任江珊， 顧雪琪， 牛雅靜,2， 蒲 婭， 付海藍， 黃 河， 戴思蘭

(1.北京林業(yè)大學園林學院/花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室/國家花卉工程技術(shù)研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083； 2.北京市植物園管理處/北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心，北京 100093)

菊花(Chrysanthemum×morifolium)是中國十大傳統(tǒng)名花之一[1]，其豐富多樣的花型與瓣型吸引著全世界園藝學研究者的關(guān)注。菊花的花型主要依據(jù)頭狀花序的形態(tài)，即中央的管狀花和周圍的舌狀花通過不同的瓣型、數(shù)量、姿態(tài)排列組合，從而形成不同的花型[2]。瓣型是菊花花型分類的第一級標準[3]，根據(jù)舌狀花形態(tài)可分為平瓣、匙瓣、管瓣3種基本瓣型，以及管狀花花冠筒伸長并先端開裂成星芒狀的桂瓣瓣型，舌狀花尖端龍爪狀或剪絨狀開裂，或著生毛刺等附屬物的畸瓣瓣型[1,4]。花冠筒長度在菊花DUS測試中是一個重要指標[5]。Song等[6]將花冠筒長(CTL)與舌狀花長(RFL)的比值定義為花冠筒基部合生程度(CTMD)，依次劃定3種不同舌狀花瓣型，0≤CTMD≤0.2為平瓣型，0.2

舌狀花形態(tài)是影響菊花觀賞性的重要因素，研究其遺傳規(guī)律對于菊花瓣型改良育種十分重要。長久以來，菊花各瓣型的來源及其演變關(guān)系存在爭議，相關(guān)遺傳機制尚不明確。陳俊愉[8]認為菊花舌狀花的演化，是從平瓣演化出匙瓣，再成為管瓣，同時舌狀花數(shù)量增加。然而在野生菊和栽培菊中，均發(fā)現(xiàn)平瓣、匙瓣、管瓣共生于同一個花序上的現(xiàn)象，由此推測菊花各種瓣型之間不存在相互演化的關(guān)系[3,9]。前人通過對不同組合的親本及其F1代性狀進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)菊花瓣型存在平瓣遺傳力更強和偏母性遺傳等現(xiàn)象[10]。陳云志等[11]的試驗結(jié)果也表明在分離的后代中，平瓣出現(xiàn)的概率最大，其次為匙瓣，管瓣出現(xiàn)的概率最??；夏伯順[12]發(fā)現(xiàn)瓣型性狀表現(xiàn)出明顯的偏母性遺傳，后代瓣型與母本瓣型相同的比例達80%以上；王希等[13]的試驗結(jié)果同樣表明菊花瓣型遺傳具有偏母性遺傳特點，但也依親本的瓣型而定，不同瓣型的遺傳力不同。

菊屬植物種間生殖隔離不完全，種間雜交較為容易[14]，因此現(xiàn)代菊花作為栽培雜種復合體，具有復雜的染色體倍性及起源演化關(guān)系，這使得以菊花為材料進行舌狀花遺傳規(guī)律的研究十分困難。野菊(Chrysanthemumindicum)是菊科(Asteraceae)菊屬(Chrysanthemum)多年生草本植物，其為菊屬四倍體野生植物資源，在中國分布廣泛。前人研究結(jié)果表明，野菊是現(xiàn)代菊花起源的重要親本[15-18]，參與形成了如今龐大的栽培菊花雜種。課題組前期在野菊分布區(qū)域內(nèi)收集到一株野菊瓣型突變株，不同于舌狀花全部為平瓣的野菊野生型，其舌狀花自然突變?yōu)?種瓣型，平瓣、匙瓣、管瓣并生于一個頭狀花序，且通過扦插繁殖該變異能夠穩(wěn)定存在，可以作為菊花舌狀花形態(tài)研究及遺傳規(guī)律研究的重要模式植物，我們將其命名為CIZ株系(圖1)。此外，不同瓣型的舌狀花并存于同一頭狀花序，是一種類似嵌合性狀的表現(xiàn)。植物嵌合體是指遺傳上不同的2種植物的組織機械地共存于同一個生長點的植物[19]。目前國內(nèi)外對菊花嵌合體的遺傳特性報道較少[20-21]，CIZ株系是否為嵌合體，其3種瓣型是在花發(fā)育前期還是花器官成熟時期形成的尚不明確。

本研究構(gòu)建了野菊CIZ株系和野生型株系CIW的F1代雜交群體，通過統(tǒng)計后代舌狀花花冠筒基部合生程度以探究舌狀花形態(tài)變異遺傳規(guī)律；同時通過野菊CIZ株系與平瓣瓣型小菊雜交探究瓣型突變性狀的遺傳性及野菊CIZ株系作為菊花瓣型改良育種材料的可行性。另一方面，為了探究野菊CIZ株系瓣型嵌合性狀在無性繁殖中的穩(wěn)定性，分別以不同瓣型舌狀花離體培養(yǎng)，觀察不同瓣型舌狀花外植體再生植株瓣型。野菊瓣型變異規(guī)律的研究，對菊花瓣型遺傳機制的研究及菊花瓣型改良育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過野外收集和扦插繁殖獲得2個野菊株系，野菊CIW株系表現(xiàn)為舌狀花全部為平瓣(圖1A)；野菊CIZ株系舌狀花自然突變?yōu)?種瓣型(圖1B)，即表現(xiàn)為平瓣、匙瓣、管瓣并存于一個頭狀花序。

A:野菊CIW株系；B:野菊CIZ株系。圖1 野菊及其瓣型突變株Fig.1 Chrysanthemum indicum and strains of petal type mutation

為探究野菊CIZ株系是否可以作為菊花瓣型改良的育種材料，從課題組資源圃中挑選6個株型緊湊的平瓣園林栽培小菊品種(1902014、1909073、1902027、1902032、1903107、1917105)，它們都具有花量大、花徑大等優(yōu)良觀賞性狀。將6個小菊品種與野菊CIZ株系進行雜交試驗，探究瓣型突變性狀在有性繁殖中的遺傳穩(wěn)定性，并為豐富盆栽小菊瓣型性狀提供創(chuàng)新種質(zhì)。

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交群體構(gòu)建 以野菊CIW株系為母本、野菊CIZ株系為父本進行人工雜交。在母本花蕾初開時去除內(nèi)輪管狀花，同時剪去舌狀花花瓣直至柱頭可見，用硫酸紙袋套袋，同時收集父本花粉。待母本柱頭伸出開叉并分泌黏液時，于晴天的中午對母本進行授粉、套袋，次日重復授粉。冬季采集干燥的人工授粉的花序，脫粒，獲得F1代雜交種子，次年播種。觀察記錄雜交后代瓣型性狀分離情況，分析遺傳規(guī)律。以野菊CIZ株系為母本，具有優(yōu)良性狀的6個平瓣小菊品種為父本，雜交方法同上，得到F1代雜交后代。

1.2.2 F1代舌狀花數(shù)據(jù)采集與分析 對野菊CIW株系與CIZ株系F1代群體各個單株進行數(shù)據(jù)采集，每個單株隨機選取3個花序，測量花序上每個舌狀花的花冠筒長和舌狀花長，并根據(jù)花冠筒長/舌狀花長計算CTMD。統(tǒng)計雜交F1代CTMD測量結(jié)果的最小值(Min)、最大值(Max)、極差(R)、平均值(x)、標準差(S)等，以0.1倍于極差的組距分級，將CTMD值劃分為10組，統(tǒng)計各級的頻數(shù)，繪制次數(shù)分布頻次圖，并利用非參數(shù)檢驗中的單樣本K-S法檢驗CTMD這一性狀是否符合正態(tài)分布。

統(tǒng)計野菊CIZ株系與6個平瓣小菊品種雜交后代F1代種子數(shù)目、定植成活數(shù)目等，并對雜交F1代進行瓣型統(tǒng)計。

1.2.3 雜種優(yōu)勢分析及顯著性檢驗 以中親優(yōu)勢和中親優(yōu)勢率表示雜種優(yōu)勢，將雜交F1代CTMD的平均值(Fm)與中親值(Mid-parents value，MPV)之差定義為中親優(yōu)勢(Hm)：Hm=Fm-MPV，將 (Fm-MPV)/MPV×100%定義為中親優(yōu)勢率(RHm)，RHm>0為正向優(yōu)勢，RHm<0為負向優(yōu)勢。其中，中親值為雙親某一性狀的平均值。

超親優(yōu)勢(Hb)為雜交F1代CTMD平均值(Fm)與高值親本表型值(HP)之差，Hb=Fm-HP，超親優(yōu)勢率(RHb)=(Fm-HP)/HP×100%，RHb>0說明F1代表型值偏向于高值親本，RHb<0說明F1代表型值偏向于低值親本。采用Excel 2016和SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

1.2.4 不同瓣型舌狀花的離體培養(yǎng)及再生植株性狀觀察 植物組織培養(yǎng)試驗在北京林業(yè)大學園林學院組培室完成。將野菊CIZ株系3種瓣型的舌狀花消毒處理后，接種在以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含有2 mg/L細胞分裂素(6-BA)與2 mg/L萘乙酸(NAA)的花瓣再生培養(yǎng)基上，待再生芽長至1.5 cm左右時，將其轉(zhuǎn)移到以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含有0.2 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上；組培苗生根40 d時，選擇根系發(fā)達且生長健壯的組培苗，拿出并洗凈根部的殘余培養(yǎng)基，將其移栽至提前高溫滅菌的基質(zhì)(營養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1，體積比)中，放至人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，移栽后在長日照條件(16 h光照/8 h黑暗)下培養(yǎng)70 d后，轉(zhuǎn)入短日照條件(12 h光照/12 h黑暗)下誘導花芽分化培養(yǎng)，植株開花后對其瓣型性狀進行觀察和統(tǒng)計，針對不同瓣型再生植株分別隨機選取3個花序，測量花序上每個舌狀花的花冠筒長和舌狀花長，并根據(jù)花冠筒長/舌狀花長計算CTMD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 野菊CIW株系與CIZ株系F1代瓣型性狀遺傳分析

2.1.1 雜交群體F1代瓣型性狀表型分布 以野菊CIW株系為母本，野菊CIZ株系為父本，構(gòu)建F1代雜交群體，共得到F1代種子1 044粒，出苗243株，出苗率23.28%，成苗227株，成苗率93.42%。

開花后統(tǒng)計227株雜交后代瓣型(圖2)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，在雜交群體中，舌狀花全表現(xiàn)為平瓣的有166株，約占雜交后代群體的73.13%；舌狀花表現(xiàn)為混合瓣的有59株，約占雜交后代群體的25.99%；雜交后代中，出現(xiàn)了2株全管瓣，約占雜交后代群體的0.88%。

圖A為部分子代表型圖片；圖B為典型平瓣子代、匙瓣子代、管瓣子代。圖2 野菊CIW和CIZ及其部分雜交后代的花部性狀Fig.2 Floral traits of Chrysanthemum indicum CIW, CIZ and part of their hybrid offsprings

2.1.2 F1代瓣型性狀的描述性統(tǒng)計及雜種優(yōu)勢表現(xiàn) 野菊雜交F1代CTMD表型特征值顯示，后代CTMD最大值為0.95，最小值為0，極差為0.95，平均值為0.06，標準差為0.13。由野菊雜交F1代CTMD頻率分布圖(圖3)可知，F(xiàn)1代群體大部分為平瓣，由正態(tài)性檢驗結(jié)果可知，野菊雜交F1代CTMD不符合正態(tài)性分布，而是表現(xiàn)為偏向于低值親本的偏態(tài)分布。說明后代舌狀花表型出現(xiàn)較大分離，為菊花舌狀花性狀進一步的遺傳分析提供了較好的遺傳差異基礎(chǔ)，但也可能是由于平瓣子代所占比例過大，平均值接近0。以野菊CIW平瓣株系為母本，CIZ混合瓣株系為父本，F(xiàn)1代群體中出現(xiàn)2株全管瓣的超親個體，但由于大部分子代仍為平瓣，所以并未形成明顯的超親優(yōu)勢。

CTMD：花冠筒基部合生程度。圖3 野菊CIW株系(♀)×野菊CIZ株系代群體CTMD頻率分布直方圖Fig.3 Frequency distribution histogram of CTMD derived from the F1 generation of CIW strain (♀) and CIZ strain of Chrysanthemum indicum

2.2 野菊CIZ株系與平瓣小菊品種F1代瓣型性狀遺傳分析

以野菊CIZ株系為母本，課題組資源圃6個平瓣小菊品種(1902014、1909073、1902027、1902032、1903107、1917105)為父本進行雜交，統(tǒng)計F1代種子數(shù)目、定植成活數(shù)目等。經(jīng)統(tǒng)計，6個雜交組合共獲得F1代種子2 742粒，發(fā)芽180粒，發(fā)芽率6.56%；成苗154株，成苗率85.56%(表1)。不同雜交組合收獲的種子數(shù)和發(fā)芽情況不同，其中CIZ×1902014成苗率最高，其次是CIZ×1909073組合。

表1 雜交后代情況統(tǒng)計

對野菊CIZ株系與平瓣小菊雜交F1代進行瓣型統(tǒng)計。結(jié)果顯示，雜交后代瓣型全部為平瓣的有128株，占比83.12%；混合瓣有23株，占比14.94%；此外還出現(xiàn)超親子代3株，分別為全匙瓣2株，全管瓣1株。野菊CIZ株系與平瓣小菊雜交F1代中出現(xiàn)了瓣型變異與性狀分離(圖4)，表明野菊CIZ株系舌狀花突變性狀具有遺傳性，可作為園林小菊瓣型育種的重要親本。

圖為部分子代表型圖片，A～J父本分別為1902014、1909073、1917105、1903107、1902014、1902032、1917105、1902027、1917105。圖4 野菊CIZ株系與平瓣小菊雜交后代表型Fig.4 Phenotype of hybrid offsprings derived from Chrysanthemum indicum and flat petaled chrysanthemum

2.3 野菊突變體花瓣再生植株的瓣型表型

為了探究野菊CIZ株系瓣型嵌合性狀在無性繁殖中的穩(wěn)定性，以不同瓣型舌狀花為外植體，通過誘導愈傷組織、分化叢生芽、生根培養(yǎng)、壯苗移栽等步驟，并在人工氣候室內(nèi)栽培及用短日照處理誘導開花。平瓣、匙瓣、管瓣類瓣型分別獲得4株再生植株，隨機選擇再生植株的3朵花序，測量花序上每個舌狀花的花冠筒長和舌狀花長，并計算CTMD。統(tǒng)計不同舌狀花再生植株的平均CTMD。

觀察再生植株盛花期發(fā)現(xiàn)，平瓣、匙瓣、管瓣3種瓣型的再生植株開花后均表現(xiàn)為混合瓣型，保持原來的嵌合性狀，未實現(xiàn)性狀的分離(圖5)，不同瓣型再生植株平均CTMD無顯著差異。其中匙瓣再生植株平均CTMD相對較小，為0.29，平瓣與管瓣外植體再生植株平均CTMD基本相同，分別為0.35和0.34。

圖5 野菊花瓣再生苗瓣型表型Fig.5 Phenotype of regenerated plants from petals of Chrysanthemum indicum with different petal types

3 討 論

菊花是中國十大傳統(tǒng)名花之一，經(jīng)過長期自然變異和人工選育，現(xiàn)代菊花形成了豐富多樣的品種類型，而不同菊花品種瓣型的形態(tài)多樣性更是有目共睹。菊花起源較早且育種歷史較為漫長，有證據(jù)顯示，在栽培菊花的形成過程中，毛華菊和野菊資源扮演了十分重要的角色[15]。前人曾針對毛華菊花朵形態(tài)變異進行整理分析，發(fā)現(xiàn)毛華菊花朵變異類型與栽培菊花十分相似[22]，但同樣作為菊花起源的重要親本，關(guān)于野菊的研究則較少。本研究所關(guān)注的野菊CIZ株系，瓣型特殊，在同一個花頭上同時具有平瓣、匙瓣、管瓣3種瓣型，是菊花瓣型研究的重要材料。因而有助于針對野菊CIZ株系的研究，進一步解開菊花瓣型多樣之謎，探究菊花平瓣、匙瓣、管瓣的演化關(guān)系，同時也為園林應(yīng)用菊花瓣型的改良及定向育種提供參考。

在前人對菊花花部器官性狀的研究中，發(fā)現(xiàn)花徑、舌狀花長等性狀均表現(xiàn)為連續(xù)性較好的正態(tài)分布趨勢，符合多基因控制的數(shù)量性狀的基本特征[23-24]。然而，本研究中野菊CIW株系與CIZ株系雜交后代菊花花部性狀CTMD集中在0.20以下，后代正態(tài)性檢驗結(jié)果表現(xiàn)為偏向于低值親本的偏態(tài)分布。這與Song[7]等關(guān)于CTMD基本符合正態(tài)分布的結(jié)論有所不同。Song等[7]所選親本為栽培群體，而本研究中的野菊為受人工選擇影響相對較小的野生種。菊花不同的雜交組合間，花部性狀雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)程度不同[23-25]，同時由于菊花基因組高度雜合且不同瓣型的遺傳能力存在差異，使得雜交 F1代性狀發(fā)生廣泛分離，從而導致F1代雜種優(yōu)勢衰退[12,25-27]。另一方面，以混合瓣型野菊CIZ株系為母本，平瓣小菊為父本，雜交后代也表現(xiàn)為瓣型以平瓣為主，這與夏伯順[12]得出的瓣型性狀偏母性遺傳的結(jié)論不符。而Song 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在試驗的平瓣(母本)和管瓣(父本)雜交組合中，后代中主要為匙瓣，因而考慮野菊CIZ株系的混合瓣型可能為中間性狀，其遺傳力不如平瓣。綜合2個雜交后代群體，進一步驗證了前人提出的在分離的后代中，平瓣出現(xiàn)的概率最大的結(jié)論[11]，相比匙瓣與管瓣，平瓣遺傳力更強。

雜交是形成物種遺傳多樣性的原因之一[28-30]。本研究中，在以混合瓣型的野菊CIZ株系作為母本，平瓣小菊作為父本的雜交后代中，出現(xiàn)了瓣型性狀的分離，雜交后代出現(xiàn)全平瓣、全匙瓣、全管瓣及混合瓣等表型，考慮到野菊還具有抗逆性強等優(yōu)良性狀，這進一步證明了野菊CIZ株系作為瓣型突變體在菊花瓣型育種中的價值。

野菊CIZ株系平瓣、匙瓣、管瓣3種瓣型共存于同一頭狀花序，是一種類似于嵌合性狀的表現(xiàn)。目前針對菊花嵌合體的研究主要集中在花色研究方面，花色嵌合體植株不同顏色花瓣再生植株往往不能保持原本的嵌合性狀，出現(xiàn)性狀分離[31-33]。而本研究對野菊花瓣再生植株進行觀察發(fā)現(xiàn)，平瓣、匙瓣、管瓣3種瓣型的再生植株開花后均表現(xiàn)為混合瓣型，保持原來的性狀。Thangmanee等[34]對菊花花瓣外植體愈傷組織的組織學研究結(jié)果表明，由菊花舌狀花誘導的再生芽為單一起源，來自于單個分生組織細胞。Pu等[35]通過對毛華菊舌狀花形態(tài)學觀察分析發(fā)現(xiàn)，平瓣型舌狀花與管狀型舌狀花的形態(tài)差異出現(xiàn)在花瓣細胞分裂旺盛的花發(fā)育早期。結(jié)合本研究中組織培養(yǎng)中嵌合性狀的保持現(xiàn)象，推測野菊CIZ株系的瓣型變異可能發(fā)生于花發(fā)育早期。

菊花瓣型是十分重要的觀賞性狀，而受制于菊花瓣型多樣、基因型高度雜合及染色體倍性復雜等因素，對菊花瓣型遺傳規(guī)律的研究及不同瓣型性狀的定向育種顯得尤為困難。而野菊作為現(xiàn)代菊花起源的重要親本之一，對其瓣型遺傳規(guī)律的研究有利于更好地解釋現(xiàn)代菊花的瓣型起源，同時也為菊花的瓣型改良提供參考。