張雙雙， 施正晟， 張 琴,2， 葉生梅,2， 李艷賓,2

(1.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000； 2.安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

沼氣發(fā)酵是目前畜禽糞污處理的主要方式。隨著中國畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，沼氣發(fā)酵后大量沼液的后續(xù)處理逐漸成為亟待解決的問題[1-2]。沼液富含氮、磷等營養(yǎng)元素及其他有機(jī)質(zhì)[3-4]，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常作為有機(jī)液體肥料對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行浸種、灌根或葉面噴施等[4-5]。沼液能提升種子內(nèi)的酶活性，促進(jìn)胚細(xì)胞分裂，從而刺激種子萌發(fā)與幼苗生長[6]，目前已廣泛用于水稻[7-8]、玉米[1]、油菜[9]和蔬菜[10]等的浸種及栽培。

然而，也有研究結(jié)果表明，長期直接施用沼液不但對(duì)作物生長起不到促進(jìn)作用[11-12]，過剩的養(yǎng)分積累還會(huì)通過地表徑流或土壤滲透遷移到地表水和地下水，造成環(huán)境污染[13]。微藻具有生長速率快，環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)，可有效去除沼液中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)和重金屬，附加值高等特點(diǎn)[14-16]，因此在沼液的處理與資源化利用中備受關(guān)注。Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，先用沼液培養(yǎng)微藻，再以微藻處理后的沼液用于蔬菜栽培，能顯著促進(jìn)蔬菜生長并提高其品質(zhì)，有效降低沼液直接施用的負(fù)面影響。但微藻處理后的沼液是否也可用于其他農(nóng)作物尚未見報(bào)道。為此，本研究以水稻為研究對(duì)象，探討不同體積百分比沼液經(jīng)微藻處理后進(jìn)行浸種，作為基肥和葉面肥使用對(duì)水稻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，以期為沼液的高效利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為Y兩優(yōu)800，挑選飽滿種子用于試驗(yàn)。微藻為小球藻(Chlorellasp.)，由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

供試沼液于2021年6月取自安徽省蕪湖市安徽聚豐畜禽開發(fā)有限公司穩(wěn)定運(yùn)行的沼氣池，沼氣發(fā)酵原料主要為豬糞尿。分別用清水稀釋成體積百分比為25%、50%、75%、100%的沼液，并按BG11培養(yǎng)基組分補(bǔ)充適量營養(yǎng)元素，用于微藻培養(yǎng)處理。

以含10%沼液的BG11培養(yǎng)基接種微藻進(jìn)行培養(yǎng)，6 d后按10%比例接入上述不同體積百分比沼液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光照度6 000 lx，光暗周期16 h∶8 h，培養(yǎng)時(shí)間12 d。離心、過濾除去微藻細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。原沼液及微藻培養(yǎng)處理后沼液中的養(yǎng)分及重金屬含量見表1。

表1 微藻處理前后各體積百分比沼液中養(yǎng)分及重金屬含量

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 沼液浸種及水稻種子萌發(fā) 分別用不同體積百分比原沼液和微藻處理沼液對(duì)水稻種子進(jìn)行浸種，以清水浸種為對(duì)照，具體試驗(yàn)處理設(shè)置為：① 25%原沼液浸種(S1)；② 50%原沼液浸種(S2)；③ 75%原沼液浸種(S3)；④ 100%原沼液浸種(S4)；⑤ 25%微藻處理后的沼液浸種(MS1)；⑥ 50%微藻處理后的沼液浸種(MS2)；⑦ 75%微藻處理后的沼液浸種(MS3)；⑧ 100%微藻處理后的沼液浸種(MS4)；⑨ 清水浸種(TW)。浸種溫度30 ℃，時(shí)間24 h。浸泡后種子用清水洗凈，放入鋪設(shè)2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿20粒，再蓋上一層濾紙，早晚噴灑適量清水以保持濾紙濕潤，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度(30±1) ℃，光照度4 000 lx，光/暗周期14 h/10 h。每個(gè)處理5次重復(fù)。自第1 d起每天統(tǒng)計(jì)水稻種子萌發(fā)數(shù)，第7 d時(shí)測量根長、根直徑、根系活力及干鮮質(zhì)量。參照劉媛媛等[18]方法計(jì)算種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)：①發(fā)芽勢=(第3 d萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；②發(fā)芽率=(第7 d萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；③發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(Gt為第t天的萌發(fā)數(shù)，Dt為種子萌發(fā)天數(shù))；④活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×根長。根系活力測定采用TTC法[6]。

1.2.2 沼液肥施用對(duì)水稻幼苗生長的影響 水稻種子經(jīng)50%沼液浸種24 h后，鋪于育苗盆(32.0 cm×24.0 cm×4.5 cm)中進(jìn)行水培試驗(yàn)，分別以50%原沼液和50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液模擬施用沼液基肥。在第6 d時(shí)再分別以葉面肥的形式噴施50 ml不同體積百分比沼液。以Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)并在第6 d時(shí)噴施等量清水作為對(duì)照。具體試驗(yàn)設(shè)置如下：① Hoagland營養(yǎng)液+葉面噴灑清水(HN)；② 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑清水(PT1)；③ 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%原沼液(PT2)；④ 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%原沼液(PT3)；⑤ 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%原沼液(PT4)；⑥ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑清水(AT1)；⑦ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%微藻處理后的沼液(AT2)；⑧ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%微藻處理后的沼液(AT3)；⑨ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%微藻處理后的沼液(AT4)。培養(yǎng)溫度(30±1) ℃，光照度4 000 lx，光/暗周期14 h/10 h。每個(gè)處理3次重復(fù)。第12 d時(shí)測定水稻幼苗苗高、根數(shù)、根長、莖粗、幼苗地上部鮮質(zhì)量和根鮮重等形態(tài)指標(biāo)，以及根系活力和葉片葉綠素含量等生理指標(biāo)。根系活力測定采用TTC法[6]。葉綠素含量測定采用乙醇提取比色法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻處理前后沼液浸種對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，與清水浸種(TW)對(duì)照相比，以50%～75%體積百分比的原沼液(處理S2～S3)進(jìn)行浸種，水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)出一定的增加趨勢，但增加幅度不顯著。萌發(fā)種子的活力指數(shù)同樣有隨沼液體積百分比增加而增大的趨勢，且在50%～100%原沼液體積百分比(S2～S4)時(shí)達(dá)到顯著水平(P<0.05)。而以微藻處理后的沼液進(jìn)行浸種，其各體積百分比(MS1～MS4)處理水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著(P<0.05)高于原沼液和清水浸種處理。說明相比原沼液，用微藻處理后的沼液浸種能更有效地增強(qiáng)水稻種子萌發(fā)速率(發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù))和已萌發(fā)種子的活力(活力指數(shù))。各處理的種子發(fā)芽率并沒有顯著差異，表明無論是原沼液還是經(jīng)微藻處理后的沼液浸種，對(duì)水稻種子最終是否萌發(fā)的影響有限。

表2 微藻處理前后沼液浸種對(duì)水稻種子萌發(fā)率及萌發(fā)速率的影響

整體看來，沼液經(jīng)微藻處理后，顯著提升了沼液浸種的效果。其中以50%體積百分比的微藻處理后的沼液浸種(MS2)效果最好，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)相比清水浸種處理(TW)分別提高176.8%、32.8%和74.0%。

2.2 微藻處理前后沼液施用對(duì)水稻幼苗生長的影響

以微藻處理前后的沼液作為基肥和葉面肥，進(jìn)一步考察其對(duì)水稻幼苗生長的影響?？傮w來看，以50%體積百分比的原沼液(PT1)和微藻處理后的沼液(AT1)為培養(yǎng)液，均對(duì)水稻幼苗根系的生長發(fā)育具有較好的促進(jìn)作用，其中AT1處理的效果整體優(yōu)于PT1處理(圖1)。相比于對(duì)照處理(HN)，AT1處理水稻幼苗的根數(shù)、根長、根鮮質(zhì)量及根系活力分別提高了62.5%、24.8%、42.2%和44.9%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

從圖1還可看出，在沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，再分別噴施不同體積百分比原沼液或微藻處理后的沼液作為葉面肥(PT2～PT4、AT2～AT4)，水稻幼苗的根數(shù)、根長、根鮮質(zhì)量及根系活力普遍有隨噴施沼液體積百分比增加而降低的趨勢，其中噴施原沼液(PT2～PT4)的降低趨勢尤為明顯。噴施微藻處理后的沼液的效果整體要好于原沼液，在50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，25%微藻處理后的沼液葉面噴施處理(AT2)，水稻的根數(shù)、根長、根鮮質(zhì)量及根系活力與僅使用微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液處理(AT1)相比降低并不顯著，當(dāng)噴施微藻處理后的沼液體積百分比達(dá)到50%時(shí)(AT3)，水稻的根長、根鮮質(zhì)量及根系活力也并無顯著降低。

HN：Hoagland營養(yǎng)液+葉面噴灑水；PT1：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑水；PT2：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%原沼液；PT3：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%原沼液；PT4：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%原沼液；AT1：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑水；AT2：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%微藻處理后的沼液；AT3：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%微藻處理后的沼液；AT4：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%微藻處理后的沼液。柱狀圖上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖1 微藻處理前后沼液肥施用對(duì)水稻根系的影響Fig.1 Effects of biogas slurry fertilizer application before and after microalgae treatment on rice root system

沼液對(duì)水稻幼苗地上部分的影響與根系類似(圖2)。微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液的效果整體要顯著好于原沼液，AT1處理的水稻幼苗高度、鮮質(zhì)量及葉綠素含量分別比HN處理提高了26.5%、20.4%和102.5%。

HN等處理見圖1注。柱狀圖上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖2 微藻處理前后沼液肥施用對(duì)水稻幼苗的影響Fig.2 Effects of biogas slurry fertilizer application before and after microalgae treatment on rice seedlings

在50%沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上噴施沼液葉面肥，水稻幼苗的苗高、鮮質(zhì)量及葉綠素含量也有隨噴施沼液體積百分比增加而降低的趨勢。但整體上噴施微藻處理后的沼液的各項(xiàng)指標(biāo)(莖粗除外)仍然要顯著好于噴施原沼液各處理(PT2～PT4)及對(duì)照(HN)，說明微藻處理有效降低了原沼液基施加葉面噴施模式對(duì)水稻幼苗生長的抑制作用，發(fā)揮出較好的肥效作用。特別是50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液，25%微藻處理后的沼液葉面噴施處理(AT2)和50%微藻處理后的沼液葉面噴施處理(AT3)，水稻幼苗的鮮質(zhì)量相比于僅50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液處理(AT1)有顯著增高，但AT2處理的葉綠素含量與AT1處理沒有顯著差異。

綜上所述，與未經(jīng)處理的原沼液相比較，以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液，更有利于促進(jìn)水稻幼苗生長，表現(xiàn)出更好的肥效。在以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液加以微藻處理后的沼液為葉面肥模式中，噴施體積百分比過高的微藻處理后的沼液還會(huì)抑制幼苗生長，但以25%～50%的體積百分比噴施微藻處理后的沼液，與僅以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液處理(AT1)相比仍可有效增加幼苗鮮質(zhì)量，但根長、根鮮質(zhì)量、根系活力及莖粗等指標(biāo)與AT1處理相比并無顯著差異。

3 討 論

沼液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，可被作物種子吸收利用從而促進(jìn)種子萌發(fā)，因此在農(nóng)作物和蔬菜種植等領(lǐng)域得到廣泛利用[18]。大量研究結(jié)果表明，沼液浸種對(duì)許多作物種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用，沼液中的營養(yǎng)成分有助于破除種子休眠，刺激種子萌發(fā)和細(xì)胞分裂[7-8,18-20]。但不同作物適宜的沼液浸種體積百分比差異較大，多數(shù)報(bào)道的最佳沼液體積百分比在5%至25%之間[1,8,21]，也有研究者指出沼液體積百分比達(dá)到5%時(shí)即對(duì)水稻種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制[22]。

發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)反映了種子的萌發(fā)速率，活力指數(shù)則反映已萌發(fā)種子的活力[23]。本研究結(jié)果顯示，以沼液原液浸種，水稻種子萌發(fā)各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照相比普遍有隨沼液體積百分比增加而先升高后降低的趨勢，其中25%～100%原沼液處理的水稻種子活力指數(shù)要顯著(P<0.05)高于對(duì)照，說明以原沼液浸種可有效提高種子的活力。但除活力指數(shù)外，原沼液各處理的其余指標(biāo)變化均不顯著。相對(duì)于沼液原液，以不同體積百分比微藻處理后的沼液浸種的各處理，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有大幅度的提升(P<0.05)，說明沼液經(jīng)微藻處理后，可增強(qiáng)其浸種效果，提高水稻種子的萌發(fā)速率和活力。

以沼液作基肥或葉面肥能促進(jìn)作物生長，提升作物產(chǎn)量與品質(zhì)[5,18]。但沼液直接使用，也可能會(huì)因其過于豐富的養(yǎng)分含量等因素導(dǎo)致細(xì)胞液外滲，抑制作物根系對(duì)氮、磷等養(yǎng)分的吸收，最終影響作物碳水化合物的合成代謝[17]。微藻可消耗掉沼液中部分養(yǎng)分，從而避免沼液養(yǎng)分體積百分比過高對(duì)植物生長和養(yǎng)分吸收的不利影響[17,24]。此外，微藻生長代謝過程還能產(chǎn)生如吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等植物激素類物質(zhì)，從而起到促進(jìn)作物生長、增強(qiáng)作物抗病性等作用[25-26]。Xu等[17]利用微藻Scenedesmussp.對(duì)沼液進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)處理后沼液的COD、TN、TP、銨態(tài)氮、無機(jī)磷等均顯著降低，并對(duì)大白菜生長具有顯著的促進(jìn)作用，營養(yǎng)品質(zhì)、食用口感等均有提升。本研究也獲得類似結(jié)果，經(jīng)微藻處理后，不同體積百分比沼液中的COD、TN、TP、速效氮含量均顯著降低，去除率64%～90%，但速效磷含量變化不大，甚至有一定量的增加。研究結(jié)果還表明，以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液更有利于促進(jìn)水稻幼苗生長，表現(xiàn)出更好的肥效，有較好的應(yīng)用潛力，這對(duì)沼液的減量化、資源化利用具有重要的意義。

沼渣、沼液的長期施用將增加土壤中重金屬積累的風(fēng)險(xiǎn)，也對(duì)作物的生長帶來不利影響。重金屬對(duì)作物的傷害首先反映在種子萌發(fā)和幼苗生長方面[27]，過量的重金屬將造成種子發(fā)芽率降低，根系生長受到抑制，植物體內(nèi)代謝紊亂，從而影響其生長發(fā)育及產(chǎn)量[27-28]。微藻具有良好的重金屬毒性耐受性，具備吸收、富集和轉(zhuǎn)化重金屬的能力，因此在廢水生物修復(fù)方面受到廣泛關(guān)注[17,29-32]。本研究測定了微藻處理前后，各體積百分比沼液中Cu、Hg、Pb、Cr、Cd等5種重金屬的含量，結(jié)果顯示經(jīng)微藻處理后5種重金屬含量均有不同程度的降低，這也可能是經(jīng)微藻處理后的沼液浸種的水稻種子萌發(fā)及微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液和葉面噴施幼苗生長普遍要優(yōu)于原沼液各處理的原因之一。

在沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上再噴施沼液葉面肥的效果有限，噴施沼液的體積百分比過高還會(huì)抑制幼苗生長。但以50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液加噴施25%～50%微藻處理后的沼液，與僅使用50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液相比仍可有效增加幼苗鮮質(zhì)量，其最終對(duì)水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)影響如何，有待進(jìn)一步的研究。