代良敏，代良萍，陳永鈞，周杰，黃群蓮

西南醫(yī)科大學 附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云連C.teetaWall.的干燥根莖，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[1]。黃連含有多種異喹啉類生物堿，以小檗堿質(zhì)量分數(shù)最高，為5%～8%，黃連還含有藥根堿、甲基黃連堿、木蘭花堿、小檗紅堿（9-去甲小檗堿）等[2-3]。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth、石虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.ibodinieri（Dode）Huang 的干燥近成熟果實，味辛、苦，熱，有小毒[1]。生物堿是吳茱萸的主要活性成分，苦味素類也是吳茱萸的一類重要的活性成分。吳茱萸富含揮發(fā)油，揮發(fā)油是吳茱萸的有效成分，亦是毒性成分[4]。

吳茱萸制黃連可抑制黃連苦寒之性。吳茱萸、黃連配伍具有行氣消痞的功效，在臨床上廣泛應(yīng)用，是中醫(yī)臨床常用的藥對[5]，以萸黃連及其加方的應(yīng)用較廣泛?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版收載的黃連飲片僅有黃連、酒黃連、姜黃連、萸黃連4 種。眾多黃連炮制品的記載中，尤以吳茱萸汁制黃連獨具特色，深化了炮制內(nèi)涵——糾偏性及增效。黃連經(jīng)吳茱萸汁拌炒后，二藥參合，一止一清，一熱一寒，相互制約，相互為用，以達寒而不滯、消不傷正、清氣分濕熱、散肝膽郁火之功[6-8]。吳茱萸制黃連可抑制其苦寒之性可能與具體成分變化有關(guān)，但依據(jù)尚不充分，需結(jié)合相關(guān)藥效學實驗進行系統(tǒng)研究。本研究以吳茱萸中的吳茱萸堿及黃連中鹽酸小檗堿含量為評價指標，采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)選吳茱萸制黃連的炮制工藝，從而規(guī)范其質(zhì)量，保證臨床療效。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BT25S 型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利科學儀器有限公司）；JA2003 型千分之一電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

對照品吳茱萸堿（批號：110727-201807，純度：95.3%）、鹽酸小檗堿（批號：111978-201801，純度：96.1%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜級；水為超純水；其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。

黃連飲片（批號：1802012）、吳茱萸飲片（批號：1801015）均購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學盧先明教授鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖及蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸堿的含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilentextend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸（41.0∶59.0∶1.0∶0.2）；體積流量為1 mL·min-1；柱溫為室溫；檢測波長為225 nm；進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取吳茱萸堿對照品10.82 mg，置于25 mL 量瓶中，加適量水溶解，搖勻，超聲30 min，冷卻，加水至刻度，搖勻，即得吳茱萸對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液5 mL置10 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得吳茱萸堿對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取最終炮制品（過五號篩）0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得[9]。

2.1.4 專屬性考察 分別配制空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液，按照2.1.1 項下色譜條件進行試驗，結(jié)果見圖1。在該分析條件，吳茱萸堿色譜峰理論板數(shù)＞5000，與其他組分的色譜峰分離良好，且陰性無干擾。表明本方法具有較好的專屬性。

圖1 吳茱萸制黃連飲片中吳茱萸堿含量測定的專屬性試驗高效液相色譜圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別準確移取2.1.2項下對照品儲備液適量，用水稀釋，得吳茱萸堿質(zhì)量濃度分別為216.400、108.200、54.100、10.820、2.164 μg·mL-1的混合對照品溶液，進樣10 μL測定[10]。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程為Y=7.337 2X+17.504（r=0.999 9），吳茱萸堿對照品在2.164～216.400 μg·mL-1線性關(guān)系良好。通過精密度、重復性、穩(wěn)定性考察分別表明精密度良好、該方法重復性良好、表明樣品在12h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一樣品粉末9 份，約0.2 g，分別按50%、100%、150%比例加入各對照品溶液，制備3 個質(zhì)量濃度的樣品，平行測定3份，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，依照2.1.1 項下色譜條件進行測定。結(jié)果吳茱萸堿的平均加樣回收率為100.03%，RSD 為0.65%，表明該方法準確度良好。

2.2 鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（45∶55，每100 mL 中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 為4.0）；體積流量為1 mL·min-1；柱溫為室溫；檢測波長為345 nm；進樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.51 mg，置于25 mL 量瓶中，加適量甲醇溶解，搖勻，超聲30 min，冷卻，加水至刻度，搖勻，即得鹽酸小檗堿對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液5 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得[9]。

2.2.4 專屬性考察 分別配制空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液，按照2.2.1 項下色譜條件進行試驗，結(jié)果見圖2。在該分析條件，鹽酸小檗堿色譜峰理論板數(shù)＞5000，與其他組分的色譜峰分離良好，且陰性無干擾。結(jié)果表明本方法具有較好的專屬性。

圖2 吳茱萸制黃連飲片中鹽酸小檗堿含量測定的專屬性試驗高效液相色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別準確移取2.2.2 項下對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，制得鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為250.200、125.100、62.550、31.275、6.255 μg·mL-1的混合對照品溶液，進樣10 μL測定[10]。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程為Y=13.793X-3.144 1（r=0.999 9），對照品鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在6.255～250.200 μg·mL-1線性關(guān)系良好。通過精密度、重復性、穩(wěn)定性考察分別表明精密度良好、該方法重復性良好、表明樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一樣品粉末9 份，約0.2 g，分別按50%、100%、150%比例加入各對照品溶液，制備3 個質(zhì)量濃度的樣品，平行測定3 份，按2.2.3 項下制備供試品溶液，依照2.2.1 項下色譜條件進行測定，結(jié)果表明鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為99.74%，RSD 為1.68%，表明該方法準確度良好。

2.3 吳茱萸堿及鹽酸小檗堿含量計算方法

依據(jù)2.1 項下方法測定吳茱萸汁制黃連飲片中吳茱萸堿及鹽酸小檗堿的含量，分別按公式（1）、（2）計算。

2.4 單因素試驗考察

在《圣濟總錄》中，根據(jù)中醫(yī)臨床以熱制寒的原理，用吳茱萸制黃連[7,11]。其炮制方法為用吳茱萸汁浸透黃連，炒干，后烘至一定的水分范圍內(nèi)。本研究在繼承傳統(tǒng)炮制方法的基礎(chǔ)上，對其工藝參數(shù)進行量化，使炮制工藝規(guī)范化，提升質(zhì)量標準，提高吳茱萸汁制黃連飲片臨床應(yīng)用價值。影響藥汁制飲片的因素主要有炒制溫度、炒制時間、烘制溫度、烘制時間等。

取同一批吳茱萸汁與黃連飲片進行炮制工藝的篩選，以吳茱萸堿及鹽酸小檗堿的含量為評價指標，按照2.1、2.2 項下方法測定吳茱萸堿及鹽酸小檗堿含量。

2.4.1 吳茱萸汁的制備 稱取吳茱萸100 g，加8倍水浸泡1 h，煎煮45 min，濾過，藥渣再加5 倍水煎煮30 min，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，備用。

2.4.2 藥汁量 分別稱取黃連飲片3份，每份100 g，吳茱萸汁以1%、5%、10%分別加入5、25、50 mL，浸泡24 h，不時翻動，直至汁盡藥透，于100 ℃炒制5 min，取出。于50 ℃烘箱烘制24 h。通過藥理實驗證明，吳茱萸制黃連組大鼠血漿中腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）的含量等各項生化指標均有顯著變化（P＜0.05），吳茱萸制黃連組與黃連組相比小鼠飲水量顯著減少（P＜0.05）[12]。吳茱萸制黃連有增強清氣分濕熱、散肝膽郁火的作用，且10%吳茱萸制黃連效果最優(yōu)。最終選擇吳茱萸-黃連配比為10∶100。

2.4.3 潤制時間 分別稱取黃連飲片3 份，每份100 g，各加入?yún)擒镙侵?0 mL，吳茱萸汁用量為10%，分別浸泡12、24、36 h，不時翻動，直至汁盡藥透，于100 ℃炒制5 min，取出。于50 ℃烘箱烘制24 h。通過前期預試驗可知，12 h 時藥汁未吸透，而36 h 時由于浸泡時間過長，黃連部分發(fā)生霉變，24 h時剛好汁盡藥透，最終選擇浸泡24 h。

2.4.4 炒制溫度 分別稱取黃連飲片7 份，每份100 g，各加入?yún)擒镙侵?0 mL，吳茱萸-黃連配比為10%，浸泡24 h，不時翻動，直至汁盡藥透，分別于30、50、60、90、100、120、150 ℃（以炒制時電磁爐溫度為準）炒制5 min，取出。于50 ℃烘箱烘制24 h。經(jīng)高效液相色譜法檢測，計算吳茱萸堿及鹽酸小檗堿含量。由表1 可知，炒制溫度對黃連（吳茱萸制）中鹽酸小檗堿的含量變化有顯著影響，而對吳茱萸堿的含量影響不明顯。隨著炒制溫度的升高，鹽酸小檗堿的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當炒制溫度達到90 ℃時，鹽酸小檗堿的含量達到最高值，此時，吳茱萸堿的含量變化不大。因此，炒制溫度為90 ℃時為佳。

表1 不同炒制溫度對吳茱萸制黃連中吳茱萸堿及鹽酸小檗堿質(zhì)量分數(shù)的影響 %

2.4.5 炒制時間 分別稱取黃連飲片7 份，每份100 g，各加入?yún)擒镙侵?0 mL，吳茱萸汁用量為10%，浸泡24 h，不時翻動，直至汁盡藥透，于飲片溫度為90 ℃分別炒制3、4、5、6、7、9、12 min，取出。于50 ℃烘箱烘制24 h。經(jīng)HPLC 檢測，計算吳茱萸堿及鹽酸小檗堿的含量。由表2 可知，炒制時間對黃連（吳茱萸制）中鹽酸小檗堿的含量變化有顯著影響，而對吳茱萸堿的含量影響不明顯。隨著炒制溫度的升高，鹽酸小檗堿的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當炒制時間達到6 min時，鹽酸小檗堿的含量達到最高值，此時，吳茱萸堿的含量變化不大。因此，炒制時間為6 min為佳。

表2 不同炒制時間對吳茱萸制黃連中吳茱萸堿及鹽酸小檗堿質(zhì)量分數(shù)的影響 %

2.4.6 烘制溫度的考察 分別稱取黃連飲片5 份，每份100 g，各加入?yún)擒镙侵?0 mL，吳茱萸汁用量為10%，浸泡24 h，不時翻動，直至汁盡藥透，于炒制溫度為90 ℃炒制6 min，取出。分別于30、40、50、60、70 ℃烘箱烘制24 h。經(jīng)HPLC 檢測，計算吳茱萸堿及鹽酸小檗堿的含量。由表3 可知，烘制溫度對黃連（吳茱萸制）中吳茱萸堿的含量變化有顯著影響，而對鹽酸小檗堿的含量影響不明顯。隨著炒制溫度的升高，吳茱萸堿的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當烘制溫度為60 ℃時，吳茱萸堿的含量達到最高值，此時，鹽酸小檗堿堿的含量變化不大。因此，烘制溫度為60 ℃時為佳。

表3 不同烘制溫度對吳茱萸制黃連中吳茱萸堿及鹽酸小檗堿質(zhì)量分數(shù)的影響 %

2.4.7 烘制時間 分別稱取黃連飲片5 份，每份100 g，各加入?yún)擒镙侵?0 mL，吳茱萸汁用量為10%，浸泡24 h，不時翻動，直至汁盡藥透，于飲片溫度為90 ℃炒制6 min，取出。于60 ℃烘箱分別烘制24、36、48、60、72 h。經(jīng)HPLC 檢測，計算吳茱萸堿及鹽酸小檗堿的含量。由表4 可知，烘制時間對黃連（吳茱萸制）中鹽酸小檗堿的含量變化有顯著影響，而對吳茱萸堿的含量影響不明顯。隨著烘制時間的延高，鹽酸小檗堿的含量呈現(xiàn)遞減的趨勢，當烘制時間為24 h 時，鹽酸小檗堿的含量為最高值，此時，吳茱萸堿的含量變化不大。因此，烘制時間為24 h時為佳。

表4 不同烘制時間對吳茱萸制黃連中吳茱萸堿及鹽酸小檗堿質(zhì)量分數(shù)的影響 %

2.5 正交試驗

根據(jù)單因素得出的最佳提取條件，設(shè)計四因素三水平正交試驗，并進行極差分析和方差分析。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以影響吳茱萸堿及鹽酸小檗堿含量的炒制溫度（A）、炒制時間（B）、烘制溫度（C）為考察因素，進行L9（34）正交試驗，以吳茱萸堿和鹽酸小檗堿的含量的總評“歸一值”（OD）為評價指標，根據(jù)Hassan 法對各個指標進行均一化處理。

式中di為單個指標的優(yōu)化指數(shù)，Yi為實測值，Ymin和Ymax系指每一指標在不同次試驗中測得的最小值和最大值。

式中A為歸一值，k為指標數(shù)。

篩選黃連（吳茱萸制）最佳炮制工藝。因素水平及正交試驗結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 吳茱萸制黃連炮制工藝L9（34）正交試驗

表6 OD的方差分析

根據(jù)正交試驗結(jié)果分析可知，各因素對工藝影響順序為A＞C＞B，最優(yōu)炮制工藝為A2B2C3，各因素對實驗結(jié)果沒有顯著影響。綜合實際成本考慮，確定工藝：取生黃連飲片，加入?yún)擒镙侵?0 mL，浸泡24 h，不時翻動，直至汁盡藥透，于90 ℃炒制6 min，取出，于70 ℃烘箱烘制24 h，即得。

3 驗證實驗

選取3 批黃連飲片，均按單因素及正交試驗篩選的最優(yōu)炮制工藝進行驗證，分別按照2.1、2.2、2.3 項下方法測定吳茱萸堿及鹽酸小檗堿的含量，吳茱萸堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.51%、0.49%、0.53%，RSD 為3.92%；鹽酸小檗堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.58%、0.55%、0.57%，RSD 為2.70%。驗證結(jié)果表明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

4 討論

藥汁制飲片是中藥炮制獨具特色的炮制工藝，藥汁制法最早出現(xiàn)在《劉涓子鬼遺方》，首次明確提出藥汁制則是在南北朝時期的《雷公炮炙論》，之后歷代本草中均收錄有藥汁制法[13]。藥汁制的炮制目的主要有增強療效、降低毒性、緩和不良反應(yīng)等[14]。黃連的炮制品眾多，其中以吳茱萸制黃連最具特色，結(jié)合現(xiàn)代化學成分、藥理作用的研究可知，萸黃連為歷代本草所記載的經(jīng)典藥對。

研究表明，黃連中清熱燥濕的有效成分為鹽酸小檗堿，《中國藥典》2020 年版以鹽酸小檗堿為含量測定指標，再加上黃連中的生物堿類成分存在種類差異[15]，最終本研究以鹽酸小檗堿為測定指標。吳茱萸的散寒止痛有效成分為生物堿類成分，其中又以吳茱萸堿為其最有效活性成分，最終選擇吳茱萸堿為含量測定指標。

本研究選用了HPLC，操作簡便、穩(wěn)定性好、方便易行，是一種簡便快速的含量測定方法，可為吳茱萸炮制黃連工藝研究及質(zhì)量標準的建立提供參考。選擇考察炒制溫度、炒制時間、烘制溫度、烘制時間4 個因素，以最終的吳茱萸制黃連中的鹽酸小檗堿與吳茱萸堿的含量為評價指標，篩選出最佳的工藝。本研究所確定的吳茱萸制黃連炮制品的最佳炮制工藝參數(shù)，可為黃連炮制標準作業(yè)流程提供技術(shù)參數(shù)，為制備吳茱萸制黃連標準提供參考。