黃博聞， 王 亞， 葛 靜， 孫 星， 王冬蘭， 余向陽(yáng)

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2.省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014)

內(nèi)生細(xì)菌是指可以在植物內(nèi)部組織中定殖的，不會(huì)造成任何直接的、明顯的負(fù)面影響的細(xì)菌[1-2]。內(nèi)生細(xì)菌廣泛分布于植物的各個(gè)組織中，如根、莖、葉、種子等的細(xì)胞或細(xì)胞間隙[3]，甚至在植物的根瘤中也存在[4]。

內(nèi)生菌參與調(diào)控水稻眾多生理活動(dòng)[5]。利用內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)作物抗病能力、減輕污染脅迫是實(shí)現(xiàn)水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的有效方法[6]。Feng等[7]發(fā)現(xiàn)施用含促生與有機(jī)污染物降解功能的內(nèi)生菌可顯著提高水稻生物量，同時(shí)減少水稻對(duì)有機(jī)污染物的富集。研究結(jié)果表明，植物內(nèi)生菌可通過分泌次生代謝物誘導(dǎo)水稻自身抗性的形成[8]或直接應(yīng)對(duì)病原體[9]。Haruna等[10]發(fā)現(xiàn)Sphingomonasmelonis通過產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸干擾水稻種子病原菌Burkholderiaplantarii的σ因子RpoS，從而抑制毒力因子合成。此外，一些有益內(nèi)生菌還可以通過水稻種子跨代傳播[11]，它們?cè)诖龠M(jìn)植物種子萌發(fā)、根毛形成、誘導(dǎo)水稻幼苗抗病性等方面發(fā)揮重要作用[12]。

水稻內(nèi)生細(xì)菌群落分布與組成受環(huán)境因子[13]、水稻品種與生長(zhǎng)期[14]等因素影響。研究結(jié)果表明，分蘗期的水稻內(nèi)生菌多樣性豐富，分布均勻[14]。因此，研究不同地區(qū)不同品種水稻分蘗期的內(nèi)生菌分布，有助于了解水稻與內(nèi)生菌互作關(guān)系，有利于更好地將內(nèi)生菌應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，實(shí)現(xiàn)減少化肥施用、減少農(nóng)藥施用、修復(fù)土壤環(huán)境等目標(biāo)[15]，推動(dòng)農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。目前，有關(guān)江蘇省主要水稻品種中內(nèi)生菌群落分布的研究尚無報(bào)道，對(duì)不同品種水稻內(nèi)生菌菌種庫(kù)的構(gòu)建也鮮有報(bào)道。本研究對(duì)江蘇33個(gè)水稻品種分蘗期的根和莖葉中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離、鑒定和分析，初步構(gòu)建了不同品種水稻內(nèi)生菌菌種資源庫(kù)，為挖掘水稻微生物資源，促進(jìn)水稻育種發(fā)展提供了資源和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗(yàn)藥品：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)與瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，次氯酸鈉(AR，天茂化工有限公司產(chǎn)品)；95%乙醇(南京壽德生物有限公司產(chǎn)品)。

儀器：上海知楚ZQZY-90F振蕩培養(yǎng)箱，Eppendorf Centrifuge 5804R高速離心機(jī)，蘇凈SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)。

1.2 試驗(yàn)材料

分蘗期水稻植株采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田，所采集樣品來自同一片區(qū)域，樣品取回后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，于2 d內(nèi)完成樣品處理。

水稻品種：豐粳3227、滬軟1212、華粳5、華粳8號(hào)、淮粳5號(hào)、金粳818、金香玉2號(hào)、連粳11、連粳15、南粳45、南粳46、南粳47、南粳49、南粳5055、南粳9108、寧粳8號(hào)、日本晴、蘇滬香粳、蘇香粳100、蘇香粳2號(hào)、蘇秀867、皖墾粳11036、武育粳3號(hào)、武育粳80號(hào)、武運(yùn)粳27號(hào)、武運(yùn)粳29號(hào)、徐稻3、鹽粳16、揚(yáng)粳3012、揚(yáng)粳3491、揚(yáng)粳4227、揚(yáng)育粳2號(hào)、鎮(zhèn)稻18號(hào)、鎮(zhèn)稻99。

1.3 樣品收集與表面消毒

將采集的水稻植株用蒸餾水洗凈，每個(gè)品種隨機(jī)取3～5株。用剪刀將水稻分為根與莖葉兩部分并立即進(jìn)行表面消毒，方法參照文獻(xiàn)[5]：采用75%酒精浸沒樣品2 min，采用3%次氯酸鈉浸沒2 min，每次棄去溶液后用無菌水潤(rùn)洗3次。最后1次滅菌水涂布于LB固體平板，驗(yàn)證滅菌效果。向裝有經(jīng)過消毒的水稻組織樣品的離心管中加入2顆滅菌磁珠，然后使用往復(fù)式震蕩機(jī)在750 r/min頻率下研磨20 min獲得組織勻漿液。

1.4 菌種分離純化與保存

取0.5 ml勻漿液用無菌水進(jìn)行4倍稀釋，并移取100 μl 稀釋液涂布于TSB固體平板，每個(gè)品種3次重復(fù)，并置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱。挑選平板中的單菌落進(jìn)行平板劃線直至獲得純化菌種。

20%甘油菌液制備：吸取0.5 ml 純化菌種菌液與40%甘油凍存于-80 ℃冰箱。

1.5 菌種鑒定與數(shù)據(jù)處理

正向引物25F:5′-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；反向引物1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[16]。擴(kuò)增產(chǎn)物送南京通用生物公司測(cè)序，所得序列拼接后在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，將菌株序列相似度>98%的歸為同一種。

采用Origin pro繪圖，采用Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；不同品種水稻的抗病能力及親本信息參考https://www.ricedata.cn/。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌

經(jīng)測(cè)序鑒定后，從33個(gè)水稻品種中共獲得119株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，其中根中分離出的內(nèi)生細(xì)菌77株，莖葉中分離出的內(nèi)生細(xì)菌39株，3株未定義，共涉及19個(gè)屬，從分類水平看，根部分離出的內(nèi)生菌數(shù)量明顯高于莖葉部(P<0.05)。

2.2 不同品種水稻優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌

為探究不同品種中優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌，對(duì)分離出的119株內(nèi)生菌進(jìn)行屬水平分類，共可分為18個(gè)菌屬：不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、 節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假芽孢桿菌屬(Fictibacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、地桿菌屬(Terrabacter)。其中，Bacillus、Aeromonas和Exiguobacterium在水稻組織中出現(xiàn)頻次最高，分別占26%、19%和16%。屬水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，芽孢桿菌屬在水稻內(nèi)生菌屬中占比最高。對(duì)該屬中32株細(xì)菌進(jìn)行菌種分析發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌是主要菌種，分別占總芽孢桿菌菌群的19%、13%和6%。

2.3 水稻不同器官優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌屬

對(duì)各品種水稻組織中分離出的菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從水稻根部分離得到16種菌屬，其中優(yōu)勢(shì)菌屬(占比>10%)依次為Bacillus(31%)、Aeromonas(17%)和Exiguobacterium(15%)；從水稻莖葉部分離得到10種菌屬，優(yōu)勢(shì)菌屬依次為Aeromonas(28%)、Bacillus(20%)、Exiguobacterium(18%)和Microbacterium(13%)。其中，根與莖葉中共有菌屬6種，分別為Bacillus、Aeromonas、Exiguobacterium、Microbacterium、Arthrobacter和Enterobacter。

2.4 親本水稻品種內(nèi)生菌與后代水稻品種內(nèi)生菌的關(guān)系

33個(gè)品種中有8個(gè)品種存在親緣關(guān)系，分析發(fā)現(xiàn)，親本水稻品種(鎮(zhèn)稻99、徐稻3號(hào)、南粳46、武育粳3號(hào))與各自的雜交后代水稻品種(揚(yáng)粳3491、揚(yáng)育粳2號(hào)、滬軟1212、淮粳5號(hào))至少存在1種或2種共有內(nèi)生菌。其中，在母本鎮(zhèn)稻99與后代品種揚(yáng)粳3491之間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Microbacteriumlaevaniformansstrain；在父本徐稻3號(hào)與后代品種揚(yáng)育粳2號(hào)間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Microbacteriumlaevaniformansstrain，在父本南粳46與后代品種滬軟1212間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Bacilluscereusstrain，在母本武育粳3號(hào)與后代品種淮粳5號(hào)間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Exiguobacteriumsp.和Bacillussp.。

2.5 不同品種水稻中抗病菌屬分布

水稻中已被廣泛報(bào)道的具有抗病能力的內(nèi)生細(xì)菌屬主要為Bacillus、Lysinibacillus和Pseudomonas。蘇滬香粳中分離出了最多數(shù)量的Bacillus內(nèi)生菌，這可能在一定程度上與其優(yōu)良的抗葉枯病和抗稻瘟病的特性相關(guān)。其他17個(gè)品種中都分離出1～2種可能與抗病相關(guān)的菌屬，Bacillus在18個(gè)品種中分布相比其他抗病菌屬更廣。

3 討 論

3.1 33個(gè)水稻品種中內(nèi)生菌組成的多樣性

研究結(jié)果顯示，33個(gè)水稻品種中的內(nèi)生菌共涉及4個(gè)菌門：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中，2種核心菌門(厚壁菌門與變形菌門)在各品種中共存。這與相關(guān)研究結(jié)果[17-18]一致，符合水稻組織中常見菌群組成規(guī)律。本研究中，多個(gè)品種中厚壁菌門占比高于變形菌門。厚壁菌門被認(rèn)為具有降解大分子有機(jī)物(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、纖維素等)的功能[19]，這與水稻樣品收集區(qū)域大規(guī)模施用有機(jī)肥有密切關(guān)系，厚壁菌門的升高有助于土壤中有機(jī)質(zhì)的分解利用[20]。變形菌門主要參與固氮，較高的豐度有助于水稻土壤肥力的保持[21]。

從屬水平看，本研究發(fā)現(xiàn)同一區(qū)域內(nèi)不同品種中優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌具有相似性。在長(zhǎng)期的自然選擇中，具有優(yōu)異功能的內(nèi)生菌更容易被不同品種選擇[22]，這些內(nèi)生菌通過增加植物的養(yǎng)分?jǐn)z入量及影響植物激素的釋放[23]，在與植物的互作中占據(jù)有利生態(tài)位，從而避免在根際土與葉際等外部環(huán)境與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)[24]。其中，Bacillus、Aeromonas和Exiguobacterium作為常見優(yōu)勢(shì)菌群在南京33個(gè)水稻品種中廣泛分布，這與菌屬自身具有的有益功能密不可分。Bacillus被廣泛報(bào)導(dǎo)具有抗逆、促生以及良好的生防功能[25-26]。從分布看，芽孢桿菌在水稻根內(nèi)分布更廣，這與相關(guān)報(bào)導(dǎo)[27]一致。本研究結(jié)果表明，分離出的芽孢桿菌菌種主要包括枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌具有生防特性[26]，能夠降解塑化劑等有機(jī)污染物[28]；蠟狀芽孢桿菌兼具解鉀促生功能[29]，可促進(jìn)水稻營(yíng)養(yǎng)代謝；巨大芽孢桿同時(shí)具備溶磷功能[30]，后兩者可能是水稻根部營(yíng)養(yǎng)吸收的重要菌群，而前者為水稻抗病提供了保障。Exiguobacterium被認(rèn)為具有耐受寒冷與鹽堿[31]等極端環(huán)境的特性，擁有還原鉻、砷等具有毒性的重金屬離子的能力[32]，具有降解農(nóng)藥、苯及其同系物等有機(jī)化合物的活性。Exiguobacterium的協(xié)同作用會(huì)使Bacillus反硝化能力顯著提高。Aeromonas是常見的耐鹽菌屬[33]，具有反硝化和除磷功能[34]，從分布看，Aeromonas傾向于定殖于水稻葉內(nèi)，在多種水稻品種中占比達(dá)28%。總之，3種菌屬對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)揮了巨大作用，且菌屬之間存在協(xié)同效應(yīng)，是水稻生產(chǎn)中最有應(yīng)用潛力的菌屬。

3.2 親本水稻品種內(nèi)生菌與雜交后代水稻品種內(nèi)生菌的關(guān)聯(lián)

植物利用種子作為載體，通過垂直傳播保留部分具有重要生態(tài)學(xué)功能的內(nèi)生菌，使后代繼承由內(nèi)生菌賦予的優(yōu)勢(shì)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，后代水稻品種中分離出的內(nèi)生菌可以追溯到1個(gè)親本中的1種或2種，這與相關(guān)研究結(jié)果[36]一致。Liu等[37]研究了分蘗期超級(jí)雜交稻與其親本間內(nèi)生菌群落組成發(fā)現(xiàn)，3種水稻內(nèi)生菌群落組成與結(jié)構(gòu)雖然存在差異，但后代水稻品種中優(yōu)勢(shì)菌屬與親本保持一致。Hardoim等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在第二代種子中發(fā)現(xiàn)了來自第一代水稻種子中45%的細(xì)菌群落。垂直傳播的種子內(nèi)生菌對(duì)作物抗性組成、環(huán)境適應(yīng)性與生長(zhǎng)具有重大影響[39]。本研究中Microbacteriumlaevaniformansstrain的垂直傳播在水稻品種中多次被發(fā)現(xiàn)，它具有耐金屬、耐硝酸鹽和適應(yīng)低pH值的特性，有助于后代水稻品種更快地適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境。Liu等[40]發(fā)現(xiàn)，來自種子中的內(nèi)生菌可隨水稻生長(zhǎng)定殖于植物根部并通過分泌次生代謝物提高水稻對(duì)鎘污染的抗性。禾本科的一些垂直傳播真菌內(nèi)生菌可以賦予宿主特殊生物堿阻止食草動(dòng)物的采食或增加營(yíng)養(yǎng)成分[41-42]。已有研究結(jié)果表明，內(nèi)生菌通過垂直傳播的方式從親本植物傳遞到后代會(huì)使后代具有比水平傳播模式更高的環(huán)境適應(yīng)潛力，因?yàn)樵谒絺鞑ツＪ较拢参镄枰獜沫h(huán)境中重新招募相關(guān)微生物[39]。后代水稻品種可從種子中獲得來自親本的優(yōu)勢(shì)菌屬，也可從土壤中再次選擇性招募相似菌屬[11]。相關(guān)研究結(jié)果表明，即使在不同地點(diǎn)重新培養(yǎng)后，許多相似的內(nèi)生菌群仍然存在于后代水稻品種中[36]。這表明，在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，來自親本的生物信息或資源可能有助于內(nèi)生菌在其后代中的形成[39]，促使后代水稻品種從土壤中招募相似的有益內(nèi)生菌。

盡管水稻內(nèi)生細(xì)菌組成受到基因型、發(fā)育階段等諸多因素影響，但是同一區(qū)域內(nèi)不同品種水稻中仍然存在一些核心內(nèi)生菌， 本試驗(yàn)33個(gè)水稻品種中常見核心內(nèi)生菌群為Aeromonas、Exiguobacterium、Bacillus和Microbacterium。至于這些內(nèi)生菌如何與水稻互作發(fā)揮功能仍有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果豐富了水稻內(nèi)生菌菌種庫(kù)。