傾斜角度可調(diào)節(jié)，并且傾斜角度應(yīng)與偏振片和光闌關(guān)于棱鏡中軸線鏡像對稱。平面反射鏡的位置和傾斜角度可調(diào)節(jié)，是主要的光路對準(zhǔn)和調(diào)焦部件。后續(xù)的高光譜顯微成像部分為一個整體，可在一定范圍內(nèi)水平、垂直整體平移。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

將帶有聚苯乙烯微球樣品的金膜SPR傳感芯片通過折射率匹配液與棱鏡耦合，打開光源，調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)臺使得平行光以0°入射到棱鏡直角邊，此時可以獲得最小的像差［5］。調(diào)節(jié)偏振片的角度，分別采集0°偏振（Transverse electric，TE模式）和90°偏振（Transverse magnetic，TM模式）下聚苯乙烯微球的高光譜SPR圖像。

2.4 數(shù)據(jù)處理

高光譜成像儀采集并保存的高光譜數(shù)據(jù)是以.raw格式存儲的二維數(shù)組，可從中解析出單波段的二維圖像信息，或是單像素點(diǎn)的光譜曲線。實(shí)驗(yàn)室用自主開發(fā)的基于Python語言的高光譜數(shù)據(jù)解析軟件對高光譜SPR數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理。將同一入射角度下的TM模式和TE模式的高光譜圖像視為一組數(shù)據(jù)，分別用HSITM和HSITE表示。數(shù)據(jù)處理過程具體分為以下3步：

（1）自動識別感興趣區(qū)域，去除背景數(shù)據(jù)。高光譜成像儀的CCD光電接收器的尺寸是1 392 pixel×1 040 pixel，在前序光路中調(diào)整前級成像透鏡與平面鏡角度與位置時，可能使得最終CCD接收到的光斑尺寸與位置發(fā)生偏差。圖2原始的TM與TE偏振SPR高光譜數(shù)據(jù)中，無用的黑背景占據(jù)了大部分區(qū)域，如果將背景數(shù)據(jù)也代入后續(xù)計(jì)算，是無用且耗費(fèi)大量計(jì)算資源的，因此需要先對感興趣區(qū)域（Region of interest，ROI）進(jìn)行分割提取，即提取出高光譜顯微鏡視野范圍。利用顯微圖像光斑皆為圓形的特點(diǎn)，先取單波段灰度圖像進(jìn)行閾值處理識別光斑輪廓，然后根據(jù)圓形輪廓計(jì)算光斑的圓心與半徑，最后生成圓形掩模版用于截取高光譜數(shù)據(jù)。為了提高自動識別圓形輪廓的準(zhǔn)確性，這里選擇一系列信噪比較高的單波段圖像的輪廓識別結(jié)果進(jìn)行平均。最終將截取后的感興趣區(qū)域的高光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)存為三維數(shù)組。

圖2 SPR高光譜數(shù)據(jù)立方體處理方法與流程示意圖Fig.2 Schematic diagram of the SPR hyperspectral data cube processing method and procedure

（2）在圖像層面進(jìn)行光譜校正。在光譜維度上分別對HSITM、HSITE進(jìn)行數(shù)據(jù)切片，得到波長范圍在400～1 000 nm間360個單波段灰度圖像，將TM模式下的單波段圖像InTM與TE模式下的單波段圖像InTE相比之后進(jìn)行歸一化操作，表達(dá)式如式（1）、（2）所示：

其 中n為整 數(shù) 且n∈[1，360]。由此 得 到360張TM/TE模式下的單波段歸一化圖像，再將這些單波段圖像拼接成數(shù)據(jù)立方體HSITM/TE。

（3）在光譜層面進(jìn)行圖像平滑。在空間維度上對HSITM/TE進(jìn)行分割，提取每個像素點(diǎn)的光譜，進(jìn)行多項(xiàng)式平滑濾波，去除光譜噪聲。最終得到光譜校正的平滑的高光譜數(shù)據(jù)。

僅TM偏振光可激發(fā)SPR現(xiàn)象，故TE模式數(shù)據(jù)中的光譜即為經(jīng)過棱鏡全反射的光源光譜。因此數(shù)據(jù)處理得到的TM/TE模式下的光譜曲線可視為消除了光源光譜影響的校正曲線，SPR共振峰的位置更加顯而易見。此外，在整套光路系統(tǒng)中可能存在難以清除的塵?；蚴枪鈱W(xué)器件瑕疵，在高光譜成像結(jié)果中形成固有污點(diǎn)，使用上述數(shù)據(jù)處理的方法可以大幅降低固有污點(diǎn)的對比度，削弱固有污點(diǎn)對SPR圖像分析的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚苯乙烯微球SPR圖像處理效果

圖3（a）、（b）分別為TM偏振與TE偏振的原始高光譜偽彩色圖像，僅在發(fā)生SPR的TM偏振圖像中隱約可見聚苯乙烯微球的輪廓。圖3中“P1”所指的是一個聚苯乙烯微球樣品所在的位置，“P2”指向無樣品的位置。圖3（e）、（f）分別為TM偏振與TE偏振圖像中箭頭指向的單像素點(diǎn)的原始光譜。TM偏振中的聚苯乙烯微球與空氣介質(zhì)的SPR共振光譜存在明顯區(qū)別，故而在高光譜偽彩色圖像中體現(xiàn)出可區(qū)分微粒輪廓的色彩差異。TE偏振不發(fā)生SPR，故兩個位置點(diǎn)的光譜一致，均為經(jīng)棱鏡全反射的光源光譜。

光學(xué)系統(tǒng)中的固有污點(diǎn)在成像結(jié)果中呈現(xiàn)為未聚焦的黑色衍射光斑，極大地影響了SPR圖像中對微粒樣品位置與輪廓的判斷與分析。這些固有污點(diǎn)存在于成像系統(tǒng)中，不會隨樣品或光源偏振的改變而改變，但位置與尺寸會因裝置放大倍數(shù)以及棱鏡出射光方向產(chǎn)生細(xì)微差別。采用前述的數(shù)據(jù)處理方法第二步后得到TM/TE模式下的SPR圖像，如圖3（c）所示，可見固有污點(diǎn)的對比度被大幅降低，微粒樣品的輪廓得以凸顯，但光譜中的隨機(jī)噪聲也被增強(qiáng)。校正后的光譜不再具有光源光譜本身的特征，如圖3（g）所示，由此避免了光源光譜對SPR共振信息提取造成影響。進(jìn)一步對TM/TE模式下的SPR高光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜平滑，得到的結(jié)果如圖3（d）、（h）所示，圖像與光譜曲線中的隨機(jī)噪聲得以削弱，更有利于SPR共振峰信息的精確提取。

圖3 聚苯乙烯微球的SPR圖像處理效果。（a）未經(jīng)處理的SPR高光譜偽彩色圖像；（b）未經(jīng)處理的TE偏振高光譜偽彩色圖像；（c）按照TM/TE模式處理后的SPR高光譜偽彩色圖像；（d）曲線平滑處理再按照TM/TE模式處理得到的SPR高光譜偽彩色圖像；（e～h）分別為圖3（a～d）中指示的單像素點(diǎn)對應(yīng)的光譜曲線。Fig.3 SPR images processing effect of polystyrene microspheres.（a）Original SPR hyperspectral pseudocolor image；（b）Original TE-polarized hyperspectral pseudocolor image；（c）SPR hyperspectral pseudocolor image processed in TM/TE mode；（d）Smoothed TM/TE mode SPR hyperspectral pseudocolor image；（e～h）Single-pixel SPR spectra indicated in Fig.3（a～d）.

3.2 明場反射顯微圖像與SPR圖像的對比與分析

圖4展示了聚苯乙烯微球樣品片上同區(qū)域的反射式明場顯微鏡成像結(jié)果與SPR成像結(jié)果，箭頭指出的聚苯乙烯微球“ps1～ps8”在圖4（d～f）中依次對應(yīng)。對比明場反射圖像與SPR圖像發(fā)現(xiàn)二者主要存在以下幾點(diǎn)差異：

圖4 聚苯乙烯微球的反射明場顯微圖像與其SPR圖像的對比。（a）反射式明場顯微圖像；（b，c）數(shù)據(jù)處理前與處理后的525 nm單波段SPR灰度圖像；（d～f）為圖4（a～c）中的放大框選區(qū)域。Fig.4 Comparison of the reflected bright-field microscopic image of a sample of polystyrene microspheres with the SPR image of the same sample.（a）Reflected bright-field microscopic image；（b，c）525 nm single-band SPR grayscale images before and after processing；（d～f）Magnified views of the selected areas in fig.4（a～c）.

（1）圖像尺寸在水平方向（平行于SPs傳播方向）上明顯發(fā)生了形變；

（2）明場圖像中聚苯乙烯微球的灰度較為均一，而SPR圖像中各個微球的灰度值差別較大，如“ps2”與“ps4”的灰度明顯淺于“ps3”；

（3）明場圖像中可見的聚苯乙烯微球在SPR圖像缺失了，如箭頭“ps6”指向的位置；

（4）在明場圖像中尺寸相差較大的微粒，如“ps7”和“ps8”，在SPR圖像中尺寸相近。

分析以上成像差異的成因，差異（1）方向異性的圖像形變是因?yàn)樵诶忡R型SPRM中光學(xué)響應(yīng)不是球?qū)ΨQ的［5］。差異（2）～（4）皆與消逝場的性質(zhì)有關(guān)，SPR的變化是與消逝場內(nèi)介質(zhì)的折射率密切相關(guān)的，本文實(shí)驗(yàn)條件中消逝場內(nèi)的介質(zhì)可視為空氣與聚苯乙烯構(gòu)成的混合介質(zhì)，聚苯乙烯微球與金膜表面距離的微小差距將影響混合介質(zhì)的等效折射率，從而引起SPR條件的變化，因此各個聚苯乙烯微球與金膜表面距離的參差不等使得SPR圖像中聚苯乙烯微球呈現(xiàn)非均一性的灰度。

對于差異（3），由于金膜表面激發(fā)的消逝場的穿透深度與入射光波長有關(guān)，通常只有幾百納米（入射光波長630 nm時，激發(fā)金膜表面的消逝場穿透深度為162 nm）［20］，當(dāng)聚苯乙烯微球與金膜表面的距離超出消逝場的穿透深度時，如圖5中“P2”所示的情況，此時等同于消逝場中的介質(zhì)為空氣，那么微球?qū)腟PR圖像的“視野”中消失。如圖4（d）中“ps6”微球處于虛焦?fàn)顟B(tài)，明顯與“ps5”與“ps7”不在同一平面高度上，可判斷該微球遠(yuǎn)離金膜，且距離超出消逝場的穿透深度。

對于差異（4），圖4中“ps1～ps7”微球粒徑平均約10 μm，“ps8”粒徑約3 μm，均遠(yuǎn)大于消逝場的穿透深度，將聚苯乙烯微球視為剛性球型，且與金膜表面的距離存在微小差異，“ps7”與“ps8”微球在消逝場探測深度中的投影面積就有可能是相近的，如圖5中“P1”與“P3”所示的情況，由此明場反射顯微鏡中體積差別較大的微球在SPR圖像中也可能呈現(xiàn)為尺寸相近的圖形。

圖5 用于分析聚苯乙烯微球的棱鏡耦合SPRi傳感器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Schematic diagram of the prism coupled SPRi sensor structure for analysis of polystyrene microspheres

4 結(jié) 論

本文使用高光譜表面等離子體共振顯微鏡對平均粒徑10 μm的聚苯乙烯微球進(jìn)行SPR成像，對基于TM與TE偏振條件的高光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行SPR圖像處理，得到平滑后的TM/TE模式的SPR高光譜數(shù)據(jù)明顯優(yōu)于處理前的效果。在圖像層面上，該數(shù)據(jù)處理方法顯著削弱了圖像中固有污點(diǎn)的對比度，從而凸顯出樣品的位置與輪廓；在光譜層面上，TM/TE模式光譜消除了光源光譜的影響，且平滑后弱化了隨機(jī)噪聲，使得SPR共振波長的提取更為準(zhǔn)確。該數(shù)據(jù)處理方法或可作為高光譜SPRi等同類波長檢測型SPRi裝置的通用數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟。

將聚苯乙烯微球的SPR圖像與明場反射顯微鏡的成像結(jié)果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)存在明顯差異，主要與消逝場穿透深度的限制有關(guān)。相較于反射式明場顯微鏡圖像，SPR圖像無法展現(xiàn)超出消逝場的物體上表面的光散射信息，但能更加敏銳地反應(yīng)物體下表面的接觸情況。值得指出的是，對于超出消逝場穿透深度的微結(jié)構(gòu)物質(zhì)，SPR成像結(jié)果將失去物體尺寸衡量的能力。并且消逝場的穿透深度與金屬層、介質(zhì)層的性質(zhì)以及入射光波長有關(guān)，樣品與金屬層的距離同時對介質(zhì)層的等效折射率有影響，多重變量因子的存在使得波長檢測型SPRi對微粒圖像的量化解釋面臨挑戰(zhàn)。