李錟，王升，田壯，尚興樸，李鵬英，呂朝耕，康傳志，萬(wàn)修福，周利，郭蘭萍，王瑞杉*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；2.中國(guó)中藥有限公司，北京 102600

甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為豆科多年生植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，味甘，性平[1]，可補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤(rùn)肺止咳，能夠調(diào)和諸藥，故有“國(guó)老”之稱。甘草酸和甘草苷是甘草的主要活性成分，具有鎮(zhèn)咳、消炎、解毒、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[2-3]。另外，甘草具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒、耐鹽堿和防風(fēng)固沙能力[4]，還廣泛應(yīng)用于食品、飲料和化妝品等行業(yè)[5-6]。隨著國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)甘草資源需求量的增加，野生資源迅速枯竭，目前市場(chǎng)上甘草藥材多為人工種植，由于地理環(huán)境的差異、種植不規(guī)范導(dǎo)致其質(zhì)量良莠不齊[7]。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為甘草以粉性為佳[8-9]，《本草品匯精要》稱：“根堅(jiān)實(shí)有而肥者為好”[10]?！侗静輳男隆酚涊d：“大而結(jié)者良，出大同，名粉草（彈之有粉出），細(xì)者名統(tǒng)草”[11]。甘草粉性通常量化為淀粉含量或顯微鏡下淀粉粒數(shù)目，認(rèn)為淀粉含量越多則甘草品質(zhì)越好。但關(guān)于甘草粉性與淀粉含量、淀粉粒特征的研究表明，甘草淀粉含量與有效成分含量往往呈負(fù)相關(guān)[12-13]。其中Liu 等[13]研究發(fā)現(xiàn)甘草的粉性與甘草酸、甘草苷的含量，直鏈淀粉與總淀粉的比例及粒徑超過(guò)5 μm 的淀粉粒數(shù)量呈正相關(guān)，與總淀粉含量呈負(fù)相關(guān)。以“粉性”等傳統(tǒng)性狀鑒別評(píng)價(jià)甘草品質(zhì)受到了挑戰(zhàn)，亟需更為準(zhǔn)確的方法詮釋甘草粉性的量化標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)內(nèi)涵。

近年來(lái)，激光衍射已經(jīng)成為普遍認(rèn)可的粉體表征技術(shù)，在食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。激光衍射粒度分析儀具有測(cè)量速度快、測(cè)量過(guò)程自動(dòng)化程度高、衍射譜僅與顆粒大小有關(guān)等優(yōu)勢(shì)[14]，尤其重要的是激光衍射可以通過(guò)表征粒度分布鑒別不同樣品，并解釋樣品的獨(dú)特品質(zhì)。例如，不同種類咖啡產(chǎn)品研磨后咖啡粉粒度分布情況明顯不同，精細(xì)咖啡粉在沖泡時(shí)可以產(chǎn)生獨(dú)特的苦味，而隨著咖啡粉粒徑的增加，產(chǎn)品的口感則逐漸順滑[15]。中藥材活性成分在不同組織中含量存在差異，會(huì)導(dǎo)致其粉體粒徑大小、形狀、表面特征等顆粒學(xué)性質(zhì)不完全相同，如易碎組織在粉碎過(guò)程中易形成小顆粒，不易粉碎的組織則在大顆粒粉末中較多[16]。因此，可將激光衍射粒度分布檢測(cè)技術(shù)用于鑒別具有組織特性差異的藥材，也可將粒度分布與藥效成分含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以期來(lái)量化對(duì)藥材品質(zhì)的評(píng)價(jià)。

本研究以甘草為材料，建立檢測(cè)甘草粉末粒度的方法。利用粉末粒度分布表征甘草粉體特征，同時(shí)以甘草酸和甘草苷類化合物的含量表征不同產(chǎn)地甘草的品質(zhì)優(yōu)劣，通過(guò)分析甘草粉末粒度分布與甘草有效成分含量之間的相關(guān)性，為快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)甘草品質(zhì)特征提供理論指導(dǎo)，同時(shí)也為粒度分析儀在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

實(shí)驗(yàn)樣品收集于新疆、內(nèi)蒙古、甘肅3 個(gè)省（自治區(qū)）21 個(gè)產(chǎn)地（縣/市）藥材收購(gòu)商/合作社，共40份，包括10個(gè)甲等、18個(gè)乙等、12個(gè)丙等，均為秋季采收，3年生樣品，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心王升副研究員鑒定為豆科植物烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。具體信息見(jiàn)表1。

表1 甘草樣品信息

對(duì)照品皂苷類化合物22-β-乙酰氧基-甘草酸（1，批號(hào)：J24GS147479）、甘草皂苷G2（2，批號(hào)：Z29J11H119881）、甘草酸（3，批號(hào)：Y30J11Q119843）和黃酮苷類化合物甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷（4，批號(hào)：G09J11Y111183）、芹糖甘草苷（5，批號(hào)：Z29J11H117017）、維采寧（6，批號(hào)：J24GS158679）、甘草苷（7，批號(hào)：Z29J11H107681）、黃甘草苷（8，批號(hào)：Y30J11Q617243）、芒柄花苷（9，批號(hào)：G09J11Y517183）、芹糖異甘草苷（10，批號(hào)：J24GS532509）、異甘草苷（11，批號(hào)：Y30J11Q117543）均購(gòu)自云南西力生物技術(shù)股份有限公司，純度均大于95%；實(shí)驗(yàn)用乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器

Mastersizer 2000 型激光衍射粒度分析儀（馬爾文帕納科公司）；ACQUITY UPLC H-CLASS 系統(tǒng)，ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），VanGuard預(yù)柱（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）均購(gòu)于美國(guó)Waters 公司；FW177 型中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；ML104T/02型電子天平（梅特勒-托利多公司）；Pacific TⅡ型超純水系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；SB-800 DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

甘草樣品干燥，稱取樣品約250 g，于中藥粉碎機(jī)粉碎2次、每次1 min，過(guò)二號(hào)篩[（850±29）μm]。

2.2 甘草粉末粒度檢測(cè)

按照儀器默認(rèn)的土壤設(shè)定參數(shù)，藍(lán)光折射率設(shè)為1.336，殘差均小于0.5%，遮光度為1.5%～4.5%。將燒杯中加滿蒸餾水，超聲3 min，排除儀器氣泡，防止影響測(cè)量結(jié)果。將甘草粉末加入測(cè)量燒杯中稀釋至粒度儀測(cè)量所需的體積占比（7%～15%），待溶液穩(wěn)定且沒(méi)有粉末沉淀時(shí)，邊超聲邊進(jìn)樣測(cè)量。

2.3 有效成分含量測(cè)定

含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]方法，根據(jù)化合物類型（甘草酸類和甘草苷類）分別進(jìn)行檢測(cè)。該方法在包括回收率、重復(fù)性及穩(wěn)定性在內(nèi)的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的可靠性。

2.3.1 甘草酸類3 種皂苷類化合物（1～3）的檢測(cè)方法 稱取甘草粉末200 mg于50%甲醇10 mL，25 ℃超聲提取30 min。流動(dòng)相為乙腈-甲醇（4∶1，A）和0.1%甲酸水溶液（B），洗脫梯度（0～1.0 min，30%A；1.0～8.0 min，30%～40%A；8.0～16.0 min，40%～52%A；16.0～16.2 min，52%～100%A；16.2～17.6 min，100%A）；流速0.40mL·min-1，柱溫55 ℃，進(jìn)樣量1 μL，樣品盤(pán)溫度15 ℃，全波長(zhǎng)掃描190～600 nm，定量分析檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

對(duì)照品溶液的配制：化合物1、2 溶于50%甲醇，化合物3 溶于適量75%甲醇，配制質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的儲(chǔ)存液。用50%甲醇將化合物1和2稀釋至0.5 mg·mL-1，化合物3 稀釋至2.5 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80 和160 的稀釋因子進(jìn)行稀釋，以峰面積為Y，各個(gè)化合物進(jìn)樣質(zhì)量（g）為X，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 甘草苷類8種黃酮苷類化合物（4～11）的檢測(cè)方法 按2.3.1項(xiàng)下方法提取樣品。流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1.0 min，10%～15%A；1.0～6.0 min，15%～25%A；6.0～8.5 min，25%～30%A；8.5～10.0 min，30%～32%A）；流速為0.30 mL·min-1，化合物10 和11 檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm，化合物4～9檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

對(duì)照品溶液的配制：化合物4～11均溶于適量50%甲醇至質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1的儲(chǔ)存液，用50%甲醇分別稀釋化合物4～6和8到使用質(zhì)量濃度0.18 mg·mL-1，化合物7、9～11質(zhì)量濃度為0.42 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160的稀釋因子進(jìn)行稀釋，以峰面積為Y，各個(gè)化合物進(jìn)樣質(zhì)量（g）為X，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各化合物含量與甘草粉末粒度的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘草粉末粒度檢測(cè)結(jié)果

典型差異甘草樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，計(jì)算出粉末樣品中粒徑在0.01～2.00、2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00、250.00～500.00、500.00～1000.00、1000.00～2000.00 μm 的體積占比，即粉末樣品的粒度分布，以此來(lái)表征甘草粉末的粉體特征?？梢?jiàn)不同產(chǎn)地甘草樣品粒度分布存在明顯差異。

表2 甘草粉末粒度分布 %

40 份甘草粉末樣品的粒徑分布在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm 幾個(gè)區(qū)段內(nèi)的粒子體積占比較大（均值＞10%），且在40 個(gè)樣品當(dāng) 中 2.00～20.00、50.00～100.00、100.00～200.00、500.00～1000.00 μm 幾個(gè)區(qū)段內(nèi)的粒子分布體積的波動(dòng)較大（波動(dòng)＞10%），見(jiàn)表2。這些甘草粉末樣品在這些區(qū)段的分布可能與甘草的粉體特征和品質(zhì)有關(guān)聯(lián)。

3.2 有效成分含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 各化合物質(zhì)量濃度及色譜峰面積線性關(guān)系良好，見(jiàn)表3。

表3 甘草各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

3.2.2 有效成分含量 《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版規(guī)定，甘草中甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于2%、甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.5%，根據(jù)測(cè)量值，40批甘草中甘草酸不合格率為32.5%，甘草苷不合格率為35.0%。甘草酸不合格的樣品產(chǎn)地主要集中在新疆，包括新疆29 團(tuán)、30 團(tuán)、和碩、精河、輪南和伊犁等地的部分樣品，并與等級(jí)無(wú)明顯相關(guān)。甘草苷不合格的樣品產(chǎn)地也主要集中在新疆，尤其以新疆29 團(tuán)、30 團(tuán)、輪南、精河、伊犁等地不合格比較嚴(yán)重。

諸多產(chǎn)地中甘肅榆中的一等甘草質(zhì)量最佳，其甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)4.68%、甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)5.14%，在測(cè)定的成分中22-β-乙酰氧基-甘草酸、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷均為峰值，且甘草皂苷G2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.456 0%，僅次于內(nèi)蒙古烏拉特前旗GC07-01樣品（0.468 1%），見(jiàn)表4。

表4 甘草中甘草酸及甘草苷類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

續(xù)表4

3.3 甘草酸及甘草苷類化合物與甘草粉末粒度的相關(guān)性

由表5可知，甘草粒度分布與有效成分的含量具有顯著相關(guān)性。在甘草粒徑分布在50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00 μm，粒子分布數(shù)越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、維采寧和異甘草苷的含量越低，且在100.00～200.00 μm，粒子分布越多，22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越高；但是在500.00～1000.00 μm，粒子分布越多，甘草苷及異甘草苷的含量越高；在1000.00～2000.00 μm，粒子分布越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、維采寧和異甘草苷的含量均越高，僅22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越低。

提示甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、維采寧和異甘草苷含量與50.00～250.00 μm 的粒子分布呈負(fù)相關(guān)，而與1000.00～2000.00 μm 分布的粒子呈正相關(guān)；甘草苷及異甘草苷的含量與500.00～1000.00 μm 分布的粒子呈正相關(guān)。根據(jù)3.1 項(xiàng)下結(jié)果，40份甘草粉末樣品的粒徑分布 在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm幾個(gè)區(qū)段內(nèi)的粒子分布體積占比較大（均值＞10%），由此可推測(cè)，甘草粉末粒徑在50.00～200.00、500.00～1000.00 μm 分布，與甘草質(zhì)量直接相關(guān)。50.00～200.00 μm 分布越少，500.00～1000.00 μm分布越多，同時(shí)在更高的粒徑范圍內(nèi)分布越多，甘草質(zhì)量可能越好。

4 討論

本研究以甘草為研究對(duì)象引入粒度分析儀，分析了甘草粉末的粒度分布，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于將中藥材粉體特征鑒別指標(biāo)客觀化、量化。通過(guò)分析甘草粉末粒度分布與有效成分含量之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)甘草粉末粒度分布與有效成分的含量具有顯著相關(guān)性，將粒度分布同中藥材品質(zhì)相關(guān)聯(lián)，提供客觀的數(shù)據(jù)支持，為現(xiàn)代中藥鑒定數(shù)字化發(fā)展提供了新方法、新思路。

本研究統(tǒng)計(jì)甘草粉末樣品粒度分布體積占比大于10% 的區(qū)段，推測(cè)甘草粉末粒徑在50.00～200.00 μm 和500.00～1000.00 μm 的分布可用于表征甘草粉體特性，與甘草質(zhì)量直接相關(guān)。相關(guān)性分析表明，甘草粉末粒徑在50.00～250.00 μm分布越少，500.00～1000.00 μm 及更高的粒徑范圍內(nèi)分布越多，甘草質(zhì)量可能越好?！吨袊?guó)藥典》2020年版（一部）規(guī)定粗粉指能全部通過(guò)二號(hào)篩[（850±29）μm]，但混有能通過(guò)四號(hào)篩[（250±9.9）μm]不超過(guò)40%的粉末；中粉是指能全部通過(guò)四號(hào)篩[（250±9.9）μm]，但混有能通過(guò)五號(hào)篩[（180±7.6）μm]不超過(guò)60%的粉末[1]。因此本研究結(jié)果表明，甘草粉末（粗粉）中滿足中粉要求（能通過(guò)四號(hào)篩）的體積占比越大，甘草酸和甘草苷等活性成分含量越低。

自古以來(lái)甘草以粉性為佳，但“粉性”科學(xué)內(nèi)涵仍有待發(fā)掘，量化評(píng)價(jià)方法仍有待建立。本研究除了將粒度分布同甘草品質(zhì)相關(guān)聯(lián)外，采用的技術(shù)和方法還可為“粉性”的量化提供參考，對(duì)揭示中藥辨狀論質(zhì)方法學(xué)的本質(zhì)有一定意義。