張雙雙， 施正晟， 張 琴,2， 葉生梅,2， 李艷賓,2

(1.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000； 2.安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實驗室，安徽 蕪湖 241000)

沼氣發(fā)酵是目前畜禽糞污處理的主要方式。隨著中國畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，沼氣發(fā)酵后大量沼液的后續(xù)處理逐漸成為亟待解決的問題[1-2]。沼液富含氮、磷等營養(yǎng)元素及其他有機質(zhì)[3-4]，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常作為有機液體肥料對農(nóng)作物進行浸種、灌根或葉面噴施等[4-5]。沼液能提升種子內(nèi)的酶活性，促進胚細胞分裂，從而刺激種子萌發(fā)與幼苗生長[6]，目前已廣泛用于水稻[7-8]、玉米[1]、油菜[9]和蔬菜[10]等的浸種及栽培。

然而，也有研究結(jié)果表明，長期直接施用沼液不但對作物生長起不到促進作用[11-12]，過剩的養(yǎng)分積累還會通過地表徑流或土壤滲透遷移到地表水和地下水，造成環(huán)境污染[13]。微藻具有生長速率快，環(huán)境適應(yīng)強，可有效去除沼液中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)和重金屬，附加值高等特點[14-16]，因此在沼液的處理與資源化利用中備受關(guān)注。Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，先用沼液培養(yǎng)微藻，再以微藻處理后的沼液用于蔬菜栽培，能顯著促進蔬菜生長并提高其品質(zhì)，有效降低沼液直接施用的負面影響。但微藻處理后的沼液是否也可用于其他農(nóng)作物尚未見報道。為此，本研究以水稻為研究對象，探討不同體積百分比沼液經(jīng)微藻處理后進行浸種，作為基肥和葉面肥使用對水稻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，以期為沼液的高效利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為Y兩優(yōu)800，挑選飽滿種子用于試驗。微藻為小球藻(Chlorellasp.)，由本實驗室分離保藏。

供試沼液于2021年6月取自安徽省蕪湖市安徽聚豐畜禽開發(fā)有限公司穩(wěn)定運行的沼氣池，沼氣發(fā)酵原料主要為豬糞尿。分別用清水稀釋成體積百分比為25%、50%、75%、100%的沼液，并按BG11培養(yǎng)基組分補充適量營養(yǎng)元素，用于微藻培養(yǎng)處理。

以含10%沼液的BG11培養(yǎng)基接種微藻進行培養(yǎng)，6 d后按10%比例接入上述不同體積百分比沼液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光照度6 000 lx，光暗周期16 h∶8 h，培養(yǎng)時間12 d。離心、過濾除去微藻細胞，用于后續(xù)試驗。原沼液及微藻培養(yǎng)處理后沼液中的養(yǎng)分及重金屬含量見表1。

表1 微藻處理前后各體積百分比沼液中養(yǎng)分及重金屬含量

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 沼液浸種及水稻種子萌發(fā) 分別用不同體積百分比原沼液和微藻處理沼液對水稻種子進行浸種，以清水浸種為對照，具體試驗處理設(shè)置為：① 25%原沼液浸種(S1)；② 50%原沼液浸種(S2)；③ 75%原沼液浸種(S3)；④ 100%原沼液浸種(S4)；⑤ 25%微藻處理后的沼液浸種(MS1)；⑥ 50%微藻處理后的沼液浸種(MS2)；⑦ 75%微藻處理后的沼液浸種(MS3)；⑧ 100%微藻處理后的沼液浸種(MS4)；⑨ 清水浸種(TW)。浸種溫度30 ℃，時間24 h。浸泡后種子用清水洗凈，放入鋪設(shè)2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿20粒，再蓋上一層濾紙，早晚噴灑適量清水以保持濾紙濕潤，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度(30±1) ℃，光照度4 000 lx，光/暗周期14 h/10 h。每個處理5次重復(fù)。自第1 d起每天統(tǒng)計水稻種子萌發(fā)數(shù)，第7 d時測量根長、根直徑、根系活力及干鮮質(zhì)量。參照劉媛媛等[18]方法計算種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)：①發(fā)芽勢=(第3 d萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；②發(fā)芽率=(第7 d萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；③發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(Gt為第t天的萌發(fā)數(shù)，Dt為種子萌發(fā)天數(shù))；④活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×根長。根系活力測定采用TTC法[6]。

1.2.2 沼液肥施用對水稻幼苗生長的影響 水稻種子經(jīng)50%沼液浸種24 h后，鋪于育苗盆(32.0 cm×24.0 cm×4.5 cm)中進行水培試驗，分別以50%原沼液和50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液模擬施用沼液基肥。在第6 d時再分別以葉面肥的形式噴施50 ml不同體積百分比沼液。以Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)并在第6 d時噴施等量清水作為對照。具體試驗設(shè)置如下：① Hoagland營養(yǎng)液+葉面噴灑清水(HN)；② 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑清水(PT1)；③ 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%原沼液(PT2)；④ 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%原沼液(PT3)；⑤ 50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%原沼液(PT4)；⑥ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑清水(AT1)；⑦ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%微藻處理后的沼液(AT2)；⑧ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%微藻處理后的沼液(AT3)；⑨ 50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%微藻處理后的沼液(AT4)。培養(yǎng)溫度(30±1) ℃，光照度4 000 lx，光/暗周期14 h/10 h。每個處理3次重復(fù)。第12 d時測定水稻幼苗苗高、根數(shù)、根長、莖粗、幼苗地上部鮮質(zhì)量和根鮮重等形態(tài)指標(biāo)，以及根系活力和葉片葉綠素含量等生理指標(biāo)。根系活力測定采用TTC法[6]。葉綠素含量測定采用乙醇提取比色法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，用Origin8.5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻處理前后沼液浸種對水稻種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，與清水浸種(TW)對照相比，以50%～75%體積百分比的原沼液(處理S2～S3)進行浸種，水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)出一定的增加趨勢，但增加幅度不顯著。萌發(fā)種子的活力指數(shù)同樣有隨沼液體積百分比增加而增大的趨勢，且在50%～100%原沼液體積百分比(S2～S4)時達到顯著水平(P<0.05)。而以微藻處理后的沼液進行浸種，其各體積百分比(MS1～MS4)處理水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著(P<0.05)高于原沼液和清水浸種處理。說明相比原沼液，用微藻處理后的沼液浸種能更有效地增強水稻種子萌發(fā)速率(發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù))和已萌發(fā)種子的活力(活力指數(shù))。各處理的種子發(fā)芽率并沒有顯著差異，表明無論是原沼液還是經(jīng)微藻處理后的沼液浸種，對水稻種子最終是否萌發(fā)的影響有限。

表2 微藻處理前后沼液浸種對水稻種子萌發(fā)率及萌發(fā)速率的影響

整體看來，沼液經(jīng)微藻處理后，顯著提升了沼液浸種的效果。其中以50%體積百分比的微藻處理后的沼液浸種(MS2)效果最好，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)相比清水浸種處理(TW)分別提高176.8%、32.8%和74.0%。

2.2 微藻處理前后沼液施用對水稻幼苗生長的影響

以微藻處理前后的沼液作為基肥和葉面肥，進一步考察其對水稻幼苗生長的影響?？傮w來看，以50%體積百分比的原沼液(PT1)和微藻處理后的沼液(AT1)為培養(yǎng)液，均對水稻幼苗根系的生長發(fā)育具有較好的促進作用，其中AT1處理的效果整體優(yōu)于PT1處理(圖1)。相比于對照處理(HN)，AT1處理水稻幼苗的根數(shù)、根長、根鮮質(zhì)量及根系活力分別提高了62.5%、24.8%、42.2%和44.9%，均達到顯著水平(P<0.05)。

從圖1還可看出，在沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，再分別噴施不同體積百分比原沼液或微藻處理后的沼液作為葉面肥(PT2～PT4、AT2～AT4)，水稻幼苗的根數(shù)、根長、根鮮質(zhì)量及根系活力普遍有隨噴施沼液體積百分比增加而降低的趨勢，其中噴施原沼液(PT2～PT4)的降低趨勢尤為明顯。噴施微藻處理后的沼液的效果整體要好于原沼液，在50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，25%微藻處理后的沼液葉面噴施處理(AT2)，水稻的根數(shù)、根長、根鮮質(zhì)量及根系活力與僅使用微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液處理(AT1)相比降低并不顯著，當(dāng)噴施微藻處理后的沼液體積百分比達到50%時(AT3)，水稻的根長、根鮮質(zhì)量及根系活力也并無顯著降低。

HN：Hoagland營養(yǎng)液+葉面噴灑水；PT1：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑水；PT2：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%原沼液；PT3：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%原沼液；PT4：50%原沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%原沼液；AT1：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑水；AT2：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑25%微藻處理后的沼液；AT3：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑50%微藻處理后的沼液；AT4：50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液+葉面噴灑75%微藻處理后的沼液。柱狀圖上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖1 微藻處理前后沼液肥施用對水稻根系的影響Fig.1 Effects of biogas slurry fertilizer application before and after microalgae treatment on rice root system

沼液對水稻幼苗地上部分的影響與根系類似(圖2)。微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液的效果整體要顯著好于原沼液，AT1處理的水稻幼苗高度、鮮質(zhì)量及葉綠素含量分別比HN處理提高了26.5%、20.4%和102.5%。

HN等處理見圖1注。柱狀圖上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖2 微藻處理前后沼液肥施用對水稻幼苗的影響Fig.2 Effects of biogas slurry fertilizer application before and after microalgae treatment on rice seedlings

在50%沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上噴施沼液葉面肥，水稻幼苗的苗高、鮮質(zhì)量及葉綠素含量也有隨噴施沼液體積百分比增加而降低的趨勢。但整體上噴施微藻處理后的沼液的各項指標(biāo)(莖粗除外)仍然要顯著好于噴施原沼液各處理(PT2～PT4)及對照(HN)，說明微藻處理有效降低了原沼液基施加葉面噴施模式對水稻幼苗生長的抑制作用，發(fā)揮出較好的肥效作用。特別是50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液，25%微藻處理后的沼液葉面噴施處理(AT2)和50%微藻處理后的沼液葉面噴施處理(AT3)，水稻幼苗的鮮質(zhì)量相比于僅50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液處理(AT1)有顯著增高，但AT2處理的葉綠素含量與AT1處理沒有顯著差異。

綜上所述，與未經(jīng)處理的原沼液相比較，以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液，更有利于促進水稻幼苗生長，表現(xiàn)出更好的肥效。在以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液加以微藻處理后的沼液為葉面肥模式中，噴施體積百分比過高的微藻處理后的沼液還會抑制幼苗生長，但以25%～50%的體積百分比噴施微藻處理后的沼液，與僅以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液處理(AT1)相比仍可有效增加幼苗鮮質(zhì)量，但根長、根鮮質(zhì)量、根系活力及莖粗等指標(biāo)與AT1處理相比并無顯著差異。

3 討 論

沼液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，可被作物種子吸收利用從而促進種子萌發(fā)，因此在農(nóng)作物和蔬菜種植等領(lǐng)域得到廣泛利用[18]。大量研究結(jié)果表明，沼液浸種對許多作物種子的萌發(fā)具有促進作用，沼液中的營養(yǎng)成分有助于破除種子休眠，刺激種子萌發(fā)和細胞分裂[7-8,18-20]。但不同作物適宜的沼液浸種體積百分比差異較大，多數(shù)報道的最佳沼液體積百分比在5%至25%之間[1,8,21]，也有研究者指出沼液體積百分比達到5%時即對水稻種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制[22]。

發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)反映了種子的萌發(fā)速率，活力指數(shù)則反映已萌發(fā)種子的活力[23]。本研究結(jié)果顯示，以沼液原液浸種，水稻種子萌發(fā)各項指標(biāo)與對照相比普遍有隨沼液體積百分比增加而先升高后降低的趨勢，其中25%～100%原沼液處理的水稻種子活力指數(shù)要顯著(P<0.05)高于對照，說明以原沼液浸種可有效提高種子的活力。但除活力指數(shù)外，原沼液各處理的其余指標(biāo)變化均不顯著。相對于沼液原液，以不同體積百分比微藻處理后的沼液浸種的各處理，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有大幅度的提升(P<0.05)，說明沼液經(jīng)微藻處理后，可增強其浸種效果，提高水稻種子的萌發(fā)速率和活力。

以沼液作基肥或葉面肥能促進作物生長，提升作物產(chǎn)量與品質(zhì)[5,18]。但沼液直接使用，也可能會因其過于豐富的養(yǎng)分含量等因素導(dǎo)致細胞液外滲，抑制作物根系對氮、磷等養(yǎng)分的吸收，最終影響作物碳水化合物的合成代謝[17]。微藻可消耗掉沼液中部分養(yǎng)分，從而避免沼液養(yǎng)分體積百分比過高對植物生長和養(yǎng)分吸收的不利影響[17,24]。此外，微藻生長代謝過程還能產(chǎn)生如吲哚乙酸、細胞分裂素等植物激素類物質(zhì)，從而起到促進作物生長、增強作物抗病性等作用[25-26]。Xu等[17]利用微藻Scenedesmussp.對沼液進行處理，發(fā)現(xiàn)處理后沼液的COD、TN、TP、銨態(tài)氮、無機磷等均顯著降低，并對大白菜生長具有顯著的促進作用，營養(yǎng)品質(zhì)、食用口感等均有提升。本研究也獲得類似結(jié)果，經(jīng)微藻處理后，不同體積百分比沼液中的COD、TN、TP、速效氮含量均顯著降低，去除率64%～90%，但速效磷含量變化不大，甚至有一定量的增加。研究結(jié)果還表明，以微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液更有利于促進水稻幼苗生長，表現(xiàn)出更好的肥效，有較好的應(yīng)用潛力，這對沼液的減量化、資源化利用具有重要的意義。

沼渣、沼液的長期施用將增加土壤中重金屬積累的風(fēng)險，也對作物的生長帶來不利影響。重金屬對作物的傷害首先反映在種子萌發(fā)和幼苗生長方面[27]，過量的重金屬將造成種子發(fā)芽率降低，根系生長受到抑制，植物體內(nèi)代謝紊亂，從而影響其生長發(fā)育及產(chǎn)量[27-28]。微藻具有良好的重金屬毒性耐受性，具備吸收、富集和轉(zhuǎn)化重金屬的能力，因此在廢水生物修復(fù)方面受到廣泛關(guān)注[17,29-32]。本研究測定了微藻處理前后，各體積百分比沼液中Cu、Hg、Pb、Cr、Cd等5種重金屬的含量，結(jié)果顯示經(jīng)微藻處理后5種重金屬含量均有不同程度的降低，這也可能是經(jīng)微藻處理后的沼液浸種的水稻種子萌發(fā)及微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液和葉面噴施幼苗生長普遍要優(yōu)于原沼液各處理的原因之一。

在沼液為培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上再噴施沼液葉面肥的效果有限，噴施沼液的體積百分比過高還會抑制幼苗生長。但以50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液加噴施25%～50%微藻處理后的沼液，與僅使用50%微藻處理后的沼液為培養(yǎng)液相比仍可有效增加幼苗鮮質(zhì)量，其最終對水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)影響如何，有待進一步的研究。