顧夢(mèng)影，劉志可，吳佩玲，薛健

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

中藥材鐵皮石斛具有腸道免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤[2-3]等藥理作用，市場(chǎng)需求巨大。目前，90%以上的鐵皮石斛藥材來(lái)源于人工栽培[4]。藥用作物規(guī)?；耘嘞罗r(nóng)藥使用難以避免，為防止農(nóng)藥殘留危害人體健康，相關(guān)部門在逐步制定中藥材中農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）值，通過(guò)安全性評(píng)價(jià)保證中藥材用藥安全。

精甲霜靈是在中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部登記的用于鐵皮石斛疫病防治的農(nóng)藥，但尚未設(shè)置其MRL 值。另外，在課題組前期殘留篩查研究中發(fā)現(xiàn)，還有一些農(nóng)藥未經(jīng)登記，但檢出率和檢出量都很高，如常被種植基地和農(nóng)戶用于防治霜霉病的嘧菌酯，存在農(nóng)藥殘留導(dǎo)致的膳食風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)于鐵皮石斛的農(nóng)藥殘留規(guī)律研究已有少量文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，但目前尚無(wú)精甲霜靈和嘧菌酯消解動(dòng)態(tài)的研究報(bào)道，故本研究選取兩者為試驗(yàn)農(nóng)藥，按《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788—2018）[8]施藥，研究其在鐵皮石斛中的殘留行為，以期為兩者在鐵皮石斛上的安全合理使用及MRL 值制定等提供參考。

1 材料

5500QTRAP 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；XHF-D 型高速勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；80-2型離心沉淀器（浙江金壇醫(yī)療儀器廠）；LABOROTA4000/4 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（德國(guó)海道夫公司）。

68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑和25%嘧菌酯懸浮劑（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；精甲霜靈和嘧菌酯對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度均為100 mg·L-1，購(gòu)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

供試種苗為浙江樂(lè)清雁蕩紅桿品系多年生馴化苗，鐵皮石斛樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo的新鮮莖。

2 方法

2.1 田間試驗(yàn)

于2021 年4 月在浙江省溫州市大荊鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)基地開(kāi)展田間試驗(yàn)。通過(guò)查詢中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.org.cn/）及田間調(diào)研，確定供試藥劑為68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑和25%嘧菌酯懸浮劑。參照《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788—2018）[8]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[9]，設(shè)計(jì)消解動(dòng)態(tài)和最終殘留試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每小區(qū)面積15 m2，隨機(jī)排列，小區(qū)處理間設(shè)保護(hù)帶，另設(shè)空白對(duì)照。

2.1.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 施藥時(shí)間為2021年4月8日。68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑按有效成分96 g·hm-2劑量，噴霧施藥1 次；25%嘧菌酯懸浮劑按有效成分300 g·hm-2劑量，噴霧施藥1 次，于施藥2 h 和1、2、3、5、7、10、14、21、28 d 后取樣，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取5～10 個(gè)點(diǎn)，采集300 g 生長(zhǎng)正常的鐵皮石斛莖條。每行距離兩端0.5 m 內(nèi)和小區(qū)的邊行不采樣。樣品裝入惰性塑料樣品袋中，填寫(xiě)標(biāo)簽，及時(shí)貯存于-20 ℃冰柜中。

2.1.2 最終殘留試驗(yàn) 采用2.1.1 項(xiàng)下施藥方式及樣品處理，與最后一次施藥間隔14、21 d時(shí)采樣。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 樣品前處理 將采集到的鐵皮石斛莖條進(jìn)行四分法縮分留樣約50 g，剩余的全部進(jìn)行均質(zhì)化處理，然后取其中試樣5 g，精密稱定，加入乙腈25 mL，勻漿處理2 min（轉(zhuǎn)速不低于12 000 r·min-1），加入無(wú)水硫酸鎂-氯化鈉（1∶1）的混合粉末2 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500 次/min）3 min，4000 r·min-1離心3 min（離心半徑為9.5 cm），分取上清液，沉淀再加乙腈25 mL，勻漿處理2 min（轉(zhuǎn)速不低于12 000 r·min-1），4000 r·min-1離心3 min（離心半徑為9.5 cm），合并2 次提取的上清液，減壓濃縮至約1～2 mL，放冷，用乙腈定容至5.0 mL，搖勻，精密吸取1 mL，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 檢測(cè)條件 Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），洗脫梯度（0～2.00min，20%B；2.00～2.01min，20%～70%B；2.01～5.00 min，70%B；5.00～10.00 min，70%～20%B；10.00～13.00 min，20%B）；流速為0.20mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜采用正離子模式掃描；監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子噴霧電壓（IS）為+5.5kV；離子源溫度為550 ℃；霧化氣（GS1）壓力為50 psi（1 psi≈6.895 kPa）；輔助氣（GS2）壓力為50 psi；氣簾氣（CUR）壓力為35 psi；精甲霜靈和嘧菌酯的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[10]。

2.3 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

按照《食品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》[11]，采用公式（1）計(jì)算慢性風(fēng)險(xiǎn)商（RQ）。

式中，STMR 為農(nóng)藥在某種食品中的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值（mg·kg-1）；F為一般人群對(duì)該食品的消費(fèi)量（kg），鐵皮石斛作為食藥物質(zhì)管理時(shí)，推薦用量為不超過(guò)0.003 5 kg·d-1[12]，當(dāng)其作為中藥材使用時(shí)，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版鐵皮石斛項(xiàng)下推薦日用量為0.006～0.012 kg[13]，且鮮石斛的含水量較高，一般為80%[14]，因此從風(fēng)險(xiǎn)最大化角度出發(fā)，本研究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算中F值，取其藥用量平均值0.045 kg；bw為人均體質(zhì)量（按60 kg 計(jì)）；ADI 為農(nóng)藥的每日允許攝入量（mg·kg-1bw）。

當(dāng)RQ＜100%時(shí)，認(rèn)為該農(nóng)藥殘留對(duì)一般人群健康的影響在可接受的風(fēng)險(xiǎn)水平，比值越小，風(fēng)險(xiǎn)越低，并可在此基礎(chǔ)上推薦其MRL值標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度

前處理方法參照《中國(guó)藥典》2020 年版禁用農(nóng)藥殘留測(cè)定法項(xiàng)下直接處理法[15]。由于本研究測(cè)定對(duì)象為鮮藥材，考慮到水分的存在和其對(duì)干物質(zhì)量的影響，故對(duì)方法進(jìn)行微調(diào)。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，在0.02、0.10、0.50 mg·kg-13個(gè)添加水平下，精甲霜靈加樣回收率為78.1%～87.1%，RSD 為1.3%～4.6%（n=5），嘧菌酯加樣回收率為77.6%～85.5%，RSD 為1.3%～5.8%（n=5）。精甲霜靈和嘧菌酯的定量限均為0.005 mg·kg-1。該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，符合實(shí)驗(yàn)需求。

表1 精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛中的加樣回收率和RSD（n=5）

3.2 精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛上的消解動(dòng)態(tài)

以采樣距施藥的時(shí)間間隔為橫坐標(biāo)，精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛鮮條中的殘留量為縱坐標(biāo)繪制農(nóng)藥殘留動(dòng)態(tài)曲線，見(jiàn)圖1。精甲霜靈和嘧菌酯的原始沉積量分別為（0.569 0±0.022 3）mg·kg-1（n=3）和（0.934 5±0.004 6）mg·kg-1（n=3），殘留量隨著時(shí)間的推移而逐漸降低。實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯示，第0 天和第1 天的殘留量變化異常，推測(cè)施藥后第2 天清晨基地灌溉水的沖刷導(dǎo)致，其中精甲霜靈水中溶解度（26 g·L-1，25 ℃）大于嘧菌酯（0.006 g·L-1，20 ℃），其受影響的程度也更大。故將第0 天的數(shù)據(jù)舍棄，從第1 天開(kāi)始進(jìn)行殘留消解數(shù)據(jù)的擬合，線性擬合表明其消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型。精甲霜靈一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程為y=0.228 7e-0.1085t（r=0.965 1），消解半衰期（t1/2）為6.39～7.52 d；嘧菌酯一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程為y=0.789 6e-0.0616t（r=0.971 0），t1/2為11.25～12.46 d，結(jié)果表明兩者均屬于易降解農(nóng)藥（t1/2＜30 d）[16]。有研究報(bào)道，精甲霜靈在黃瓜[17]、馬鈴薯[18]等作物上的t1/2為1.0～10.5 d；嘧菌酯在水稻[19]、大豆[20]等作物上的t1/2為0.8～9.1 d。精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛中的t1/2與在上述作物中的t1/2相比，略有差異，這可能與作物自身及其生長(zhǎng)狀態(tài)、栽培模式、施藥方式、受光照、風(fēng)雨等自然環(huán)境影響程度等因素有關(guān)。

圖1 精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛上的殘留消解曲線

3.3 精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛上的最終殘留

本研究結(jié)果表明，68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑按有效成分96 g·hm-2劑量，噴霧施藥1 次；25%嘧菌酯懸浮劑按有效成分300 g·hm-2劑量，噴霧施藥1 次，距最后一次施藥14 d 時(shí)采收，鐵皮石斛中精甲霜靈殘留量為（0.028 6±0.004 9）mg·kg-1（n=3），嘧菌酯的殘留量為（0.329 1±0.021 2）mg·kg-1（n=3），STMR 分別為0.031、0.350 mg·kg-1；距最后一次施藥21 d 時(shí)采收，精甲霜靈殘留量為（0.022 2±0.004 2）mg·kg-1（n=3），嘧菌酯殘留量為（0.168 6±0.033 3）mg·kg-1（n=3），STMR 分別為0.024、0.184 mg·kg-1。鐵皮石斛中最終殘留水平與施藥劑量、采收間隔期等有關(guān)，隨著采樣間隔期延長(zhǎng)，農(nóng)藥殘留量也逐漸降低。

3.4 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021），精甲霜靈的ADI值為0.08 mg·kg-1、嘧菌酯的ADI 值為0.2 mg·kg-1，結(jié)合本研究得到的STMR值，按公式（1）進(jìn)行計(jì)算，可以得出精甲霜靈和嘧菌酯的慢性風(fēng)險(xiǎn)商值分別為0.029%和0.130%，表明在規(guī)范施用2 種農(nóng)藥后第14 天，食用鐵皮石斛不會(huì)引起消費(fèi)者的慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論與討論

本研究為建立常用農(nóng)藥在鐵皮石斛上的安全使用評(píng)價(jià)體系提供了參考。田間消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果顯示，精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛上的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，t1/2分別為6.39～7.52、11.25～12.46 d。利用最終殘留試驗(yàn)得到的STMR 值，進(jìn)行長(zhǎng)期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示兩者對(duì)一般人群的風(fēng)險(xiǎn)商均遠(yuǎn)低于100%，造成的風(fēng)險(xiǎn)是可接受的。

目前，世界各國(guó)都未規(guī)定精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛上的MRL 值，為達(dá)到防治病害同時(shí)降低農(nóng)藥殘留的目的，參照國(guó)內(nèi)外MRL 標(biāo)準(zhǔn)及本次試驗(yàn)結(jié)果，建議68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑和25%嘧菌酯懸浮劑分別按有效成分96、300 g·hm-2各施藥1次，推薦安全采收間隔為14 d。根據(jù)膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果和《食品中農(nóng)藥最大殘留限量制定指南》，建議精甲霜靈和嘧菌酯在鐵皮石斛上的MRL 值分別為0.1、1.0 mg·kg-1。