張明倩，崔爽，梁五林，郭凡帆，張?zhí)祛＃涛暮?，歐文靜，伍永鴻，張仲毅，葛東宇，張碩峰*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.秦皇島市山海關(guān)藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 秦皇島 066000；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 102488

冠心病和抑郁癥是2 種最常見的人類健康問題，是影響全球疾病負(fù)擔(dān)的兩大主要原因，且兩者之間存在復(fù)雜的相互聯(lián)系，抑郁癥會(huì)導(dǎo)致心血管疾病，而心血管疾病又會(huì)導(dǎo)致抑郁癥[1]。有研究表明，抑郁癥是冠心病的另一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，會(huì)增加患者發(fā)生主要心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響心血管疾病預(yù)后，影響患者生活質(zhì)量[2]。急性心肌梗死作為冠心病的典型急診表現(xiàn)，具有高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)。1993年，F(xiàn)rasure-Smith等[3]首次將心肌梗死后抑郁作為心臟全因死亡率增加3～4 倍的重要預(yù)測(cè)因子。有研究顯示[4]，急性心肌梗死后平均20%的患者確診為抑郁癥，在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）之后，焦慮患病率為25%～37%，而抑郁的患病率可能高達(dá)67%，一年隨訪期間數(shù)據(jù)變化穩(wěn)定，仍有81%的患者在12 個(gè)月后表現(xiàn)出抑郁癥狀，76%的患者表現(xiàn)焦慮癥狀[5]。這些焦慮抑郁癥狀均是影響患者后續(xù)發(fā)病率和死亡率的潛在因素，使心血管疾病的治療復(fù)雜化，使心血管預(yù)后惡化。

心血管疾病并發(fā)抑郁的現(xiàn)狀不容忽視，近年來越來越多的臨床醫(yī)師在治療軀體疾病的同時(shí)更加重視患者心理狀況對(duì)疾病的影響，然而由于臨床醫(yī)師對(duì)心理障礙的辨識(shí)能力普遍較低，診療干預(yù)力度較少，對(duì)此病的治療僅僅局限在常規(guī)藥物治療基礎(chǔ)上給予抗焦慮抑郁藥物（氟西汀、舍曲林、西酞普蘭和米氮平）或輔以心理治療，化學(xué)藥不良反應(yīng)多且明顯，臨床效果不盡人意。中醫(yī)藥遵循辨證論治，從患者整體出發(fā)，通過病證結(jié)合，制定個(gè)體化治療方案，可兼顧冠心病和抑郁癥，臨床治療效果較佳，患者易于接受。養(yǎng)心生脈顆粒是一種經(jīng)典的中藥配方，是由經(jīng)典名方“生脈飲”和自擬方“二參湯”創(chuàng)制而成，由人參、麥冬、丹參、五味子、龍眼肉、枸杞子、赤芍、牛膝、郁金、木香、佛手、茯冬、澤瀉、甘草組成，具有養(yǎng)心生脈、安神寧心、理氣活血、補(bǔ)腎健脾的功效。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁的潛在作用靶點(diǎn)及通路，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討其作用機(jī)制，以期為養(yǎng)心生脈顆粒臨床兼治冠心病和抑郁癥提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

無特定病原體（SPF）級(jí)SD 大鼠42 只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（京）-2019-0010。大鼠自購(gòu)入起飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，可自由獲取食物和飲用水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定，審核批準(zhǔn)號(hào)為BUCM-4-2021122201-4103。

1.2 試藥

養(yǎng)心生脈顆粒（秦皇島市山海關(guān)藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20190221）；鹽酸氟西汀膠囊（蘇州中化藥品工業(yè)有限公司，批號(hào)：55419005）；復(fù)方丹參片（上海凱合榮圖們藥業(yè)有限公司，批號(hào)：202010001）；蛋白定量試劑盒（BCA，凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：KGP902）、小鼠抗蛋白激酶B（Akt）單克隆抗體（批號(hào)：60203-2-Ig）、小鼠抗Akt 磷酸化[絲氨酸（Ser）473]單克隆抗體（批號(hào)：66444-1-Ig）、小鼠抗哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）單克隆抗體（批號(hào)：66888-1-Ig）、小鼠抗mTOR磷酸化（Ser2448）單克隆抗體（批號(hào)：67778-1-Ig）、小鼠抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）單克隆抗體（批號(hào)：60225-1-Ig）、小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)：66009-1-Ig）、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G 二抗（批號(hào)：SA00001-1）、山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：SA00001-2）均購(gòu)自美國(guó)ProteinTech 公司；兔抗PI3K p85 磷酸化[酪氨酸（Tyr）473]/p55（Tyr199）單克隆抗體（批號(hào)：17366，美國(guó)Cell Signaling公司）。

1.3 儀器

Noldus Etho Vision XT9 型采集分析系統(tǒng)（荷蘭Noldus 公司）；5200Multi型凝膠成像分析儀（上海天能科技有限公司）；BL-420I型信息集成信號(hào)采集與處理系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；Mini-PROTEAN?Tetra 型垂直式蛋白質(zhì)電泳槽、Mini-Trans-Blot?Module型槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、PowerPac?HC型高電流電泳儀電源均購(gòu)于上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 養(yǎng)心生脈顆粒與疾病潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）和中國(guó)知網(wǎng)檢索養(yǎng)心生脈顆?；钚猿煞帧＠胊dmetSAR 數(shù)據(jù)庫（http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/）進(jìn)行口服生物利用度（OB）、胃腸吸收（IA）和類藥性篩選五原則篩選，采用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)活性成分靶點(diǎn)信息。通過GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（http://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫，以“acute myocardial infarction”和“depression”為關(guān)鍵詞檢索獲取疾病靶點(diǎn)，將藥物成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁癥的潛在靶點(diǎn)。

2.1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)蛋白間的相互作用進(jìn)行分析，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），研究物種設(shè)置為“Homo sapiens”，combined score＞0.7，得到交集靶點(diǎn)的PPI信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.3 基因本體（GO）生物學(xué)過程和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），限定物種為“Homo sapiens”，閾值P＜0.05，進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，將P值由小到大排序前20 位的富集結(jié)果導(dǎo)入SangerBox 在線作圖平臺(tái)（http://sangerbox.com/Tool/）中進(jìn)行可視化展示。

2.1.4 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)進(jìn)行反向化學(xué)成分預(yù)測(cè)，通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并與排名前20的KEGG信號(hào)通路構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型制備 急性心肌梗死模型制備：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后，可視喉鏡經(jīng)口行氣管插管，連接BL-420I型信息集成信號(hào)采集與處理系統(tǒng)。胸部左側(cè)剪開皮膚，鈍性分離肌肉層，于第2～3 根肋骨開胸，充分暴露心臟，剪開心包膜，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎部位以下心肌組織變白且心電圖ST 段抬高視為造模成功，于30 min后松開結(jié)扎線實(shí)現(xiàn)再灌注。

抑郁模型制備：采用孤養(yǎng)加慢性不可預(yù)見應(yīng)激（CUMS）制備大鼠抑郁模型，每天給予大鼠1 種刺激，具體刺激方式包括4 ℃冰水游泳應(yīng)激5 min、潮濕墊料24 h、禁食禁水24 h、夾尾5 min、40 ℃熱應(yīng)激5 min、傾斜鼠籠24 h、24 h 光照7 種刺激，同一刺激不連續(xù)進(jìn)行。除對(duì)照組大鼠不給予任何刺激外，其余大鼠分別于心肌梗死模型制備前2周和后2周給予CUMS刺激。

2.2.2 動(dòng)物分組及給藥 42 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組6 只、假手術(shù)組6 只和模型組30 只。手術(shù)造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組，養(yǎng)心生脈顆粒低、中、高劑量組（劑量分別為2.1、4.2、8.4 g·kg-1）和陽性藥組共5 個(gè)組，均以蒸餾水配制。術(shù)后第2 天灌胃給藥，對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組大鼠以等體積蒸餾水灌胃；養(yǎng)心生脈顆粒低、中、高劑量組大鼠分別按體質(zhì)量（10 mL·kg-1）灌胃給予相應(yīng)藥物，每日2 次；陽性藥組大鼠以10 mg·kg-1鹽酸氟西汀膠囊聯(lián)合0.29 g·kg-1復(fù)方丹參片灌胃，每日1 次。連續(xù)給藥2周后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)及取材。

2.2.3 行為學(xué)檢測(cè) 糖水偏好實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)開始前先進(jìn)行糖水訓(xùn)練，給予每只大鼠1 瓶純水和1 瓶1%蔗糖水，每隔12 h 調(diào)換兩水瓶位置。正式實(shí)驗(yàn)開始前禁食禁水24 h 后進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)，兩水瓶質(zhì)量一致，30 min 調(diào)換水瓶位置，60 min 取走兩水瓶稱質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算糖水偏好百分比。

強(qiáng)迫游泳：將大鼠放入水深40 cm，水溫（25±2）℃的有機(jī)玻璃圓桶游泳6 min，攝像機(jī)記錄每只大鼠的游泳視頻，計(jì)算游泳后4 min 內(nèi)的不動(dòng)狀態(tài)（即漂浮不做掙扎）的累計(jì)時(shí)間。

2.2.4 大鼠心功能檢測(cè) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL·kg-1）麻醉大鼠，仰臥位固定，行右側(cè)頸總動(dòng)脈插管，待左室壓力曲線穩(wěn)定后，通過BL-420I 型信息集成信號(hào)采集與處理系統(tǒng)分析檢測(cè)大鼠1 min 內(nèi)左心室舒張末期壓力（LVDP）、左心室收縮壓力（LVSP）、左心室壓力上升的最大變化率（+dp/dtmax）和左心室壓力下降的最大變化率（-dp/dtmax）。

2.2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌結(jié)構(gòu) 用4%的多聚甲醛溶液固定心肌組織，經(jīng)石蠟包埋，切片。HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織損傷情況，根據(jù)文獻(xiàn)[6]心肌組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)心肌損傷程度進(jìn)行評(píng)分。

2.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)海馬組織PI3K、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá) 取大鼠海馬組織50 mg，加入RIPA 裂解液500 μL，用手持勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，4 ℃、14000 r·min-1離心10 min（離心半徑為6 cm），取上清液，采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)蛋白變性后，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉1.5 h，加入鼠/兔來源的單克隆一抗[稀釋比例PI3K（1∶5000）、p-PI3K（1∶1000）、Akt（1∶5000）、p-Akt（1∶6000）、mTOR（1∶5000）、p-mTOR（1∶5000）]，4 ℃孵育過夜，轉(zhuǎn)移至山羊抗鼠/兔單克隆二抗液（1∶5000）中，置于搖床上室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次15 min，加ECL 顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光，統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析方法，組內(nèi)兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

3.1.1 養(yǎng)心生脈顆?；钚猿煞旨鞍悬c(diǎn)、疾病靶點(diǎn)、藥物與疾病潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 根據(jù)TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫及中國(guó)知網(wǎng)文獻(xiàn)檢索，共收集養(yǎng)心生脈顆粒723個(gè)化學(xué)成分，經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)并篩選出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1451個(gè)，基于GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫收集急性心肌梗死靶點(diǎn)615個(gè)，抑郁癥靶點(diǎn)590個(gè)，去重后與成分靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)54個(gè)（圖1）。

圖1 養(yǎng)心生脈顆粒與疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖

3.1.2 養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁癥潛在靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將54 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，選取置信度＞0.7，進(jìn)行PPI 分析，利用Cytoscape 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），網(wǎng)絡(luò)平均度值為19.11，大于平均值的靶點(diǎn)有24 個(gè)，這24 個(gè)靶點(diǎn)可能是養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁癥關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、Akt1、TNF、IL-1β、IL-10、mTOR、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞單位α（PIK3CA）等與炎癥密切相關(guān)。

圖2 養(yǎng)心生脈顆粒與急性心肌梗死和抑郁癥的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.1.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析 運(yùn)用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，GO 功能富集分析共獲得條目362 個(gè)（P＜0.05），其中生物過程（BP）277 條，細(xì)胞組成（CC）32 條，分子功能（MF）53 條，分別選取P值排名前20 位的BP、CC、MF，使用SangerBox 在線平臺(tái)作可視化展示（圖3）。

圖3 養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁癥的交集靶點(diǎn)GO基因功能富集分析

KEGG 通路富集分析得到與急性心肌梗死和抑郁癥相關(guān)通路39 條（P＜0.05），結(jié)果發(fā)現(xiàn)排名前20的通路涉及5-羥色胺能突觸、TNF 信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、Janus 酪氨酸蛋白激酶（JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等，由此推測(cè)，養(yǎng)心生脈顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)，激活這些信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療急性心肌梗死合并抑郁癥的作用（圖4）。

圖4 養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁癥的交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3.1.4 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將反向預(yù)測(cè)的化學(xué)成分與中藥、交集靶點(diǎn)及3.1.3 項(xiàng)下篩選的排名前20 的通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，分別構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖5～6）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，1個(gè)基因參與多條信號(hào)通路，表明這些通路之間相互影響，參與體內(nèi)多個(gè)生物過程，影響機(jī)體多種生物學(xué)功能，表明養(yǎng)心生脈顆粒通過調(diào)節(jié)多種途徑發(fā)揮治療心肌梗死合并抑郁癥的作用。

圖5 養(yǎng)心生脈顆粒中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

其中，TNF、MAPK、PI3K-Akt 等信號(hào)通路與炎癥關(guān)系密切，研究表明，急性心肌梗死后誘發(fā)外周組織TNF 的釋放可引發(fā)腦內(nèi)皮滲漏和血腦屏障完整性的破壞，從而誘發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)，阻斷TNF 則可逆轉(zhuǎn)患者的抑郁癥狀[7]；MAPK可被心肌梗死后的多種炎性因子激活，并且參與炎性反應(yīng)的調(diào)控，而其表達(dá)水平的降低與抑郁癥密切相關(guān)[8]；PI3K-Akt可通過參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、存活及糖代謝等多個(gè)生物過程，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。研究表明，Akt 與抑郁患者的抑郁嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可增強(qiáng)海馬干細(xì)胞功能[9]；VEGF 可在心肌梗死后引起心臟血管新生，同時(shí)腦內(nèi)VEGF 的表達(dá)過低與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)，抗抑郁藥物可通過上調(diào)海馬VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生發(fā)揮抗抑郁作用。上述信號(hào)通路提示，養(yǎng)心生脈顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控炎癥反應(yīng)、血管生成及能量代謝等發(fā)揮治療急性心肌梗死合并抑郁癥的作用。

通過對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路的綜合分析，PI3K-Akt可被腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/酪氨酸激酶（BDNF/TrkB）、JAK/STAT 等多個(gè)上游信號(hào)通路激活，同時(shí)激活后的PI3K-Akt 又可調(diào)節(jié)下游mTOR、VEGF、MAPK、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、腫瘤蛋白53（TP53）、HIF-1α等多個(gè)關(guān)鍵蛋白，提示PI3K-Akt信號(hào)通路與這些炎癥、凋亡相關(guān)基因和通路有著密切的聯(lián)系，是介導(dǎo)多種細(xì)胞因子促成活的關(guān)鍵通路，在心肌梗死和抑郁癥的治療中也被認(rèn)為是重要的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路[10-11]。因此，推測(cè)養(yǎng)心生脈顆?？赡芡ㄟ^激活PI3K-Akt 通路，介導(dǎo)、調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)分子發(fā)揮治療急性心肌梗死合并抑郁癥的作用。故本研究選取PI3K-Akt 信號(hào)通路及下游mTOR 蛋白進(jìn)行進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以探究養(yǎng)心生脈顆粒治療急性心肌梗死合并抑郁癥的作用機(jī)制。

圖6 養(yǎng)心生脈顆粒中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3.2.1 養(yǎng)心生脈顆粒對(duì)急性心肌梗死合并抑郁大鼠糖水偏好和游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 與對(duì)照組相比，假手術(shù)組大鼠糖水偏好和游泳不動(dòng)時(shí)間均無明顯差異，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠糖水偏好顯著降低（P＜0.01），游泳不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；與模型組比較，養(yǎng)心生脈顆粒各給藥組大鼠的糖水偏好顯著增加（P＜0.01），游泳不動(dòng)時(shí)間明顯減少，以養(yǎng)心生脈顆粒高劑量組降低最為明顯（P＜0.01），其效果與陽性藥組大鼠水平相當(dāng)（表1）。

表1 各組大鼠糖水偏好及游泳不動(dòng)時(shí)間結(jié)果比較（±s, n=6）

表1 各組大鼠糖水偏好及游泳不動(dòng)時(shí)間結(jié)果比較（±s, n=6）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；陽性藥組為10 mg·kg-1鹽酸氟西汀膠囊聯(lián)合0.29 g·kg-1復(fù)方丹參片；表2～4同。

3.2.2 養(yǎng)心生脈顆粒對(duì)急性心肌梗死合并抑郁大鼠心功能的影響 與對(duì)照組相比，假手術(shù)組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)無明顯變化，模型組大鼠LVSP 明顯降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，養(yǎng)心生脈顆粒各給藥組及陽性藥組LVSP 有升高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而養(yǎng)心生脈顆粒各給藥組及陽性藥組LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，表2）。

表2 各組大鼠心功能結(jié)果比較（±s, n=6）

表2 各組大鼠心功能結(jié)果比較（±s, n=6）

3.2.3 養(yǎng)心生脈顆粒對(duì)急性心肌梗死合并抑郁大鼠心肌組織病理學(xué)的影響 對(duì)照組大鼠整體形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常，心肌細(xì)胞完整、排列規(guī)則、無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫、心室結(jié)構(gòu)無明顯異常；假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞較完整、排列規(guī)則、有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠可見到大量的心肌細(xì)胞壞死，結(jié)構(gòu)紊亂、排列不整齊，且伴隨淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生纖維母細(xì)胞填充，組織水腫明顯；養(yǎng)心生脈顆粒低、中、高劑量組大鼠病理結(jié)構(gòu)改變明顯減輕，心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，未見明顯壞死，炎癥明顯減輕；養(yǎng)心生脈顆粒高劑量組大鼠血管周圍可見少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖7、表3）。

表3 各組大鼠心肌組織病理評(píng)分（±s, n=6）

表3 各組大鼠心肌組織病理評(píng)分（±s, n=6）

圖7 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×200）

3.2.4 養(yǎng)心生脈顆粒對(duì)急性心肌梗死合并抑郁大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織PI3K、Akt、mTOR 的磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)心生脈顆粒低劑量組大鼠海馬組織PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平均明顯增加（P＜0.05），中劑量組大鼠海馬組織PI3K、Akt 磷酸化表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），但mTOR 磷酸化表達(dá)不顯著，高劑量組大鼠海馬組織PI3K、Akt、mTOR 的磷酸化水平均無顯著差異，表明養(yǎng)心生脈顆粒對(duì)急性心肌梗死合并抑郁大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)無劑量依賴性（表4、圖8）。

圖8 各組大鼠海馬組織Western blot結(jié)果

表4 各組大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比較（±s, n=3）

表4 各組大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比較（±s, n=3）

4 討論

抑郁癥是心肌梗死患者重要的臨床表現(xiàn)，是心肌梗死患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究表明，伴有抑郁癥的心肌梗死患者則表現(xiàn)出更高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重影響疾病治療與預(yù)后[12]。臨床上治療心梗后抑郁主要以心肌梗死常規(guī)藥物聯(lián)合心理治療和傳統(tǒng)抗抑郁化學(xué)藥為主，此方案不良反應(yīng)明顯，患者治療依從性較差[13]。近年來基于整體觀念的中醫(yī)療法，在心肌梗死伴抑郁治療中具有較大的發(fā)展前景。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以整合、系統(tǒng)強(qiáng)調(diào)藥物相互作用為特征，通過構(gòu)建活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體角度預(yù)測(cè)藥物治療疾病的生物分子機(jī)制，其與中醫(yī)整體觀念有著高度的一致性[14]。故本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究養(yǎng)心生脈顆粒治療心肌梗死合并抑郁癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)及相關(guān)通路，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵通路。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)從養(yǎng)心生脈顆粒篩選出靶點(diǎn)數(shù)目較多的活性成分包括黃芩素、齊墩果酸、棕櫚酸、人參皂苷、丹參素、欖香素等。研究表明，黃芩素可通過調(diào)控PI3K/Akt、MAPKs及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞缺血/缺氧損傷的作用[15]；齊墩果酸不僅具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)控血管生成、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等藥理作用，而且對(duì)海馬神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用，可以通過上調(diào)海馬區(qū)BDNF、TrkB、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶I（CaMKI）、蛋白激酶C（PKC）、N-甲基-D-天冬氨酸受體2B（NMDAR2B）蛋白表達(dá)，減輕海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)損傷，提高大腦記憶能力，此外，齊墩果酸還具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮的作用[16-17]；棕櫚酸是血漿脂質(zhì)中含量最豐富的游離脂肪酸，血液中棕櫚酸積累過多可以通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致炎性反應(yīng)、細(xì)胞肥大及功能障礙，進(jìn)而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展[18]；人參皂苷通過參與對(duì)MAPK、PI3K/Akt、VEGF 等多條信號(hào)的調(diào)控，對(duì)保護(hù)心臟功能具有重要的意義，同時(shí)在抗疲勞、抗應(yīng)激、抗抑郁、改善記憶功能、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等方面的作用也已被證實(shí)[19]。提示養(yǎng)心生脈顆粒通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療急性心肌梗死合并抑郁的作用機(jī)制，以及這些成分在其中的重要作用。

經(jīng)PPI 及KEGG 結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，藥物的活性成分與疾病的靶點(diǎn)聯(lián)系緊密，PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)度值排名篩選得到IL-6、Akt1、VEGF-A、TNF、c-Fos 原癌基因蛋白（FOS）、TP53、CASP3、IL-1β、IL-10、mTOR 等關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，表明這些靶點(diǎn)在養(yǎng)心生脈顆粒治療心肌梗死合并抑郁癥中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，KEGG 通路富集分析結(jié)果結(jié)合急性心肌梗死和抑郁癥的共病特點(diǎn)，關(guān)鍵通路涉及TNF 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，其中PI3K-Akt 信號(hào)通路可能在急性心肌梗死合并抑郁癥的治療中發(fā)揮著樞紐作用。研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后，自噬相關(guān)蛋白（LC3Ⅱ和Beclin-1）的表達(dá)增加，激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路后，抑制過度自噬，可減輕大鼠心肌梗死后的組織損傷[20]。另有研究表明抑郁動(dòng)物的自噬水平明顯下降，抗抑郁藥物可通過激活PI3K/Akt/mTOR，抑制大鼠海馬神經(jīng)元的自噬，從而改善抑郁癥狀[21]。此外，文獻(xiàn)顯示PI3K/Akt 信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白[VEGF、HIF-1α、mTOR、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O（FoxO）等]可通過參與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放、谷氨酸能系統(tǒng)功能、細(xì)胞凋亡與自噬、線粒體功能和促血管新生等過程參與心肌梗死和抑郁癥的發(fā)生[22]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織的PI3K、Akt、mTOR 的磷酸化水平明顯下調(diào)，而養(yǎng)心生脈顆粒低、中劑量組可通過上調(diào)上述蛋白磷酸化水平，激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，改善心肌梗死合并抑郁大鼠的心肌組織損傷和抑郁樣行為。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和大鼠體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，養(yǎng)心生脈顆?？赏ㄟ^激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)急性心肌梗死合并抑郁大鼠的心臟保護(hù)作用及抗抑郁作用。