張敬峰， 董永毅， 盧鳳英， 劉青濤， 徐 彬， 趙 莎， 孫華偉， 吳 坤， 張小飛

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)診斷檢測中心，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210036)

鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里氏桿菌(Rimerellaanatipestifer，RA)引起的一種接觸性傳染病，多發(fā)于1～8周齡鴨，可導(dǎo)致大批鴨發(fā)病死亡以及生長遲緩[1]。鴨傳染性漿膜炎不但常見于肉鴨各個生長階段，還會引起成年蛋(種)鴨發(fā)病，造成較大的經(jīng)濟損失，是目前危害中國鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要細菌性疾病之一。RA在自然界尤其是鴨場廣泛分布，其血清型較為復(fù)雜，在世界范圍內(nèi)存在20余種[2]，不同血清型及同型的不同毒株間毒力與免疫保護率有較大差異。中國目前流行的RA血清型主要以1型為主，也有2型、3型等報道。由于一般的鴨場、設(shè)施以及飼養(yǎng)方式相對落后，加之RA易形成耐藥性，而上市的含某些RA血清型滅活疫苗因不同地區(qū)流行菌株的不同往往臨床應(yīng)用效果不佳，導(dǎo)致該病的防控較為困難。

本研究對2019年7月-2020年6月在江蘇省、山東省等不同地區(qū)32個規(guī)模鴨場采集分離的RA菌株進行相關(guān)生物學(xué)特性研究，了解上述地區(qū)RA感染的優(yōu)勢血清型情況，并針對分離的1型RA流行菌株進行交叉攻毒保護等免疫原性研究，以期對RA的疫苗研發(fā)以及科學(xué)免疫防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與實驗動物

病料樣品為無菌采集的發(fā)病/死亡鴨腦、肝臟等組織。7日齡健康非免疫鴨(經(jīng)間接血凝法測定血清1型RA抗體為陰性)來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院句容黃梅動物實驗基地。

1.2 主要試劑

TSA、TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司，馬丁氏湯培養(yǎng)基購自北京奧博星公司，新生牛血清購自呼和浩特草原綠野公司，DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司，SS、MAC培養(yǎng)基、微量生化發(fā)酵管等均購自杭州微生物試劑公司。1型、2型RA標(biāo)準陽性血清由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，礦物油佐劑由南京兆豐華生物科技公司提供。

1.3 細菌分離及形態(tài)觀察

無菌操作挑取病死鴨腦組織、心血等病料接種于MAC平板、TSA平板(含2%新生牛血清)以及SS平板，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察細菌生長及菌落特征，選取典型菌落分別進行純培養(yǎng)，挑取符合特征的單菌落，革蘭氏染色并觀察其形態(tài)。

1.4 分離菌PCR鑒定

參照文獻[3]方法合成RA 16S rRNA鑒定引物，對各分離菌DNA進行 PCR 擴增，電泳觀察分析PCR產(chǎn)物后由南京金斯瑞公司測序。運用BLAST將測序結(jié)果與GenBank上登錄的RA進行基因序列比對分析[4]。

1.5 分離菌生化試驗

按照微量生化反應(yīng)試劑盒說明書，對各株分離純培養(yǎng)物進行生化試驗。

1.6 細菌血清型鑒定

載玻片上各滴加生理鹽水20 μl，用接種環(huán)分別挑取方法1.3中純化培養(yǎng)的各菌株菌落2～3個，在水中混勻后，滴加1型或2型RA陽性血清20 μl，混勻，進行凝集法血清分型鑒定。

1.7 分離株致病性試驗

1.7.1 菌液制備 分別挑取5株RA1分離株(JP01、JP02、SD02、GY01、XZ01)單菌落各接種于5 ml改良馬丁湯培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫箱振蕩培養(yǎng)24 h。對培養(yǎng)物進行活菌計數(shù)后用無菌生理鹽水稀釋成約2.0×109CFU/ml菌液備用。

1.7.2 動物回歸試驗 取上述配制好的菌液，頸部皮下注射15日齡健康非免疫鴨各10只，每只注射1 ml，另設(shè)空白對照5只。連續(xù)觀察10日，記錄試驗鴨發(fā)病、死亡等情況，剖檢觀察病理變化。參照方法1.3～1.6分別對回收細菌進行鑒定。

1.7.3 最小致病劑量的測定 根據(jù)方法1.7.2結(jié)果，選擇其中3株致病力較強的RA1分離菌株，將其培養(yǎng)物分別稀釋為2.0×109CFU/ml，再作2倍、5倍、20倍、100倍稀釋，各稀釋液分別取1 ml皮下注射15日齡健康非免疫鴨。其中試驗組鴨分為4組，每組5只，另5只作為陰性對照。接種后連續(xù)觀察10 d，根據(jù)各組鴨發(fā)病及死亡情況統(tǒng)計出致實驗鴨全部發(fā)病的最小劑量。

1.8 不同分離株免疫原性測定

1.8.1 疫苗制備 將RA1分離株JP01、SD02、GY01分別接種含2%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)。按體積加入0.2%甲醛，37 ℃滅活24 h，經(jīng)滅活檢驗合格后做為水相，按水相∶油相為1.0∶2.5(體積比)分別制備疫苗，使3個菌株疫苗的最終含菌量均為3.0×109CFU/ml左右。

1.8.2 分組與免疫 將60只7日齡健康非免疫鴨平均分為4組，其中3個組為免疫組，1個組為對照組，每組15只。分別頸背部皮下注射JP01、SD02、GY01菌株滅活疫苗，每羽0.3 ml。另設(shè)一組注射同劑量生理鹽水作為對照。

1.8.3 交叉攻毒保護試驗 上述實驗鴨免疫后14 d，進行交叉攻毒試驗。將每一組實驗鴨(包括免疫組和對照組)平均分為3組，每組5只，分別用JP01、SD02、GY01菌株最小致病劑量菌液(1只1 ml)進行皮下接種攻毒。在攻毒后10 d內(nèi)，連續(xù)觀察，記錄發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品的細菌分離及形態(tài)鑒定

病料樣品接種培養(yǎng)24 h后，23株分離菌中有16株在MAC平板、SS平板上未見細菌生長，但在含2%新生牛血清TSA培養(yǎng)基上生長出大小均勻的小菌落，呈圓形、微突起，直徑約1～2 mm。16株細菌均為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，多為單個排列，培養(yǎng)及形態(tài)符合RA菌落特征[1]。

2.2 分離菌株的PCR鑒定

16S rRNA特異性引物PCR結(jié)果顯示，16個菌株均可擴增出與目的片段800 bp大小一致的條帶。將擴增產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank中進行比對分析，結(jié)果表明與登錄的RA相應(yīng)基因序列同源性均≥99%。根據(jù)分類標(biāo)準，確定該16株分離菌為 RA。

2.3 分離菌株的生化特性

16個RA分離株均不發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、果糖、蔗糖等多種碳水化合物，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，產(chǎn)生硫化氫，甲基紅(MR)試驗陰性，觸酶試驗陽性。生化特性均符合RA特征[1]。

2.4 分離菌株的血清型

16個分離株中有11株與1型RA標(biāo)準陽性血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，與2型RA標(biāo)準陽性血清均不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，表明該11株分離菌為血清1型RA(表1)。

表1 16株RA分離鑒定結(jié)果

2.5 RA分離株的致病性

動物回歸試驗結(jié)果(表2)顯示，5株RA1分離株菌液(約2.0×109CFU/ml)分別皮下接種15日齡非免疫鴨后24 h均引起實驗鴨發(fā)病和死亡。其中有3株RA1分離株JP01、GY01、SD02發(fā)病率和死亡率較高，達到80%～100%，為強毒力菌株；2株RA1分離株JP02、XZ01引起部分鴨發(fā)病和死亡，死亡率為40%～60%，為中等毒力菌株。發(fā)病鴨死亡前期可見精神沉郁、臥地不起、食欲廢絕、眼瞼流淚等癥狀。死亡鴨剖檢觀察顯示：24 h內(nèi)死亡的實驗鴨無明顯病理變化；24～72 h死亡鴨部分肝臟出血，大部分死亡鴨心臟、肝臟表面有灰白色纖維素性滲出物，形成包膜；從病死鴨腦部、肝臟均分離回收到 1 型 RA。

表2 RA1動物回歸試驗結(jié)果

5株RA1分離株最小致病劑量測定結(jié)果(表3)顯示，3株分離強毒力菌株(JP01株、GY01株、SD02株)引起實驗鴨全部發(fā)病的最小致病劑量分別為1.0×108CFU、4.0×108CFU、1.0×109CFU，JP01株毒力最強，其次為GY01、SD02株。

表3 RA1對鴨的最小致病劑量

2.6 RA1分離株的交叉免疫保護特性

將制備的JP01、GY01、SD02株滅活疫苗免疫7日齡實驗鴨14 d后，連同對照組鴨分別用各菌株的最小致病劑量菌液進行交叉攻毒。結(jié)果(表4)顯示：各對照組鴨于攻毒后24 h均陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病、死亡；各免疫組整體精神狀態(tài)良好，于攻毒后48 h出現(xiàn)部分實驗鴨發(fā)病及死亡。統(tǒng)計結(jié)果表明：以JP01株滅活疫苗免疫組保護率最高，為100%保護；GY01株滅活疫苗保護率為60%～80%，SD02株滅活疫苗保護率為40%～80%。由此可見，JP01株滅活疫苗免疫交叉攻毒保護性能優(yōu)于GY01、SD02株滅活疫苗，對RA1具有良好的免疫原性。

表4 3株RA1分離株滅活疫苗免疫攻毒保護試驗結(jié)果

3 討 論

本研究自2019年7月至2020年6月從江蘇省、山東省等同地區(qū)規(guī)模鴨場分離到16株RA,其中11株為RA1型，占RA分離株的68.7%。中國在1997年之前，除了RA1型外，幾乎沒有關(guān)于其他血清型的報道[5]。隨后幾年間，張大丙等[6]在中國部分地區(qū)分離到2型、6型、10型、11型、13型等多種血清型。2003年程安春等[7]報道在全國29個省(市、自治區(qū))病死鴨中分離到1 842株RA，包括17個血清型，其中RA1型占比為34.9%，為主要血清型。至今鮮見國內(nèi)大范圍的RA血清型調(diào)查研究報道。2013年劉運鎮(zhèn)等[8]報道在江蘇省多地分離的41株RA菌株中29株為1型，占分離RA的70.7%。2015-2016年袁小遠等[9]在山東省等地分離的18株RA菌株全部為1型。2018-2019年王昊等[10]在江蘇省蘇北及周邊地區(qū)分離的30株RA菌株中15株為1型，占分離RA的50%。以上三者報道與本研究RA1分離情況相似，說明RA1仍然是江蘇省、山東省等省份鴨場流行的優(yōu)勢血清型。

RA血清型的準確鑒定對于獲取流行病學(xué)資料以及免疫防治極其重要。自Harry[11]采用凝集試驗進行RA血清型鑒定至今，該方法已成為RA菌株分型的主要手段。國際上雖就RA血清型的命名形成了統(tǒng)一認識[12]，但因國內(nèi)近年來缺乏系統(tǒng)性的標(biāo)準血清相關(guān)研究，傳統(tǒng)的分型方法受標(biāo)準血清來源以及抗原差異等影響，導(dǎo)致存在某些血清分型上的混淆現(xiàn)象，給RA的免疫防控等造成了一定干擾。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于RA分子學(xué)分型等方法研究也逐漸豐富[13]，期望能夠盡快得到廣泛應(yīng)用。

鴨傳染性漿膜炎在中國被發(fā)現(xiàn)以來，已成為危害鴨乃至水禽養(yǎng)殖業(yè)最主要的細菌性疾病。2019年張敬峰等[14]報道顯示鴨疫里氏桿菌陽性率占所檢測的水禽5種主要細菌性病原的36.01%，其感染發(fā)病在臨床最為常見。由于近年來水禽養(yǎng)殖過程中抗菌藥的頻繁使用以及耐藥菌株不斷產(chǎn)生等因素，導(dǎo)致在鴨細菌性疾病尤其是鴨傳染性漿膜炎的臨床藥物治療效果越來越差，而藥物殘留也威脅人類健康，影響公共衛(wèi)生安全[15]。防控該病除加強生物安全管理等措施外，疫苗免疫是較為有效的手段,但RA血清型眾多且各血清型之間的交叉保護作用差[16],血清型的多樣化分布也直接制約了疫苗的免疫效果發(fā)揮。本研究選取RA1流行株對雛鴨進行免疫保護試驗，從結(jié)果可看出各受試菌株制備的滅活疫苗免疫實驗鴨后，各菌株對同型同源的交叉保護率均為80%以上，部分菌株對同型不同源的交叉免疫保護率相對較低，其中SD02菌株滅活疫苗保護率僅40%～80%，也有如JP01菌株滅活疫苗對同型菌株的攻擊顯示出良好的免疫保護率(100%)。提示在商品化RA滅活疫苗制備時除應(yīng)考慮不同血清型RA的存在與分布差異，還應(yīng)在地區(qū)優(yōu)勢血清型中選擇對同型菌株免疫率較高的代表性菌株滅活疫苗。