王析瑞，劉永建，劉岑，杜裕，楊洪柳，劉永剛

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程，受體內(nèi)外多種因素共同影響，并會(huì)導(dǎo)致各種其他疾病的發(fā)生。如何延緩衰老及減少其相關(guān)疾病的發(fā)生是人類社會(huì)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。衰老與氧化應(yīng)激的關(guān)系密不可分。衰老的相關(guān)學(xué)說之一氧化應(yīng)激學(xué)說認(rèn)為，氧化性損傷是導(dǎo)致衰老的根本原因，可以通過抗氧化藥物降低體內(nèi)自由基水平，進(jìn)而延緩機(jī)體衰老[1]。

鄰甲氧基肉桂酸（OMA）是一種合成香料，具有特有的脂香氣及花香，主要用于日化香精，還可用于肥皂、化妝品和洗滌劑等用品的加香[2]。鄰甲氧基肉桂酸酯類是日化護(hù)膚品配方中的抗紫外線劑[3]，而其合成的重要原料正是OMA。經(jīng)過初步篩選，OMA 具有一定的抗氧化活性，且其合成工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)溫和、合成原料與試劑廉價(jià)易得、總收率高、具有較高的安全性[4]。OMA 還存在于桂枝中，現(xiàn)代藥理研究表明，桂枝具有良好的抗衰老活性[5-6]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要關(guān)注桂枝的揮發(fā)油部位及復(fù)方功效，較少涉及抗衰老活性成分的研究，其活性成分尚不明確。因此，尋找桂枝抗衰老的活性成分對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡(jiǎn)稱線蟲）與傳統(tǒng)動(dòng)物模型相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，如體形小、壽命短、易操作、成本低、遺傳背景清晰、透明度高、具有完全測(cè)序的基因組及超過65%與人類相關(guān)的基因等[7]。線蟲和哺乳動(dòng)物之間的一些衰老現(xiàn)象很相似，如脂褐素濃度增加、運(yùn)動(dòng)減慢和神經(jīng)系統(tǒng)退化[8]。而且，由于線蟲身體透明，通過熒光標(biāo)記可以直接在體內(nèi)觀察其神經(jīng)元及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這些優(yōu)勢(shì)使線蟲廣泛應(yīng)用于抗衰老疾病的研究中[9-11]。線蟲作為一種模式生物，在鑒定可能有益于延緩衰老的中藥和天然藥物并研究其作用機(jī)制方面具有很高的價(jià)值[12-13]。

本研究采用線蟲模型，探索OMA 對(duì)線蟲體長(zhǎng)、脂褐素含量等的影響，并進(jìn)一步利用線蟲轉(zhuǎn)基因株系探究OMA抗衰老的潛在作用機(jī)制，為其治療衰老等相關(guān)疾病的研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

OMA（批號(hào)：091128，純度≥98%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司）；1-苯氧基-2-丙醇、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、蛋白胨、膽固醇、無(wú)水乙醇、次氯酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自北京虹湖化工有限公司；碳酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、氯化銨、氫氧化鈉等試劑均購(gòu)自蘭博利德生物科技有限公司。

1.2 菌株及線蟲

菌株和線蟲均由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈(zèng)；缺陷型大腸埃希氏菌（Escherichia coliOP50）；野生型線蟲株N2；線蟲株TJ356，基因型：zls356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6 (su1006)]，綠色熒光蛋白（GFP）融合衰變加速因子-16（DAF-16）蛋白；線蟲株CF1553，基因型：muls84 [(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6 (su1006)]，GFP 融合超氧化物歧化酶-3（SOD-3）蛋白。

1.3 儀器

Revco PLUS 型-80 ℃低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；SW-CJ-2FD標(biāo)準(zhǔn)型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司）；SPX-250 型生化培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；SMZ745 型體式顯微鏡、D-LH/LC 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；SP8 型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；YXQ-LS-100SⅡ型高溫高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；KQ100VDB 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BSA124S-CW 型萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；SYG-A2-6 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；LX-300 型迷你離心機(jī)、VORTEX-7 型迷你混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 加藥培養(yǎng)基及加藥E.coli OP50的配制

為保證線蟲能夠充分暴露于藥物中，培養(yǎng)基及E.coliOP50 中都補(bǔ)充了對(duì)應(yīng)濃度的OMA。用DMSO溶解OMA，配制成100 mmol·L-1母液。將配制好的藥物母液與培養(yǎng)基混合，制成含OMA 63、125、250 μmol·L-1的培養(yǎng)液，倒入培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板在室溫下保存，直到瓊脂凝固，然后在4 ℃下保存。用E.coliOP50 溶液對(duì)配制好的藥物母液進(jìn)行稀釋，充分混勻后配制成含OMA不同濃度（63、125、250 μmol·L-1）的食物添加到培養(yǎng)基中。

2.2 線蟲的培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境下，在培養(yǎng)基中接種E.coliOP50 50 μL后，放置于生化培養(yǎng)箱中1 d后可用于培養(yǎng)線蟲。線蟲在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育，培養(yǎng)于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，3～4 d 轉(zhuǎn)1 次板，避免線蟲過于擁擠或處于饑餓狀態(tài)而進(jìn)入dauer時(shí)期，同時(shí)還需要保證線蟲的干凈，防止霉菌、細(xì)菌及螨蟲等污染。

2.3 OMA抗衰老活性研究

2.3.1 線蟲體長(zhǎng)測(cè)定 將經(jīng)過同步化生長(zhǎng)至L4期的線蟲分為對(duì)照組和OMA 不同濃度組，分別置于含OMA 0、63、125、250 μmol·L-1的培養(yǎng)板中，給藥處理24 h后，將線蟲挑至滴加1滴M9溶液（磷酸二氫鉀+磷酸二氫鈉）的載玻片上，再滴加1滴0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，將玻片放置于倒置顯微鏡上，對(duì)至少60條線蟲進(jìn)行拍照，利用倒置顯微鏡自帶軟件測(cè)量線蟲體長(zhǎng)。

2.3.2 線蟲頭部擺動(dòng)能力測(cè)定 線蟲分組及處理同2.3.1項(xiàng)下，給藥處理3 d 后，將線蟲轉(zhuǎn)移到不含E.coliOP50 的培養(yǎng)基上。線蟲頭部擺動(dòng)方向改變，其轉(zhuǎn)向必須轉(zhuǎn)過其身體朝向方向，記為1 次數(shù)據(jù)。在體視顯微鏡下觀察并記錄線蟲在20 s 內(nèi)的頭部擺動(dòng)次數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)20條線蟲。

2.3.3 線蟲脂褐素含量測(cè)定 線蟲分組及處理同2.3.1項(xiàng)下，給藥處理5 d 后，將線蟲挑至滴加1 滴M9溶液的載玻片上，再滴加1滴0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，在熒光顯微鏡下觀察線蟲，固定曝光時(shí)間和強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm，拍攝不同組的熒光圖片。之后使用Image J軟件處理圖片，統(tǒng)計(jì)不同組線蟲體內(nèi)脂褐素的熒光強(qiáng)度，每組實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)60條線蟲。

2.3.4 線蟲氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過同步化生長(zhǎng)至L4 期的線蟲分為對(duì)照組和OMA 63 μmol·L-1組，分別置于含OMA 0、63 μmol·L-1的培養(yǎng)板中，給藥處理3 d后，將各組線蟲轉(zhuǎn)移至含有0.1%雙氧水（H2O2）的線蟲培養(yǎng)板中，于體視顯微鏡下進(jìn)行觀察，記錄每小時(shí)死亡線蟲的數(shù)量，直到所有線蟲死亡。每組實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)60條線蟲。

2.3.5 線蟲熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 線蟲分組及處理同2.3.4項(xiàng)下，給藥處理3 d 后，將線蟲轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行觀察，記錄每小時(shí)死亡線蟲的數(shù)量，直到所有線蟲死亡。每組實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)60條線蟲。

2.4 OMA抗衰老作用機(jī)制研究

2.4.1 TJ356 線蟲DAF-16 蛋白核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn) TJ356線蟲是GFP 融合DAF-16 蛋白的線蟲。在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光即可統(tǒng)計(jì)DAF-16 蛋白分布情況。將同步化后的TJ356線蟲卵分為對(duì)照組和OMA不同濃度組，分別置于含OMA 0、63、125、250 μmol·L-1的培養(yǎng)板中。給藥處理3 d 后，將線蟲挑至滴加1 滴M9 溶液的載玻片上，再滴加1 滴0.5% 1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線蟲并拍攝熒光圖片。統(tǒng)計(jì)各組的線蟲總數(shù)及線蟲發(fā)生核轉(zhuǎn)位占線蟲總數(shù)的比例。每組實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)30條線蟲。

2.4.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn) CF1553線蟲是一種GFP 標(biāo)記SOD-3 蛋白的線蟲，在熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光強(qiáng)度即可直接反映出SOD-3蛋白的表達(dá)情況。將同步化后的CF1553線蟲卵分為對(duì)照組和OMA 不同濃度組，分別置于含OMA 0、63、125、250 μmol·L-1的培養(yǎng)板中。給藥處理3 d后，將線蟲挑至滴加1滴M9溶液的載玻片上，再滴加1滴0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液麻醉，待蟲體變直，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線蟲并拍攝熒光圖片。然后使用Image J軟件處理圖片，統(tǒng)計(jì)不同組線蟲全身的熒光強(qiáng)度。每組實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)30條線蟲。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SAS 9.4 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過單因素方差分析對(duì)觀察到的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性評(píng)估，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 OMA抗衰老活性研究

3.1.1 線蟲體長(zhǎng)測(cè)定 利用倒置顯微鏡自帶軟件進(jìn)行線蟲體長(zhǎng)的測(cè)定（圖1）。不同濃度的OMA 對(duì)線蟲體長(zhǎng)的影響見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OMA 可以抑制線蟲的體長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，隨著濃度的增加，線蟲體長(zhǎng)不斷減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖1 測(cè)量線蟲體長(zhǎng)代表性圖（×40）

表1 OMA對(duì)線蟲體長(zhǎng)的影響（±s, n=60）

表1 OMA對(duì)線蟲體長(zhǎng)的影響（±s, n=60）

注：與對(duì)照組比較，***P＜0.001；表4同。

3.1.2 線蟲頭部擺動(dòng)能力測(cè)定 不同濃度的OMA對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度OMA 組線蟲20 s頭部擺動(dòng)頻率都有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 OMA對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響（±s, n=20）

表2 OMA對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響（±s, n=20）

3.1.3 線蟲脂褐素含量測(cè)定 不同濃度的OMA 對(duì)線蟲脂褐素沉積的影響見圖2 和表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度OMA 組線蟲體內(nèi)脂褐素含量均顯著降低（P＜0.001）。與OMA 63 μmol·L-1組相比，OMA 125、250 μmol·L-1組線蟲體內(nèi)脂褐素含量顯著升高（P＜0.001）。OMA 63 μmol·L-1組線蟲體內(nèi)脂褐素含量最低，對(duì)線蟲體內(nèi)脂褐素沉積的減緩作用最強(qiáng)，因此后續(xù)氧化應(yīng)激及熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)選擇OMA 給藥濃度為63 μmol·L-1。

圖2 OMA各濃度組線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈭D（×40）

表3 OMA對(duì)線蟲脂褐素沉積的影響（±s, n=20）

表3 OMA對(duì)線蟲脂褐素沉積的影響（±s, n=20）

注：與對(duì)照組比較，***P＜0.001；與OMA 63 μmol·L-1組比較，###P＜0.001。

3.1.4 線蟲氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 線蟲在H2O2應(yīng)激環(huán)境中培養(yǎng)的生存曲線見圖3。OMA 組線蟲生存曲線與對(duì)照組相比有一定程度的右移，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 氧化應(yīng)激下OMA對(duì)線蟲壽命的影響

3.1.5 線蟲熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 線蟲在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)的生存曲線見圖4。與對(duì)照組相比，在熱應(yīng)激條件下，OMA 組線蟲在4～6 h 生存率提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 熱應(yīng)激下OMA對(duì)線蟲壽命的影響

3.2 OMA抗衰老作用機(jī)制研究

3.2.1 TJ356線蟲DAF-16蛋白核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn) DAF-16蛋白可調(diào)節(jié)線蟲的抗逆性和持久性，其核定位對(duì)激活下游基因至關(guān)重要。OMA 對(duì)線蟲DAF-16 核定位的影響見圖5。DAF-16::GFP 的熒光在TJ356 線蟲細(xì)胞內(nèi)的定位主要分為細(xì)胞質(zhì)定位、中間定位及細(xì)胞核定位。結(jié)果表明，對(duì)照組中，DAF-16::GFP 熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為51.75%，中間定位占比為46.49%，細(xì)胞核定位占比為1.75%；OMA處理后，63 μmol·L-1濃度組中DAF-16::GFP 熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為26.74%，中間定位占比為51.16%，細(xì)胞核定位占比為22.09%；125 μmol·L-1濃度組中DAF-16::GFP熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為13.16%，中間定位占比為60.53%，細(xì)胞核定位占比為26.32%；250 μmol·L-1濃度組中DAF-16::GFP 熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為22.22%，中間定位占比為47.22%，細(xì)胞核定位占比為30.56%。結(jié)果表明OMA 能顯著促進(jìn)DAF-16向細(xì)胞核的遷移。

圖5 OMA各濃度組TJ356線蟲體內(nèi)GFP熒光圖（×40）

3.2.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達(dá) 為了進(jìn)一步確認(rèn)OMA 是否會(huì)影響DAF-16 的轉(zhuǎn)錄活性，利用SOD-3::GFP 的轉(zhuǎn)基因線蟲CF1553 觀察SOD-3 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6 及表4 所示，給藥3 d 后，與對(duì)照組相比，OMA 各濃度給藥組線蟲的熒光強(qiáng)度均有所增高，250 μmol·L-1濃度組線蟲的熒光強(qiáng)度最高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。進(jìn)一步說明樣品能激活DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)線蟲DAF-16轉(zhuǎn)錄入核，從而促進(jìn)SOD-3蛋白表達(dá)。

表4 OMA對(duì)CF1553線蟲SOD-3蛋白表達(dá)的影響（±s, n=30～60）

表4 OMA對(duì)CF1553線蟲SOD-3蛋白表達(dá)的影響（±s, n=30～60）

圖6 OMA各濃度組CF1553線蟲體內(nèi)GFP熒光圖（×40）

4 討論

本研究探討了OMA抗衰老的活性作用及其分子機(jī)制。與其他生物體一樣，線蟲表現(xiàn)出許多與年齡相關(guān)的變化。隨著年齡的增長(zhǎng)，線蟲的活躍性降低，表現(xiàn)出一些不協(xié)調(diào)的運(yùn)動(dòng)，可通過測(cè)量其身體彎曲頻率、頭部擺動(dòng)頻率等檢測(cè)這種變化。還有研究發(fā)現(xiàn)，線蟲抗氧化能力的提高及壽命的延長(zhǎng)往往伴隨著線蟲體長(zhǎng)的減小[14-15]。本研究結(jié)果表明，OMA 可以抑制線蟲的體長(zhǎng)并降低其頭部擺動(dòng)頻率，其可能會(huì)提高線蟲抗氧化的能力并延長(zhǎng)線蟲的壽命。其他與年齡相關(guān)的變化還包括脂褐素積累增加[16]。脂褐素是一種自身熒光色素，在線蟲體內(nèi)積累，可以通過熒光顯微鏡檢測(cè)。本研究通過檢測(cè)給藥5 d后線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，OMA 組線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度均明顯降低，對(duì)線蟲體內(nèi)脂褐素沉積減緩有一定作用。說明OMA可以有效減少衰老引起的有害物質(zhì)脂褐素的沉積，減少對(duì)機(jī)體的損傷，具有顯著的延緩衰老的活性。

與衰老相關(guān)的信號(hào)通路中，胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IIS）信號(hào)通路的研究最為廣泛。DAF-16是作用于IIS信號(hào)通路的一種主要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)線蟲的抗逆性和持久性，DAF-16的核定位對(duì)激活下游基因至關(guān)重要。激活線蟲DAF-16轉(zhuǎn)錄因子能上調(diào)一系列抗脅迫基因的表達(dá)，抑制線蟲體內(nèi)異常的蛋白沉積與錯(cuò)誤折疊，提高機(jī)體的抗脅迫能力，延長(zhǎng)線蟲壽命。有研究報(bào)道，DAF-16 不僅受IIS 信號(hào)通路的調(diào)控，還受到許多其他信號(hào)通路和調(diào)控蛋白的調(diào)控。這些調(diào)控可以影響DAF-16的表達(dá)水平、核定位及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響DAF-16對(duì)下游抗脅迫基因如sod-3的調(diào)控，調(diào)節(jié)線蟲的生理活動(dòng)。

本研究采用線蟲轉(zhuǎn)基因株系作為動(dòng)物模型，通過DAF-16 核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)和SOD-3 融合GFP 熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)探究OMA 抗衰老活性是否依賴IIS 分子信號(hào)通路。TJ356株系線蟲攜帶DAF-16::GFP融合蛋白，在正常生長(zhǎng)發(fā)育條件下，TJ356 株系線蟲周身呈現(xiàn)均勻彌散的綠色熒光，當(dāng)DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子被激活時(shí)，將發(fā)生核轉(zhuǎn)位，綠色熒光細(xì)胞質(zhì)定位轉(zhuǎn)移為細(xì)胞核定位，在熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的點(diǎn)狀綠色熒光[17]。給藥作用3 d 后，OMA 各濃度給藥組線蟲在熒光顯微鏡下能明顯觀察到熒光點(diǎn)，說明OMA能激活DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)線蟲DAF-16 發(fā)生核轉(zhuǎn)位。研究發(fā)現(xiàn)，SOD 對(duì)過量氧自由基具有清除作用，能減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷[18]，且sod-3是daf-16的直接下游靶基因之一，由daf-16直接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。DAF-16 轉(zhuǎn)錄活性通過其下游基因sod-3的表達(dá)加以驗(yàn)證。轉(zhuǎn)基因線蟲CF1553 攜帶SOD-3::GFP融合蛋白，當(dāng)CF1553 線蟲sod-3基因被激活時(shí)，線蟲體內(nèi)將會(huì)大量表達(dá)GFP。本研究通過CF1553線蟲SOD-3::GFP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OMA 能顯著增強(qiáng)CF1553 線蟲熒光強(qiáng)度，增加SOD-3蛋白表達(dá)量。

綜上所述，OMA 具有良好的抗衰老活性，其作用機(jī)制可能是通過IIS 途徑激活DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)線蟲體內(nèi)DAF-16 核轉(zhuǎn)位，上調(diào)SOD-3 表達(dá)水平，提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力延緩線蟲衰老。本研究初步闡釋了OMA抗衰老的作用機(jī)制，為其在抗氧化、抗衰老方面的進(jìn)一步研究提供了一定的理論依據(jù)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了思路。