周繼紅，余月兒，丁樂佳，徐平，毛立民,2，王岳飛*

（1.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院茶葉研究所，杭州 310058；2.浙江省茶葉集團股份有限公司，杭州 310058）

肥胖是全球公共性健康問題之一，過多攝入高熱量食物已成為肥胖及相關(guān)非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的關(guān)鍵誘因[1]。NAFLD 以肝細胞內(nèi)過量的脂肪積累為主要臨床特征，其發(fā)病軌跡可從單純的脂肪變性蔓延至非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化乃至肝癌，成為人類健康的重要威脅[2]。關(guān)于肥胖及相關(guān)NAFLD 等并發(fā)癥的明確作用機制和有效診療手段是亟待解決的重要科學問題。

綠茶作為一種廣泛流行的健康飲品，已被證明具有顯著的降脂減肥、降血糖、緩解胰島素抵抗、改善肝脂肪變性等作用[3-4]，綠茶及其提取物也成為防治肥胖相關(guān)代謝綜合征和NAFLD的有效干預手段，相關(guān)作用機制的研究已成為近年來的熱點。與傳統(tǒng)飲茶方式只能攝入水溶性成分相比，抹茶“吃茶”的食用方法大大提高了茶葉活性成分的攝入率，是一種兼顧滋味和營養(yǎng)的健康食品[5-6]。為明確抹茶在降脂減肥和保肝護肝方面的作用，本研究基于高脂飲食誘導的C57BL/6J肥胖小鼠模型，就抹茶改善肥胖及相關(guān)NAFLD的作用機制展開研究，為健康飲茶及抹茶保健功能開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和科學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抹茶樣品（‘迎霜’‘鳩坑’‘中茶108’和‘茂綠’品種）由浙江駱駝九宇有機食品有限公司提供；雄性C57BL/6J 小鼠（4 周齡，清潔級）購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司；普通小鼠飼料（D12450J）、高脂小鼠飼料（D12492）購于美國Research Diets 公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒、油紅O染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）檢測試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA 提?。═rizol）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TP-214 電子分析天平（美國丹佛儀器公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省常州澳華儀器有限公司）；TGL-16M 高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀動力測試儀器有限公司）；5804R 離心機（德國Eppendorf 公司）；UV-6100A 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；515 高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）儀（美國Waters 公司）；ZRQSV24CN 超純水儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；血糖儀（美國強生集團）；SHZ-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；GZX-9246 MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SpectraMax M5多功能酶標儀（美國加州分子儀器公司）；TS100倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, qRT-PCR）儀（美 國Applied Biosystems公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 抹茶主要化學成分測定

抹茶主要化學成分測定根據(jù)文獻[7]的方法進行，其中含水量測定參考GB 5009.3—2016（《食品安全國家標準 食品中水分的測定》），茶水浸出物含量測定參考GB/T 8305—2013（《茶 水浸出物測定》），茶多酚含量測定參考GB/T 8313—2018（《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》），游離氨基酸含量測定參考GB/T 8314—2013（《茶 游離氨基酸總量的測定》），可溶性糖含量測定采用蒽酮硫酸比色法，可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍比色法，兒茶素與咖啡堿含量測定參考GB/T 8313—2018（《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》）中HPLC法。

1.3.2 動物實驗設(shè)計

小鼠于浙江大學實驗動物中心SPF級實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h晝夜交替。將25只雄性C57BL/6J小鼠在實驗環(huán)境條件下適應性飼養(yǎng)7 d后隨機均分為5組，每組5只，分別飼喂普通飼料（NCD組）、高脂飼料（HFD組）、含0.1%抹茶（‘茂綠’）的高脂飼料（HML組）、含0.5%抹茶的高脂飼料（HMM組）、含1.0%抹茶的高脂飼料（HMH組）。實驗期間小鼠自由攝食飲水，每周記錄攝食量和體質(zhì)量，實驗周期為8周。8周后禁食12 h，采集小鼠血液，使用血糖儀檢測小鼠血糖值。隨后麻醉并處死小鼠，剖取肝臟樣本并保存，用于后續(xù)實驗。以上相關(guān)實驗設(shè)計和實施遵循《實驗動物 福利倫理審查指南》（GB/T 35892—2018）。

1.3.3 肝臟組織HE 染色

將肝臟組織置于10%甲醛水溶液中固定24 h，石蠟包埋后用石蠟切片機連續(xù)切片（厚度為5 μm），按照HE染色試劑盒說明書進行染色。用中性樹膠封片后將切片置于顯微鏡下拍攝圖像。

1.3.4 肝臟組織油紅O 染色

將肝臟組織用冰凍切片包埋劑包埋后，于－20 ℃條件下制備冰凍切片（厚度為10 μm），按照油紅O 染色試劑盒說明書進行染色。用甘油封片后將切片置于顯微鏡下拍攝圖像。

1.3.5 肝臟功能與氧化應激相關(guān)指標檢測

用組織研磨器將小鼠肝臟組織研磨成勻漿，按照試劑盒說明書檢測ALT、AST、SOD活性以及MDA含量。

1.3.6 實時熒光定量PCR 檢測基因表達水平

按照Trizol 試劑盒方法提取各組細胞的RNA，使用NanoDrop 超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）測定RNA 濃度。將樣品稀釋，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。適當稀釋cDNA，配制SYBR 反應體系：SYBR Green 7.5 μL，引物混合物0.6 μL，ddH2O 5.1 μL，ROX 0.3 μL，cDNA 1.5 μL。以GAPDH為內(nèi)參，進行腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）炎癥因子和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）、MyD88炎癥相關(guān)通路關(guān)鍵基因的相對表達量分析（各基因引物序列如表1所示）。實時熒光定量PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，45 個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃延伸15 s。每個樣品重復3次，采用2－ΔΔCT法對基因表達進行定量分析。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式表示，通過GraphPad Prism 8.0 進行統(tǒng)計分析和作圖。2組間的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種抹茶主要化學成分含量測定結(jié)果

抹茶中主要化學成分含量與抹茶品質(zhì)和健康功效關(guān)系密切。4個茶樹品種加工的抹茶成分檢測結(jié)果如表2所示，從中可知，不同茶樹品種加工的抹茶在成分上存在一定的差異。根據(jù)GB/T 34778—2017（《抹茶》）[8]中抹茶的含水率≤6%判定，4個品種抹茶均符合要求。水浸出物含量最高的是‘鳩坑’品種，為39.38%；游離氨基酸含量最高的是‘茂綠’品種，為5.14%；可溶性糖含量最高的是‘鳩坑’品種，為5.85%；茶多酚含量最高的是‘茂綠’品種，為12.75%；咖啡堿含量最高的是‘迎霜’品種，為2.47%。

表2 不同品種抹茶主要生化成分含量Table 2 Contents of main biochemical components in matcha made from different tea cultivars %

通過HPLC 法進一步檢測兒茶素單體的含量，結(jié)果如表3所示。茶葉中兒茶素主要包括非酯型兒茶素和酯型兒茶素。非酯型兒茶素包括沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素等；酯型兒茶素包括沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(－)-epigallocatechin gallate,EGCG]、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸酯等。4種抹茶樣品的兒茶素中EGCG 含量最高，為6.21%～7.48%，其中EGCG含量最高的品種是‘茂綠’，最低的是‘迎霜’。

表3 不同品種抹茶兒茶素單體含量Table 3 Catechin monomer contents in matcha made from different tea cultivars %

研究表明，茶多酚和兒茶素（尤其是EGCG）在降脂減肥、改善脂質(zhì)積累、抑制脂性炎癥損傷等方面有突出的功效[9-10]。因此，選擇4個品種抹茶中茶多酚和EGCG 含量最高的‘茂綠’用于后續(xù)的動物實驗和功效探索。

2.2 抹茶對高脂飲食誘導小鼠肥胖的作用

不同飼料喂養(yǎng)8周后，各組小鼠的體質(zhì)量變化、攝食量、空腹血糖水平如表4 所示。各組小鼠的平均初始體質(zhì)量沒有明顯差異，而飼喂8 周后的平均體質(zhì)量終值與體質(zhì)量增量在各組間差異顯著。其中，以HFD 組的平均體質(zhì)量終值與體質(zhì)量增量最大，增量達14.43 g；NCD 組最小，增量僅5.14 g；添加不同含量抹茶的干預組在體質(zhì)量增量上較HFD組明顯減少，說明膳食補充抹茶能夠有效緩解高脂飲食誘導的小鼠體質(zhì)量增加，而且沒有造成小鼠平均攝食量的差異。血液生化檢測結(jié)果也說明，HFD組較NCD 組出現(xiàn)了明顯的血糖水平升高，而膳食補充抹茶后能夠濃度依賴性地改善高脂飲食誘發(fā)的血糖升高。

2.3 抹茶對高脂飲食誘導小鼠肝臟脂質(zhì)積累的作用

剖取小鼠肝臟進行形態(tài)學觀察，結(jié)果如圖1 所示。在HE染色中，肝臟細胞核被染成藍色，細胞質(zhì)被染成紅色，脂肪不著色，在顯微鏡圖中呈現(xiàn)白色空泡。圖1顯示，在HFD組小鼠肝臟中觀察到更多的白色空泡，整體的脂肪浸潤最為突出。而膳食補充抹茶后，肝臟的脂肪浸潤程度得到明顯改善。進一步對小鼠肝臟進行油紅O染色，其中肝臟細胞核被染成藍色，脂肪被染成紅色。結(jié)果表明，與NCD組小鼠相比，HFD 小鼠肝臟中脂滴數(shù)量明顯增加，同時呈現(xiàn)炎性浸潤。而飲食添加抹茶能夠顯著改善脂滴積累，且效果隨抹茶含量的增加而增強，說明抹茶在改善肥胖相關(guān)肝臟脂質(zhì)積累和炎性病變方面具有良好的潛力。因此，選擇抹茶干預組中效果最為顯著的1.0%抹茶膳食添加組小鼠（HMH組）用于后續(xù)研究。

圖1 抹茶對不同組小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響Fig.1 Effects of matcha on liver lipid accumulation in different groups of mice

2.4 抹茶對高脂飲食誘導小鼠肝臟功能與氧化應激水平的影響

AST和ALT是反映肝臟功能和損害程度的重要指標。如圖2 所示，高脂飲食情況下小鼠肝臟中的AST、ALT活性均顯著高于NCD組小鼠。膳食補充1.0%抹茶后，小鼠AST和ALT活性較HFD組都明顯下降。在氧化應激水平方面，HFD組小鼠肝臟中的抗氧化酶SOD活性較NCD組小鼠顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量顯著升高。與HFD 組相比，抹茶干預能夠有效提升SOD 的活性（P＜0.05），MDA含量也有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 抹茶對不同組小鼠肝臟功能與氧化應激水平的影響Fig.2 Effects of matcha on liver function and oxidative stress level in different groups of mice

2.5 抹茶對高脂飲食誘導小鼠肝臟炎癥反應的作用與機制

采用實時熒光定量PCR 法對不同組小鼠肝臟組織中炎癥因子和TLR4/MyD88通路關(guān)鍵基因的表達水平進行檢測。如圖3 所示，與NCD 組相比，高脂飲食顯著增加了肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA 表達水平。抹茶干預能夠有效抑制相關(guān)炎癥因子的表達，其中TNF-α和IL-1β的表達水平較HFD 組顯著降低（P＜0.05），而對IL-6的抑制效果不顯著（P＞0.05）。在作用通路方面，抹茶干預能夠有效降低高脂飲食誘導的TLR4高表達，并表現(xiàn)出對其下游基因MyD88的明顯抑制，說明膳食補充抹茶能夠通過抑制TLR4/MyD88 通路的激活，改善高脂飲食誘導的小鼠肝臟炎癥反應。

圖3 抹茶對不同組小鼠肝臟炎癥因子和TLR4/MyD88 通路基因表達的影響Fig.3 Effects of matcha on relative expression levels of inflammatory cytokine and TLR4/MyD88 signaling pathway gene in different groups of mice

3 討論

肥胖一般由能量攝入與消耗之間的不平衡導致，其是2 型糖尿病、高血壓、高脂血癥、NAFLD 等多種代謝綜合征的關(guān)鍵誘因[11]。NAFLD 全球患病率約為25%，威脅著全球公共健康[12]。NAFLD初期臨床表現(xiàn)為肝臟脂肪大量積累并誘發(fā)脂肪性肝臟炎癥，中后期發(fā)展出肝臟組織纖維化、硬化等情況，最終甚至可能造成肝臟癌變[13]。尋找安全、有效的NAFLD干預手段成為亟待解決的科學問題。

抹茶是一種在特定栽培方式和加工方法下生產(chǎn)出的可食用粉狀綠茶，其“吃茶”的食用方法意味著全部有效成分都能被人體攝入。研究顯示，抹茶中的氨基酸、多酚和EGCG 等成分具有較好的抗氧化、抗炎等活性[14]。本研究選擇‘迎霜’‘鳩坑’‘中茶108’和‘茂綠’4 個茶樹品種加工的抹茶樣品，對其生化成分進行檢測。結(jié)果表明，不同品種的抹茶在生化成分含量方面有所區(qū)別，其中‘茂綠’品種的茶多酚和兒茶素含量（尤其是最具活性的EGCG 的含量）在4個品種中最高，為其具有較高的相關(guān)生物活性功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。基于高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型研究結(jié)果表明，抹茶可以有效改善高脂飲食誘導的肥胖和相關(guān)肝功能異常。經(jīng)過8周的高脂飲食后，HFD 組小鼠出現(xiàn)了一系列的癥狀，包括體質(zhì)量顯著增加、血糖異常升高、肝臟脂質(zhì)沉積明顯等。而膳食補充抹茶顯著抑制了小鼠的體質(zhì)量增加，并表現(xiàn)出降低高血糖、改善肝臟脂質(zhì)積累的作用。以上結(jié)果表明，抹茶作為一種安全、流行的新式健康飲品，在預防食源性肥胖和緩解相關(guān)的肝臟脂質(zhì)過度積累方面具有良好的潛力。

研究表明，肥胖的發(fā)生及相關(guān)代謝綜合征的發(fā)展與慢性低度的炎癥反應密切相關(guān)[15]。當機體處于過量攝入營養(yǎng)的狀態(tài)下，脂肪組織、肝臟組織等代謝組織會響應這一狀態(tài)，誘發(fā)炎癥因子的釋放，進而表現(xiàn)為慢性低度的炎癥反應[16]。由此造成的胰島素抵抗和代謝功能障礙被認為是諸多代謝疾病產(chǎn)生的重要誘因[17]。近年來，關(guān)于食源性肥胖導致的代謝組織炎癥反應和相關(guān)機制已成為很多科學家關(guān)注的熱點。通過降低炎癥反應的干預手段來防治肥胖及相關(guān)代謝性疾病也成了新的治療策略[18]。

TLR4 相關(guān)通路已被報道與肥胖相關(guān)的肝臟炎癥密切相關(guān)[19]。TLR4 是細胞表面模式識別受體TLRs 家族的重要成員，廣泛存在于多種免疫細胞的表面，在機體免疫應答方面發(fā)揮著重要作用[20]。TLR4介導的信號轉(zhuǎn)導包括MyD88依賴性和MyD88非依賴性2種途徑，其中MyD88依賴性途徑已被證明為多種植物活性成分治療NAFLD的有效靶點[21]。當過量攝入營養(yǎng)和能量時，循環(huán)系統(tǒng)和組織中的游離脂肪酸水平升高，促進了TLR4的激活，并啟動募集下游信號配體MyD88的信號轉(zhuǎn)導。MyD88與白介素1受體相關(guān)激酶結(jié)合后激活泛素連接酶腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptorassociated factor 6,TRAF6）。活化的TRAF6 通過一系列信號轉(zhuǎn)導，最終導致核因子-κB（nuclear factorκB,NF-κB）的激活和細胞核轉(zhuǎn)移，誘發(fā)炎性細胞因子的釋放和細胞損傷[22]。本研究結(jié)果表明，抹茶能夠顯著抑制高脂飲食誘導的肝臟TLR4和下游信號配體MyD88的激活，有效降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達水平，說明TLR4 的MyD88 依賴性途徑是抹茶改善高脂誘導的肝臟炎癥反應的有效作用靶點。

綜上所述，抹茶作為一種富含茶多酚等活性成分的健康飲品，可以減輕高脂飲食誘導的肥胖及相關(guān)肝臟脂肪變性和脂肪性肝炎的病理過程，其機制可能與調(diào)控TLR4及其下游MyD88基因信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)，揭示了抹茶作為降脂減肥和改善非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）有效手段的潛力，為茶葉資源綜合利用和保健功能開發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。