宋 剛， 方志剛， 王玉龍， 蔡慶生

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，江蘇 句容 212400； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 3.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844099)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)是所有真核生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的分泌場(chǎng)所，其介導(dǎo)了蛋白質(zhì)合成、折疊和組裝，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)新生蛋白質(zhì)的質(zhì)量[1]。在ER腔體空間內(nèi)，由駐留的分子伴侶蛋白執(zhí)行這些任務(wù)和功能，如屬于熱激蛋白70家族(Hsp70)的免疫重鏈綁定蛋白(BiP)。為了維持ER功能的精確性，細(xì)胞演化出一種蛋白質(zhì)監(jiān)控信號(hào)通路——未折疊蛋白應(yīng)答途徑 (UPR)[2-4]。ER系統(tǒng)在遭受外來(lái)脅迫(如高溫、干旱、鹽害等)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白，發(fā)生ER脅迫，此時(shí)細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)UPR[5]。為恢復(fù)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的平衡，植物細(xì)胞需要通過(guò)上調(diào)編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶的基因來(lái)重建蛋白質(zhì)折疊能力和需求之間的平衡，BiP即為這些基因之一[6]。類似Hsp70家族中其他同源蛋白，BiP具有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域： N端相對(duì)分子質(zhì)量大約44 000的ATP綁定結(jié)構(gòu)域(ABD)，C端相對(duì)分子質(zhì)量大約16 000的多肽綁定結(jié)構(gòu)域(PBD)。PBD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與未折疊蛋白質(zhì)底物結(jié)合，并受與ABD結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核苷酸調(diào)控[7]。BiP還包括一個(gè)C端ER駐留信號(hào)(ER retention signals)，功能是使蛋白質(zhì)留在ER內(nèi)腔，在植物中其氨基酸序列通常是“HDEL”，在哺乳動(dòng)物中是“KDEL”[8]。BiP在酵母和哺乳動(dòng)物中是單個(gè)存在的，但在高等植物中是小且高度保守的基因家族并且分散在基因組內(nèi)，如大豆中含2個(gè)[9]，擬南芥[10]、小麥[11]和辣椒[12]中都含有3個(gè)，煙草[13]和水稻[14]中則均含有6個(gè)。研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)BiP能增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。大豆BiP在煙草[15]和大豆[16]中的過(guò)表達(dá)，通過(guò)防止內(nèi)源性氧化應(yīng)激，賦予轉(zhuǎn)基因植物抗旱性。過(guò)表達(dá)辣椒CaBiP1的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株自身降低了活性氧積累量，增加了保水性，刺激UPR通路和相關(guān)應(yīng)激基因的表達(dá)，提高了對(duì)多個(gè)環(huán)境脅迫的耐受性，包括熱、滲透、鹽和干旱[17]。此外，枸杞LcBiP在煙草中過(guò)表達(dá)提升了煙草對(duì)重金屬Cd的耐受性[18]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)為原產(chǎn)于北美的多年生暖季C4型禾本科植物，根系發(fā)達(dá)，抗旱能力強(qiáng)，產(chǎn)量高，適合在邊際土地中生長(zhǎng)[19-20]。由于低成本和高生物量，尤其纖維素含量高，使其成為理想的生物質(zhì)能源植物[21]。研究指出，在重金屬污染尤其是Cd污染土地上種植柳枝稷為代表的能源植物可實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與污染土地利用的雙贏[22]，因此提升柳枝稷對(duì)重金屬Cd的耐受性就顯得尤為重要。植物BiP基因在細(xì)胞中響應(yīng)UPR，逆境條件下表現(xiàn)出多樣化功能，可作為柳枝稷提升耐性的候選基因，但關(guān)于柳枝稷BiP基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)柳枝稷BiP基因進(jìn)行鑒定，分析非生物脅迫下BiP基因的表達(dá)模式和功能，為柳枝稷分子改良，提升其對(duì)重金屬尤其Cd的耐受性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試驗(yàn)處理

選取大小一致、均勻飽滿的柳枝稷品種Alamo種子在50%的硫酸中浸泡(搖床振蕩)20 min，用去離子水沖洗干凈，再用70%乙醇溶液浸泡30 min，用去離子水沖洗干凈，播種于盛有去離子水的培養(yǎng)盒水面的塑料濾網(wǎng)上發(fā)芽，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，相對(duì)濕度70%，光照每天12 h。待柳枝稷發(fā)芽生長(zhǎng)至3張幼葉時(shí)，將大小一致的健壯幼苗轉(zhuǎn)移至塑料燒杯中水培，培養(yǎng)條件設(shè)置為：溫度30 ℃(日)/20 ℃(夜)，光周期14 h(日)/10 h (夜)。培養(yǎng)過(guò)程中每隔1 d調(diào)整燒杯的位置，降低邊緣效應(yīng)[23]。

待植株生長(zhǎng)至5張全展葉時(shí)用0.1 mmol/L脫落酸(ABA)和15.0 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)噴施處理，以正常生長(zhǎng)植株為對(duì)照，在噴施處理后0 h、3 h、6 h、12 h和24 h分別采集葉片為樣品。對(duì)幼苗分別用 200 mmol/L NaCl、200 g/L聚乙二醇(PEG)、50 μmo/L CdCl2水溶液培養(yǎng)，進(jìn)行鹽脅迫、干旱滲透脅迫和重金屬Cd脅迫處理，處理后在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行全株采樣[24]。樣品經(jīng)液氮速凍后存放于-80 ℃用于RNA提取。本試驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和2個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)試劑、菌株和載體

實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒Roche SYBR GREEN Master(ROX)購(gòu)自羅氏(Roche)公司，T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司，植物RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司，其他化學(xué)試劑與耗材統(tǒng)一購(gòu)自南京壽德實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

大腸桿菌菌株DH5α、酵母菌株YCF1、G19、HOG1以及入門(mén)載體pEND-linker和酵母表達(dá)載體pGAD426均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草坪生理生化實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.3 生物信息學(xué)分析

柳枝稷參考基因組數(shù)據(jù)下載自植物基因組網(wǎng)站Phytozome(http://phytozome.jgi.doe.gov/，PanicumVirgatum_516_ V5.1)，從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索BiP蛋白并下載序列，將下載序列與柳枝稷蛋白質(zhì)序列進(jìn)行本地BLAST比對(duì)。比對(duì)上的序列通過(guò)CDD(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)檢索是否具有GPR78/BiP/KAR2保守結(jié)構(gòu)域(KOG數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)KOG0100)[25]，如有則為BiP候選序列。再檢查候選序列C端是否含有ER駐留信號(hào)序列“HDEL”以確定BiP。使用在線工具PROTPARAM (http://web. expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)分析BiP蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列大小、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸殘基的疏水性。用WOLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽位點(diǎn)。多序列比對(duì)采用MEGA 7.0完成，通過(guò)MEGA 7.0構(gòu)建多物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Neighbor-joining method，bootstrap=1 000)。使用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/)網(wǎng)站鑒定 PvBiPs的保守基序(motif)，motif的最大數(shù)目設(shè)定為10個(gè)，motif長(zhǎng)度為6～100 個(gè)氨基酸，其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置。從柳枝稷基因組注釋文件中提取出BiP基因的注釋信息，導(dǎo)入Gene Structure Display Server (GSDS)網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。提取PvBiPs上游2 kb啟動(dòng)子序列，使用PlantCARE v1.0 (http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行順式作用元件分析。

1.4 植物基因組DNA和總RNA提取、cDNA合成與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取柳枝稷新鮮植物組織0.1 g，用植物基因組DNA提取試劑盒[原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品]提取gDNA。取柳枝稷幼苗全株樣100 mg并用液氮速凍，使用OMEGA E.Z.N.A.? plant RNA Kit提取植物總RNA。以2 μg總RNA為模板，使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

利用在線引物設(shè)計(jì)工具(http://www.genscript.com/tools.html#biology)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列見(jiàn)表1，內(nèi)參基因使用PvFTSH4[26]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green I Master 10.0 μl、cDNA 2.5 μl、Genen specific primersf(F/R) 2.5 μl，添加ddH2O至20.0 μl。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，熒光信號(hào)檢測(cè)， 40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)在Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems,Foster City,CA,USA) 上進(jìn)行，每個(gè)處理設(shè)置3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)和2次技術(shù)重復(fù)取樣，采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 柳枝稷PvBiP基因克隆、酵母異源表達(dá)與抗性分析

根據(jù)PvBiP基因編碼序列(Coding sequence，CDS)，設(shè)計(jì)合成引物(表1)，以gDNA為模板，通過(guò)Q5高保真DNA聚合酶擴(kuò)增獲得目的基因片段，PCR反應(yīng)體系為：Q5 Reaction buffer 10.0 μl、Q5 GC Enhancer 10.0 μl、dNTPMix 4.0 μl、Template gDNA 4.0 μl、F + R (2.5 μl +2.5 μl)、Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.5 μl，添加ddH2O至50.0 μl 。反應(yīng)程序?yàn)椋?98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s，63 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，10 ℃，10 min。用E.Z.N.A Gel Extraction Kit-Spin試劑盒回收產(chǎn)物。將雙酶切后的入門(mén)載體pEND-linker與PvBiP目的基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。選取與目標(biāo)條帶大小一致的菌液提取質(zhì)粒，送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

提取測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶PvuⅠ進(jìn)行線性化處理。將目的片段與表達(dá)載體pGAD426進(jìn)行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，根據(jù)載體大小和通過(guò)PCR檢測(cè)的情況，確定重組反應(yīng)得到正確的表達(dá)載體并提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。制備鹽敏感酵母菌株G19、Cd敏感酵母菌株YCF1和旱敏感酵母菌株△HOG1感受態(tài)細(xì)胞并加入表達(dá)載體pGAD426-PvBiP質(zhì)粒和pGAD426-GUS對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的含PvBiP1a、PvBiP2和PvBiP3的酵母菌株單一克隆在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至平臺(tái)期(OD600=1)，然后使用無(wú)菌水將菌液按10倍、100倍和1 000倍梯度稀釋，分別取5 μl菌液按濃度依次點(diǎn)在對(duì)照和處理平板上培養(yǎng)，脅迫處理分別使用300 mmol/L NaCl、0.5 mol/L甘露醇和100 μmol/L CdCl2。5～6 d后觀察酵母表型并采集照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳枝稷PvBiP基因的鑒定

在NCBI網(wǎng)站共檢索并下載到23個(gè)不同物種(煙草、擬南芥、水稻、玉米、大豆、石榴等)中報(bào)道的BiP蛋白序列，與柳枝稷參考基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST比對(duì)，候選序列有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的取1號(hào)轉(zhuǎn)錄本，再經(jīng) “KOG0100”結(jié)構(gòu)域和 “HDEL”2個(gè)篩選條件，共篩選出4個(gè)BiP基因，分別位于柳枝稷基因組chr01K、chr01N、chr05K、chr05N染色體上，蛋白質(zhì)理化信息及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)信息見(jiàn)表2。由于Pavir.1KG020800.1和Pavir.1NG010600.1的蛋白質(zhì)序列、理化參數(shù)完全一致，CDS也只有微小差異，因此將它們分別命名為PvBiP1a和PvBiP1b，分別把Pavir.5KG300400.1與Pavir.5NG387200.2命名為PvBiP2和PvBiP3。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)基因均定位在ER，所含信號(hào)肽(Signal peptide，SP)分別由23個(gè)、25個(gè)、23個(gè)和27個(gè)氨基酸殘基組成。

表2 柳枝稷BiP基因特征和亞細(xì)胞定位信息

2.2 柳枝稷PvBiP基因的生物信息學(xué)分析

使用水稻[14]、擬南芥[10]、枸杞[18]、大豆[9]、石榴[14]、煙草[14]等BiPs與PvBiPs蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖1)。進(jìn)化樹(shù)顯示，PvBiP1a和PvBiP1b聚為一個(gè)分支，這與2個(gè)基因編碼相同的氨基酸序列相吻合。另外，它們與水稻OsBiP1的進(jìn)化關(guān)系最近。PvBiP2、PvBiP3與水稻OsBiP3、OsBiP4、OsBiP5的遺傳距離較近。

bootstrap=1 000，括號(hào)內(nèi)為GenBank登錄號(hào)。圖1 Neighbor-joining法構(gòu)建的柳枝稷與不同植物BiP 同源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of BiP homologous proteins between different plant species and switchgrass by neighbor-joining method

多物種同源序列比對(duì)結(jié)果(圖2)顯示，4個(gè)PvBiPs與7個(gè)同源BiPs的保守結(jié)構(gòu)域domain1～domain5以及5個(gè)高度保守氨基酸殘基組成上高度一致，domain 6(HDEL)組成全部一致。 motif分析發(fā)現(xiàn)，在4個(gè)PvBiPs中10個(gè)motif的分布完全相同(圖3a)，domain1 序列“TVIGIDLGTTYSC”是Hsp70家族成員中普遍存在的高度保守序列[27]，位于motif 2 N端，為β-磷酸化結(jié)合功能區(qū)。Domain 2序列對(duì)應(yīng)motif 4 N端，為γ-磷酸化結(jié)合功能區(qū)，domain 3(腺苷酸結(jié)合功能區(qū))位于motif 3 N端，domain 4(鈣調(diào)素蛋白結(jié)合功能區(qū))位于motif 5 N端[25]。C端5個(gè)高度保守的氨基酸殘基，能促進(jìn)與多肽底物氫鍵的結(jié)合[5-6]，還有重要的α或β多肽底物結(jié)合基序domain 5(位于motif 7和motif 9)，能確保初始多肽底物不從結(jié)合位置脫落釋放[11]。綜上，PvBiPs具有BiP結(jié)構(gòu)域且高度保守。

方框表示所對(duì)應(yīng)domain的氨基酸序列范圍，箭頭所指為高度保守氨基酸殘基。圖2 柳枝稷BiP與擬南芥、水稻和枸杞中同源蛋白多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of the BiP of switchgrass with BiP homologous proteins of Arabidopsis, rice and Lycium chinense

基因結(jié)構(gòu)(圖3b)顯示，PvBiP1a、PvBiP1b具有7個(gè)內(nèi)含子，PvBiP2、PvBiP3沒(méi)有內(nèi)含子。PvBiPs上游2 kb啟動(dòng)子序列分析結(jié)果(表3)顯示,它主要包括響應(yīng)非生物脅迫相關(guān)和激素應(yīng)答2類順式作用元件，這些元件包括：響應(yīng)低溫脅迫的 LTR 元件、響應(yīng)干旱脅迫的MBS元件、與機(jī)械損傷有關(guān)的 WUN-motif元件、植物響應(yīng)脅迫和防御的TC-rich repeats元件、響應(yīng)脫落酸作用的ABRE元件、參與厭氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的ARE元件、與缺氧特異性誘導(dǎo)有關(guān)的增強(qiáng)因子GC-motif元件、響應(yīng)生長(zhǎng)素的TGA-element元件、參與水楊酸反應(yīng)的TCA-element元件、參與赤霉素響應(yīng)調(diào)節(jié)的TATC-box元件、參與生長(zhǎng)素響應(yīng)調(diào)節(jié)的AuxRR-core元件、參與茉莉酸甲酯響應(yīng)調(diào)節(jié)的CGTCA-motif元件和TGACG-motif元件。

CDS:編碼序列；UTR：非翻譯區(qū)；Intron:內(nèi)含子。圖3 柳枝稷BiP基因保守基序分布(a)和基因結(jié)構(gòu)(b)Fig.3 Distribution of conserved motifs (a) and gene structure (b)of BiPs in switchgrass

表3 柳枝稷BiP基因啟動(dòng)子區(qū)脅迫和激素相關(guān)順式作用元件

2.3 非生物脅迫對(duì)柳枝稷BiP基因表達(dá)的影響

二硫蘇糖醇(DTT)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)劑，能引起被處理對(duì)象發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫而激發(fā)UPR[28]。通過(guò)qPCR檢測(cè)柳枝稷幼苗經(jīng)15 mmol/L DTT 噴施處理后0～24 hPvBiPs的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果(圖4)表明，PvBiPs相對(duì)表達(dá)量總體呈現(xiàn)先下降后上升然后又下降的趨勢(shì)，到24 h時(shí)降至接近0 h的水平。各基因?qū)TT的響應(yīng)存在差異，PvBiP1a與PvBiP1b的相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)在12 h，PvBiP2、PvBiP3的相對(duì)表達(dá)量在3 h達(dá)到峰值，且與PvBiP1a、PvBiP1b的相對(duì)表達(dá)量相比更高，最高的是PvBiP2。

圖4 二硫蘇糖醇(DTT)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫下柳枝稷BiP基因的表達(dá)Fig.4 Expression of BiPs in switchgrass under endoplasmic reticulum stress induced by dithiothreitol (DTT)

用NaCl、PEG、ABA和CdCl2處理柳枝稷幼苗24 h，不同時(shí)間點(diǎn)PvBiPs相對(duì)表達(dá)量的變化如圖5所示。總體上PvBiPs的相對(duì)表達(dá)量是先上調(diào)后下降的趨勢(shì)。NaCl脅迫下，各基因相對(duì)表達(dá)量峰值基本出現(xiàn)在12 h。PEG滲透脅迫下，PvBiP1a相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)在6 h，比0 h處理上調(diào)6.2倍，PvBiP1b相對(duì)表達(dá)量上調(diào)5.6倍；PvBiP2相對(duì)表達(dá)量峰值表現(xiàn)在3 h，上調(diào)4.0倍，PvBiP3相對(duì)表達(dá)量峰值在12 h，上調(diào)4.7倍。ABA處理下，PvBiP2相對(duì)表達(dá)量的峰值在12 h ，上調(diào)9.0倍，明顯高于其他基因。CdCl2處理下，PvBiP2相對(duì)表達(dá)量峰值仍然出現(xiàn)在處理12 h，上調(diào)9.0倍，PvBiP3相對(duì)表達(dá)量的峰值在6 h，達(dá)到8.0倍。

圖5 NaCl、ABA、PEG和CdCl2脅迫處理下柳枝稷BiP基因的表達(dá)Fig.5 Expression of BiPs in switchgrass under NaCl stress, ABA stress, PEG stress and CdCl2 stress treatments

2.4 柳枝稷BiP基因克隆與酵母功能驗(yàn)證

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到PvBiP1a、PvBiP2和PvBiP3全長(zhǎng)，擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖6。

M:DL5 000 DNA Marker。圖6 PCR擴(kuò)增的PvBiP1、PvBiP2、PvBiP3基因的產(chǎn)物條帶Fig.6 Amplified product strips of PvBiP1, PvBiP2 and PvBiP3 genes amplified by PCR

將擴(kuò)增的PvBiP1(實(shí)際按PvBiP1a擴(kuò)增)、PvBiP2和PvBiP3產(chǎn)物經(jīng)同源重組分別連接到pGAD426酵母表達(dá)載體上 ，轉(zhuǎn)化酵母菌株。在100 μmol/L CdCl2SD/-Ura選擇培養(yǎng)基平板上，與對(duì)照pGAD426-GUS菌株比較，PvBiP1a、PvBiP2和PvBiP3過(guò)表達(dá)酵母菌株的生長(zhǎng)顯著增強(qiáng)(圖7a)，呈現(xiàn)出一定的耐Cd表型。在300 mmol/L NaCl SD/-Ura-His平板上，3個(gè)基因相比于對(duì)照鹽脅迫表現(xiàn)出明顯耐性，尤其PvBiP1a和PvBiP2的耐鹽表型更明顯(圖7b)。而0.5 mol/L甘露醇脅迫處理表型與對(duì)照間沒(méi)有明顯差異(圖7c)，說(shuō)明柳枝稷BiP基因可能對(duì)甘露醇模擬干旱脅迫響應(yīng)敏感。上述結(jié)果表明，酵母過(guò)表達(dá)PvBiPs后具有耐鹽和耐Cd脅迫的能力，但對(duì)滲透干旱脅迫較敏感，與對(duì)照表型基本一致。

a：CdCl2脅迫；b：NaCl脅迫；c：甘露醇脅迫。YCF1/pGAD426-GUS為空白對(duì)照Cd敏感酵母菌株，G19/pGAD426-GUS為空白對(duì)照鹽敏感酵母菌株、△HOG1/pGAD426-GUS為空白對(duì)照干旱敏感酵母菌株，其余為相應(yīng)處理轉(zhuǎn)基因酵母菌株。圖7 柳枝稷BiP基因在非生物脅迫下的酵母功能驗(yàn)證Fig.7 Yeast function verification of BiPs in switchgrass under abiotic stresses

3 討 論

四倍體柳枝稷具有2套亞基因組K和N，據(jù)推測(cè)它們來(lái)自1.00×106年前同源四倍體化事件的2個(gè)近親祖先[29-30]。本研究在柳枝稷基因組中共鑒定了4個(gè)BiP基因，分布在chr01K、chr01N和chr05K、chr05N 2對(duì)同源染色體上。序列比對(duì)結(jié)果表明,它們彼此相似度很高，尤其PvBiP1a和PvBiP1b編碼的氨基酸序列完全一致，可能是基因復(fù)制形成。柳枝稷BiPs和其他物種BiP序列高度相似，體現(xiàn)在具有相同保守結(jié)構(gòu)域，如domain 4是鈣調(diào)素結(jié)合基序，能與Ca2+結(jié)合蛋白質(zhì)起作用，調(diào)節(jié)N端ATP酶活性[11]，使ATP水解產(chǎn)能驅(qū)動(dòng)BiP在新生蛋白質(zhì)組裝過(guò)程中結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊的多肽底物[31]。另一必需腺苷結(jié)合功能域domain 3(motif 3 N端)和C端5個(gè)氫鍵結(jié)合氨基酸位點(diǎn)(V-T-Y-Q-S)則高度一致?；騼?nèi)含子結(jié)構(gòu)有3種模式：無(wú)內(nèi)含子、1個(gè)內(nèi)含子、超過(guò)1個(gè)內(nèi)含子[32]，研究結(jié)果證明，內(nèi)含子通過(guò)外顯子重組驅(qū)動(dòng)進(jìn)化[33]，對(duì)于含多個(gè)內(nèi)含子的基因，通過(guò)可變剪接實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因的多個(gè)蛋白質(zhì)翻譯，對(duì)基因功能具有重要影響[34-35]。如辣椒CaBiP1、CaBiP2有7個(gè)內(nèi)含子，CaBiP3有6個(gè)內(nèi)含子，CaBiP3的整體表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CaBiP1、CaBiP2，在鹽和高溫脅迫下，CaBiP3受誘導(dǎo)，表達(dá)量顯著高于CaBiP1、CaBiP2[17]。柳枝稷PvBiP1a、PvBiP1b內(nèi)含子為7個(gè)，PvBiP2、PvBiP3無(wú)內(nèi)含子，暗示它們可能存在功能分化上的差別。

研究結(jié)果表明，植物BiPs表達(dá)受組織特異性和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)[17,25,36]。分析數(shù)據(jù)庫(kù)(https://switchgrassgenomics.noble.org)中柳枝稷RNA-seq表達(dá)量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，PvBiP2在授粉后形成種子階段的表達(dá)量要明顯高于其他組織或發(fā)育階段，這與小麥TaBiP在種子中高表達(dá)、在莖葉器官中低表達(dá)[11]的結(jié)果相近，PvBiP2可能在種子發(fā)育過(guò)程中扮演重要的調(diào)控角色?；騿?dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，PvBiPs中普遍存在響應(yīng)干旱脅迫的作用元件 MBS、脫落酸作用反應(yīng)元件ABRE、茉莉酸甲酯作用元件TGACG-motif，低溫響應(yīng)元件LTR、機(jī)械損傷響應(yīng)元件wun-motif只在PvBiP2、PvBiP3中檢測(cè)到，順式作用元件的差異預(yù)示PvBiPs面對(duì)非生物脅迫時(shí)會(huì)有不同響應(yīng)。在DTT與NaCl、PEG、ABA、CdCl2處理下，PvBiP基因均表現(xiàn)為隨脅迫時(shí)間先上調(diào)表達(dá)后逐漸下降至本底表達(dá)水平的變化趨勢(shì)。PvBiP1a和PvBiP1b由于蛋白質(zhì)序列完全一致，其相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)和峰值大小也基本一致。盡管PvBiP2與PvBiP3的變化趨勢(shì)類似，但峰值大小存在差異。PvBiP2在DTT、NaCl、ABA和CdCl2脅迫處理下表達(dá)峰值都是最高的，PvBiP1a和PvBiP1b僅在PEG滲透脅迫下表現(xiàn)出高于PvBiP2、PvBiP3的上調(diào)表達(dá)量。非生物脅迫下BiP基因表達(dá)量的差異，涉及脅迫信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，反映了轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)合成水平的不同。由于BiP不僅能體現(xiàn)響應(yīng)UPR的分子伴侶活性，還可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫調(diào)節(jié)因子起到調(diào)節(jié)作用[37-38]，所以上調(diào)表達(dá)最高的PvBiP2可能是BiPs中主要的脅迫調(diào)節(jié)因子。進(jìn)一步在酵母中異源過(guò)表達(dá)3個(gè)PvBiP基因(PvBiP1a與PvBiP1b編碼的蛋白質(zhì)序列一致，只研究PvBiP1a)，結(jié)果顯示，PvBiP基因有耐Cd和耐鹽表型，對(duì)滲透脅迫敏感。在PvBiP基因中，PvBiP2在CdCl2脅迫下(1～12 h)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量也最高，其耐鎘調(diào)控作用值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究在柳枝稷基因組中共鑒定了4個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的BiP基因，命名為PvBiP1a、PvBiP1b、PvBiP2、PvBiP3，分別位于柳枝稷的1號(hào)和5號(hào)染色體上。多物種序列比對(duì)和進(jìn)化分析結(jié)果表明，PvBiPs具有BiP蛋白典型功能結(jié)構(gòu)域，PvBiPs啟動(dòng)子序列主要包括脅迫防御和激素應(yīng)答順式作用元件。PvBiPs受DTT誘導(dǎo)表達(dá)，在NaCl、PEG、ABA和CdCl2脅迫下都上調(diào)表達(dá)，其中PvBiP2的相對(duì)表達(dá)量峰值較高。酵母異源轉(zhuǎn)化耐逆功能驗(yàn)證結(jié)果顯示，PvBiPs對(duì)鎘和鹽脅迫有耐性表型，對(duì)甘露醇滲透脅迫較敏感。PvBiP2可作為鎘脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行深入研究。