方仕茂， 張 拓， 楊 婷， 田小強， 田洪軍， 劉忠英， 潘 科

(1.貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006； 2.沿河土家族自治縣生態(tài)茶發(fā)展和技術指導中心，貴州 沿河 565300)

貴州省沿河縣是中國古茶樹之鄉(xiāng)，存有豐富的喬木型和灌木型古茶樹資源[1]。根據《貴州省古茶樹保護條例》中的定義，沿河縣樹齡達100年以上的原生地天然生長和栽培型古茶樹達萬余株[2]。古茶樹是研究茶樹馴化起源以及特色茶樹種質篩選的重要資源[3-5]。古茶樹鮮葉試制紅茶均呈現出醇和、鮮甜的滋味特征[6]，研究結果表明，古茶樹紅茶甜醇滋味特征與鮮葉中可溶性糖含量高度相關[7]。目前對貢獻鮮甜味的游離氨基酸在不同類型古茶樹鮮葉中的積累特點以及加工對其含量的影響尚不清楚。

茶葉中富含游離氨基酸類物質，目前在茶葉中鑒定出20種蛋白質游離氨基酸和6種非蛋白質游離氨基酸(如茶氨酸、γ-氨基丁酸等)，其中茶氨酸含量占茶葉中游離氨基酸總含量的60%，其次是谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和絲氨酸[8]。研究結果表明，茶氨酸、絲氨酸、甘氨酸和脯氨酸等游離氨基酸是貢獻茶湯鮮爽滋味感官特征的主要化合物[9]；另一方面，茶葉中游離氨基酸類物質參與茶葉香氣的形成[10-11]。古茶樹由于生長年限較長，其次生代謝與長期受到人工選擇的茶樹品種不同[12-13]。盡管當前大量研究從基因水平解析了茶樹高積累兒茶素類、茶氨酸等特征代謝物的分子機制[14-16]，但對同一區(qū)域喬木型古茶樹、灌木型古茶樹以及選育品種茶樹游離氨基酸代謝差異的研究尚未有報道。

為充分利用古茶樹資源，解析古茶樹產品甜醇滋味形成的物質基礎，本研究利用高效液相色譜結合熒光檢測器(High-performance liquid chromatography fluorescence detection, HPLC-FLD)分析不同樹型古茶樹鮮葉中18種游離氨基酸含量，結合化學計量學分析喬木型、灌木型古茶樹與品質對照種茶樹福鼎大白鮮葉中游離氨基酸的積累差異。另一方面，本研究分析紅茶加工工藝對不同樹型古茶樹中游離氨基酸積累的影響。本研究對古茶樹資源利用及古茶樹紅茶滋味品質形成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與處理

16份茶鮮葉及16份干茶樣于2020年3月采集自貴州省沿河縣，具體采樣信息參見文獻[7]。樣品包括喬木型鮮葉樣品7份、灌木型鮮葉樣品7份和品質對照種福鼎大白樣品2份，每份包含3次生物學重復，每個重復取樣50 g。鮮葉樣品稱質量后立即用錫箔紙包裹，置入液氮罐中浸沒5 min，隨后取出轉移至干冰盒內暫存，最后保存于-80 ℃冰箱，待需要檢測分析時采用真空冷凍干燥設備將樣品進行凍干。古茶樹紅茶加工工藝依據《貴州紅茶 工夫紅茶加工技術規(guī)程(DB 52/T 639)》進行加工制取。冷凍干燥樣品和干茶樣品均通過恒溫研磨機研磨，過40目篩后用于游離氨基酸的檢測。

1.2 儀器與試劑

真空冷凍干燥機(ALPHR 1-4 LD plus，北京博勵行儀器有限公司產品)，電子分析天平[ME204E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品]，超純水儀( KL-UP-III-20，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司產品)，高效液相色譜儀配備熒光檢測器(LC2030C Plus，日本Shimadzu公司產品)，乙腈和甲醇(美國Tedia公司產品)。

1.3 游離氨基酸的分離檢測

1.3.1 樣品制備和衍生 稱取冷凍干燥的鮮葉樣和干茶樣1.500 g于錐形瓶中，加入220 ml沸水并在沸水中浸提45 min。浸提結束，將浸提液過濾并轉移到250 ml容量瓶中，冷卻至室溫并用純水定容，搖勻。用2.5 ml無針注射器抽取定容液，過聚醚砜(PES)膜(孔直徑：0.22 μm)至1.5 ml離心管中，混勻。分別移取10 μl經PES膜過濾的溶液、70 μl AccQ·Fluor Buffer1和20 μl AccQ Fluor 2A(AccQ-Fluor Reagent Kit，美國Waters公司產品)于玻璃襯管中，隨后將玻璃襯管置于渦旋器上渦旋混合15 s，渦旋混合液放置在55 ℃烘箱內加熱10 min后取出，冷卻至室溫，用于進樣分析。

1.3.2 HPLC-FLD定量分析游離氨基酸 基于HPLC-FLD對茶樣中18種游離氨基酸化合物進行定量分析。色譜柱為AccQ·TagTM分析柱(60 ?，4 μm，3.9 mm×150.0 mm，1/pkg，美國Waters公司產品)。流動相A為稀釋濃縮液(1∶10，體積比；AccQ.Tag洗脫液∶水)，流動相B為純乙腈，流動相C為超純水，梯度洗脫程序為：0～17 min，100%～91% A，5% B，4% C；24 min，80% A，17% B，3% C；32 min，68% A，20% B，12% C；34 min，68% A，20% B，12% C；35 min，60% B，40% C; 38 min，100% A；45 min，100% A。發(fā)射波長250 nm，檢測波長395 nm。色譜柱流速為1 ml/min，柱箱溫度25 ℃，進樣量10 μl。

1.3.3 游離氨基酸分析 將17種游離氨基酸(天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)混合液標準品(美國Waters公司產品)和茶氨酸配制成不同梯度濃度樣品，采用方法1.3.1中的方法進行衍生，制備標準品的分析樣。通過繪制摩爾質量濃度(x軸)與同一保留時間的峰值面積(y軸)關系曲線，構建18個游離氨基酸標準品的標準曲線，獲得曲線方程以及相關系數，用于計算樣品中各氨基酸的含量?？傆坞x氨基酸含量為上述18種游離氨基酸含量之和。

1.4 數據處理

數據統(tǒng)計及分析采用Excel、IBM SPSS Statistics，作圖采用Origin 2017 64Bit。

2 結果與分析

2.1 不同樹型古茶樹鮮葉游離氨基酸積累差異

采用HPLC-FLD方法檢測氨基酸具有高特異性、高靈敏度等優(yōu)點。由圖1可知，采用Waters-AccQ方法可以實現茶葉中18種游離氨基酸的良好分離，茶氨酸在不同樹型古茶樹鮮葉中含量均為最高(10號峰)，含量較低的氨基酸為半胱氨酸(11號峰)。定量分析結果(表1)顯示，在喬木型、灌木型和福鼎大白品質對照中，鮮葉中茶氨酸的含量分別為(7.56±2.93) mg/g、(10.75±3.00) mg/g和(13.14±1.28) mg/g，分別占游離氨基酸總量的45.54%、57.64%和62.01%，組間含量均值差異顯著(P<0.05)。其次，在18種游離氨基酸中絲氨酸、半胱氨酸、精氨酸和賴氨酸含量在3個類型茶鮮葉間無顯著差異。

1～18分別表示天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。圖1 游離氨基酸HPLC-FLD檢測色譜Fig.1 Chromatogram of free amino acid detected by HPLC-FLD

茶鮮葉中游離氨基酸含量是決定干茶茶湯鮮爽味品質的關鍵。根據氨基酸單體化合物的感官呈味特性，可分為甜味氨基酸、苦味氨基酸和鮮味氨基酸[9]。表1顯示，喬木型古茶樹、灌木型古茶樹及福鼎大白鮮葉中3種滋味屬性的氨基酸含量存在差異。古茶樹茶鮮葉中以鮮味氨基酸為主，苦味氨基酸和甜味氨基酸次之。在3種樹型古茶樹鮮葉中，喬木型古茶樹鮮葉甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量最低，苦味氨基酸含量最高，灌木型古茶樹鮮葉中甜味氨基酸含量最高，苦味氨基酸含量最低，而福鼎大白鮮葉則含有豐富的鮮味氨基酸。茶鮮葉中鮮味、苦味和甜味氨基酸含量的占比差異，可為鮮葉的適制性提供參考，同時為工藝參數(如干燥溫度、發(fā)酵時間)的選擇提供理論依據。

表1 不同樹型古茶樹鮮葉游離氨基酸含量

2.2 不同樹型古茶樹干茶游離氨基酸含量差異

表2顯示，干茶中游離氨基酸總量最高的是福鼎大白，其次為灌木型古茶樹干茶，最低的為喬木型古茶樹干茶。古茶樹干茶中含量較多的氨基酸分別是茶氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸。根據滋味的呈味屬性，喬木型干茶中甜味、鮮味、苦味氨基酸含量分別占總游離氨基酸含量的16.32%、58.03%、25.66%；灌木型干茶中甜味、鮮味、苦味氨基酸含量分別占總游離氨基酸含量的16.61%、62.90%、20.07%；福鼎大白干茶中甜味、鮮味、苦味氨基酸含量分別占總游離氨基酸含量、氨基酸含量的16.22%、64.79%、18.99%。干茶中甜味、鮮味、苦味3類氨基酸含量占比差異可能是影響茶湯品質的潛在原因，感官審評結果表明，古茶樹茶湯滋味鮮甜醇厚特征突出，福鼎大白干茶則保留了更多的甜味氨基酸、鮮味氨基酸和較少的苦味氨基酸，體現出甜醇滋味特征。灌木型干茶中甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量介于喬木型和福鼎大白干茶之間。

表2 不同樹型古茶樹干茶游離氨基酸含量

2.3 加工對古茶樹紅茶游離氨基酸含量的影響

茶葉加工影響風味物質的代謝進而形成其獨特風味品質。圖2顯示了鮮葉-干茶中總游離氨基酸和茶氨酸含量的方差分析結果。在相同加工工藝條件下，總游離氨基酸含量在鮮葉樣中存在一定組間差異，然而總游離氨基酸含量在干茶樣品組間差異則不明顯(P>0.05)。鮮葉中的絲氨酸、半胱氨酸、精氨酸和賴氨酸含量均值無顯著差異(P>0.05)，干茶中絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和谷氨酸含量均值無顯著差異(P>0.05)(表2)，表明通過紅茶加工處理促進了喬木型和灌木型古茶樹鮮葉中各氨基酸含量向無差異趨勢變化，從而使風味品質呈現相似性。其次，根據氨基酸滋味屬性分類結果，加工處理后甜味氨基酸和苦味氨基酸含量在3種類型古茶樹干茶中無顯著差異。表明加工可改變游離氨基酸含量，從而使得干茶滋味表現出一定穩(wěn)定性。

圖2 鮮葉和干茶中茶氨酸和總游離氨基酸含量Fig.2 Theanine and total free amino acid contents in fresh and dry tea leaves

干茶加工過程中茶鮮葉中游離氨基酸含量逐漸減少，但對不同滋味屬性的氨基酸影響存在差異。由圖2可知，喬木型和灌木型古茶樹鮮葉經加工處理均使鮮味氨基酸(茶氨酸)含量減少，其中對灌木型古茶樹中的茶氨酸含量具有顯著影響。加工對甜味氨基酸和苦味氨基酸含量的影響則無規(guī)律。對比鮮葉與干茶不同滋味屬性氨基酸含量差異可知，對于甜味氨基酸來說，加工未顯著改變半胱氨酸、甘氨酸含量，但使得絲氨酸、脯氨酸含量極顯著增加；對苦味氨基酸來說，干茶樣品中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和賴氨酸含量極顯著增加，但對精氨酸含量的影響則不顯著。

為明確喬木型、灌木型和福鼎大白在加工前后，即鮮葉和干茶中游離氨基酸含量的變化差異，以22個氨基酸的含量作為變量和鮮葉樣品氨基酸含量、干茶樣品氨基酸含量構建主成分分析(Principal component analysis, PCA)模型。圖3A為3種類型鮮葉的主成分得分圖，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的解釋方差分別是39.852%和23.954%。16份樣品(圖中包括每一樣品的3次技術重復數據)在該二維坐標中得到了較好的聚類，且存在明顯的分離界限。圖3B為前2個主成分的載荷得分結果，解釋了圖3A中喬木型、灌木型和福鼎大白鮮葉樣品的聚類原因，即由于3類鮮葉樣品貢獻前2個主成分的氨基酸含量差異，進一步分析旋轉后的分矩陣可知，PC1的解釋方差主要是由纈氨酸、異亮氨酸、甜味氨基酸總量、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸貢獻，PC2解釋方差則由組氨酸、谷氨酸、苦味氨基酸總量、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸和蘇氨酸貢獻。圖3C顯示，由于干茶樣品經過加工后，樣品內游離氨基酸變化趨于一致，導致樣品在PC1和PC2的二維空間重疊，無明顯的聚類分離輪廓。其次，灌木型和喬木型古茶樹干茶樣品相較于福鼎大白干茶樣品體現出較為分散的特征。干茶樣品主成分分析結果表明，通過圖3D中前2個主成分載荷得分，難以實現樣品的聚類(圖3C)，即樣品在22個變量中的整體差異不明顯。

Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸；Glu、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、The、Cys、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe、SweetAA、BitterAA、UmamiAA和TotalAA分別是谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鮮味氨基酸和總游離氨基酸。圖3 鮮葉樣品氨基酸含量主成分得分(A)和載荷得分(B)、干茶樣品主成分得分(C)和載荷得分(D)Fig.3 Principal component score plot (A) and loading score plot (B) for amino acid contents in fresh leaves, principal component score plot (C) and loadings score plot for amino acid contents in dry tea

3 討論與結論

古茶樹生境和園藝措施是影響其茶鮮葉游離氨基酸積累的潛在因素。茶鮮葉中氨基酸、兒茶素等特征代謝物積累受到茶樹施肥、采摘和修剪等園藝措施影響[17-18]，本研究發(fā)現喬木型古茶樹主要以單株形式生長且經歷園藝措施影響最小，主要受采摘影響，修剪和施肥等管理措施較少，而灌木型古茶樹和福鼎大白茶樹受到人工管理影響較為頻繁，因此推測園藝措施影響是導致古茶樹鮮葉游離氨基酸積累差異的主要原因。其次，不同古茶樹類群生化成分含量的變異系數較大[19-21]，喬木型古茶樹由于單株生長環(huán)境等差異，各單株茶鮮葉游離氨基酸含量存在較大的差異[22]。本研究的主成分分析結果亦表明，3種類型的茶鮮葉呈現較好的聚類分離特征，進一步說明生境和園藝措施差異影響了古茶樹游離氨基酸的積累。

加工可以改善茶鮮葉品質差異從而塑造干茶相似品質。萎凋、揉捻和發(fā)酵過程中茶鮮葉受到水分、機械損傷等脅迫，促進蛋白質水解，有利于氨基酸含量增加。干燥過程，由于受到溫度作用，游離氨基酸發(fā)生降解，其含量逐漸減少，使得茶湯鮮甜滋味減弱，影響茶湯品質。已有研究結果表明，茶氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸等氨基酸參與香氣的形成且呈現烘烤味和花香[9]，與福鼎大白干茶相比，古茶樹干茶表現出的木香感官特征是值得關注的，已有研究結果表明，存放陳化可能是形成紅茶木香的潛在因素[23]，而是否有游離氨基酸參與形成木香尚不清楚。另一方面，古茶樹干茶滋味整體呈甜醇味。已有研究結果表明，鮮葉經加工后多糖(蔗糖)水解為單糖(如葡萄糖、果糖)是貢獻紅茶茶湯甜味的潛在因素[7]。其次，灌木型古茶樹鮮葉經過加工，總兒茶素含量減少，顯著減少苦澀味物質的積累[8]。甜味氨基酸和鮮味氨基酸具有協同增強茶湯鮮甜、拮抗苦澀味的作用[24-25]，本研究對象福鼎大白干茶中鮮味氨基酸含量占比高于灌木型和喬木型古茶樹干茶，結合感官審評結果可推測游離氨基酸亦是貢獻茶湯甜醇滋味的重要物質。由于茶湯滋味是茶葉中浸出物質共同作用的結果，目前基本明確各主要物質的滋味屬性[26-27]，但對于貢獻茶湯甜醇滋味的關鍵化合物仍需要進一步的分子感官試驗確定。

綜上，采用HPLC-FLD方法能實現茶鮮葉和干茶中18種游離氨基酸的靶向檢測?；谥鞒煞址治龅然瘜W計量學方法可實現對樣品的聚類，不同類型茶鮮葉游離氨基酸含量存在一定差異，通過加工工藝處理可弱化這一含量差異，從而塑造相似的干茶品質。本研究結果增進了對不同樹型古茶樹鮮葉游離氨基酸積累差異的認識，為不同樹型古茶樹紅茶品質形成提供一定理論依據。