汪祺，楊建波，文海若，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

蛋白質酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是一種在體內廣泛表達于細胞內的蛋白質酪氨酸磷酸酶，為胰島素的負調節(jié)劑，在調節(jié)胰島素敏感性和能量代謝的過程中起著重要作用，PTP1B 可通過去磷酸化激活胰島素受體或其底物上的酪氨酸殘基，其抑制劑可以改善或延長胰島素的作用，起到降血糖效果。大黃素-大黃素甲醚-二蒽酮（emodin physcion dianthrone，EPD）為有效的PTP1B 抑制劑，反式-EPD（trans-EPD）和順式-EPD（cis-EPD）對PTP1B的半數抑制濃度（IC50）值分別為（2.77±1.23）、（7.29±2.32）μmol·L-1，是治療2 型糖尿病的潛在有效成分[1]。本課題組前期已從傳統(tǒng)中藥何首烏中分離出trans-EPD 和cis-EPD，同時推測該類成分可能是何首烏發(fā)揮降糖作用的物質基礎[2]。此外，已有研究表明，EPD 類具有高度共軛二聚體結構的雙炔酮作為次生代謝產物廣泛存在于陸地和海洋植物、動物和真菌中[3]。因此針對這類成分進行研究，可為相關新藥開發(fā)和臨床應用提供參考。

研究發(fā)現(xiàn)，尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）為人體內源性物質膽紅素的唯一代謝酶，當其被抑制時可引發(fā)膽紅素代謝異常，造成肝內堆積引發(fā)肝損傷[4-8]。本課題組前期研究表明，何首烏中的大黃素-大黃素二蒽酮具有抑制UGT1A1的作用[9]。由于trans-EPD和cis-EPD與大黃素-大黃素二蒽酮結構特征極為相似，因此可能同為UGT1A1酶的底物并對其產生影響。

本研究以trans-EPD 和cis-EPD 為研究對象、UGT1A1 為研究切入點，結合分子對接、體外酶動力學實驗及UGT1A1 蛋白和基因變化等結果，探究trans-EPD 和cis-EPD 是否具有潛在肝毒性風險，并從化合物構效關系的角度對這類單體成分進行安全性評價。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY?Ultra Performance LC 型超高效液相色譜儀（Waters 公司）；VICTOR X5 型多功能酶標儀（PerkinElmer 公司）；FQD-96A 型熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀（杭州博日科技股份有限公司）；Nano-100 型分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）；17R型高速低溫離心機（Thermo公司）；Vortex-Genie 2 型渦旋振蕩器（Scientific Industries公 司）；懸滴GravityPlus ?板及GravityTRAP ?板（Insphero公司）；SDC-6節(jié)能型智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 肝微粒體、細胞及試藥

人源肝細胞HepaRG（美國菌種保藏中心）；大鼠肝微粒體（RLM，BD Gentest 公司）；trans-EPD及cis-EPD均由中國食品藥品檢定研究院楊建波博士分離，純度均大于98%；膽紅素（批號100077-201206，純度：99.3%，購自中國食品藥品檢定研究院）；磷酸鉀（純度≥98%）、氯化鎂（純度≥98%）、抗壞血酸（純度≥98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥98%）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH，純度≥98%）、氧化型輔酶Ⅱ（NADPNa2，純度≥98%）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH，純度≥98%）及D-葡萄糖-6-磷酸二鈉（G-6-P，純度≥98%）均購自北京百靈威科技有限公司；丙甲菌素（純度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，純度≥98%）、葡萄糖二酸單內酯（純度≥98%）、二甲基亞砜（DMSO，純度≥98%）均購自Sigma Aldrich公司；乙腈、甲醇均為色譜純（默克公司）；其他試劑均為分析純（北京化學試劑廠）；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）及胎牛血清（FBS）均購自Gibco 公司；瓊脂糖（Spain Biowest公司）；10 000×DuRed核酸染料（北京富百科生物技術有限公司）；總RNA提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、D2000 DNA Marker、Real SYBR Mixture及2×TaqPCR Mastermix均購于北京厚生博泰生物技術有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

2 方法

2.1 分子對接

本課題組前期研究中采用Discovery Studio 2.5軟件BLAST Search 模塊，通過同源模建的方法成功構建了UGT1A1 蛋白結構，并同時識別出UGT1A1上的9 個活性口袋區(qū)（site A～I）[10]。本研究在此基礎上應用該軟件From Receptor Cavities 模塊將trans-EPD 和cis-EPD 單體與UGT1A1 蛋白進行分子對接。由于UGT1A1 為膽紅素唯一代謝酶，因此以膽紅素為陽性對照，以膽紅素對接打分值的80%作為最低標準，將打分高于閾值且相互作用模式與原配體相似的化合物定義為UGT1A1底物[11]。

2.2 UGT1A1體外抑制實驗

應用本課題組前期已建立的RLM 孵育體系[4-6]，研究trans-EPD 和cis-EPD 對UGT1A1 的作用及作用強度，同時啟動Ⅰ、Ⅱ相代謝反應，以表觀抑制常數（Ki）為最終評價指標。取蛋白質量濃度為0.5 mg·L-1的RLM 30 μL，加入系列濃度的膽紅素對照品溶液（0.36～3.35 μmol·L-1）及EPD 單體溶液（trans-EPD 0.05～2.00 μmol·L-1，cis-EPD 0.05～1.50 μmol·L-1），置于37 ℃恒溫水浴預孵育3 min，同時加入NADPH和UDPGA再生系統(tǒng)（UDPGA終濃度為5 mmol·L-1）。反應啟動15 min 后加入含維生素C 200 μmol·L-1的冰乙腈-甲醇（2∶1）600 μL，沉淀蛋白，渦旋1 min 后13 000 r·min-1（離心半徑為5 cm）離心25 min，取上清液1 μL 進行測定，測定方法見文獻[12-13]。每個樣本重復3次。

以膽紅素及其代謝產物生成總量對應其底物濃度作圖，縱坐標為加入EPD 后膽紅素代謝速率的倒數（1/v），橫坐標為膽紅素濃度的倒數（1/S），采用米氏方程雙倒數法作圖；加入不同濃度EPD 對應不同曲線，以不同曲線斜率對膽紅素濃度繪制slop圖，求得Ki[9]。

2.3 HepaRG細胞毒性考察

取對數生長期的HepaRG 細胞，消化后調整密度為5×104個/mL接種于96孔板，每孔接種細胞約為5000 個，孵育24 h 后加入trans-EPD 和cis-EPD。設置空白對照組（不含HepaRG 細胞）、對照組（0.5% DMSO）、trans-EPD（0.1、0.3、1.0、3.0、6.0 nmol·L-1）組和cis-EPD（0.1、0.3、1.0、3.0、6.0 nmol·L-1）組。細胞孵育24 h（5%CO2，37 ℃），每孔加CCK-8 細胞活力檢測試液10 μL，37 ℃避光孵育2 h，采用酶標儀于450 nm 處檢測各孔吸光度（A），按公式（1）計算細胞存活率[14]，并計算trans-EPD和cis-EPD對細胞的IC50。

2.4 qRT-PCR實驗

細胞培養(yǎng)及給藥同2.3 項下操作，設對照組、cis-EPD 組和trans-EPD 組，給藥組濃度均為0.1、1.0、10.0 nmol·L-1。細胞經EPD 單體處理24 h 后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，離心收集細胞。

以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，正向引物：5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，反向引物：5′-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3′；UGT1A1 基因正向引物：5′-CTCCCCTGGATTCTCAGACC-3′，反向引物：5′-CCGTGCCACCCACAAAAC-3′；提取RNA后，經Nano-100型分光光度計測定濃度和純度。采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄cDNA，進行qRT-PCR檢測[15]。反應程序為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。

2.5 統(tǒng)計學分析

實驗數據均采用SPSS 13.0 軟件處理分析，多組間比較采用單因素方差分析，數據以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 UGT1A1蛋白分子對接

采用Discovery Studio 2.5 軟件中的LibDock 功能，在確定trans-EPD 和cis-EPD 的對接口袋區(qū)后，對其與UGT1A1 蛋白的對接結果進行LibDock score值測定，由結果可知，trans-EPD 和cis-EPD 對接口袋為site F，與膽紅素對接活性區(qū)相同。膽紅素LibDock score 值為108.623（80% 打分閾值為86.898），trans-EPD為101.469，cis-EPD為103.15，均遠高于閾值，因此提示trans-EPD 和cis-EPD 與UGT1A1 的親和能力與膽紅素底物相當。此外，由于trans-EPD 和cis-EPD 與膽紅素結合位點為同一位點site F，存在競爭結合的可能，因此提示trans-EPD 和cis-EPD 對于UGT1A1 結合底物膽紅素均可產生影響，使膽紅素代謝受阻，存在引發(fā)肝損傷的風險。

trans-EPD 和cis-EPD 分子體積大，剛性強，存在較大的共軛體系（圖1）。分析對接模式發(fā)現(xiàn)，trans-EPD 和cis-EPD 均與UGT1A1 中的氨基酸殘基GLY332 形成了碳氫鍵，與ILE343、VAL345 形成了多個Pi-Alkyl 鍵，同時和PHE283 形成了更為穩(wěn)定的Pi-Pi T shape鍵，增大了化合物與UGT1A1的疏水結合作用。從相互作用方式看，trans-EPD 和cis-EPD與UGT1A1蛋白對接模式基本一致（圖2）。

圖1 trans-EPD和cis-EPD結構

圖2 trans-EPD和cis-EPD與UGT1A1蛋白對接模式

3.2 UGT1A1體外抑制實驗

trans-EPD 和cis-EPD 在RLM 中對UGT1A1 酶的抑制情況見圖3。由實驗結果可知，trans-EPD 和cis-EPD 對UGT1A1 均表現(xiàn)出競爭型抑制作用，Ki值分別為5.22、11.45 μmol·L-1，抑制作用較強（Ki＜1 μmol·L-1，強抑制；Ki＞50 μmol·L-1，弱抑制[16]），與分子對接結果一致。

圖3 trans-EPD和cis-EPD對UGT1A1的影響

3.3 HepaRG細胞毒性結果

由HepaRG 細胞毒性結果（圖4）可知，trans-EPD（IC50為3.248 nmol·L-1）和cis-EPD（IC50為3.984 nmol·L-1）IC50值較小，提示具有肝細胞毒性風險。體外毒性實驗數據與對接篩選結果相一致。

圖4 trans-EPD和cis-EPD對HepaRG細胞活性的影響（±s, n=3）

3.4 UGT1A1 mRNA表達變化

由結果可知（圖5），與對照組比較，trans-EPD和cis-EPD 低、中、高濃度下均可下調UGT1A1 mRNA 表達水平（P＜0.05），且作用存在劑量效應相關性。結合體外UGT1A 抑制實驗和細胞毒性數據，初步推測trans-EPD 和cis-EPD 可通過作用于UGT1A1 對肝細胞中膽紅素代謝循環(huán)產生影響，存在引發(fā)肝損傷的可能。

圖5 trans-EPD和cis-EPD對HepaRG細胞中UGT1A1 mRNA表達的影響（±s, n=3）

4 討論

在本課題組前期研究的基礎上，本研究以膽紅素的唯一代謝酶UGT1A1 為切入點，針對二蒽酮類成分trans-EPD 和cis-EPD 開展了安全性研究。通過分子對接實驗，證明trans-EPD 和cis-EPD 均與UGT1A1 結合于site F，該位點同時也為膽紅素的結合位點，提示其存在與膽紅素爭奪代謝酶的可能。trans-EPD 和cis-EPD 與UGT1A1結合的LibDock score 值與膽紅素接近，提示兩者與UGT1A1 的親和能力與膽紅素相當。分析對接模式發(fā)現(xiàn)，trans-EPD和cis-EPD共軛體系較大，分子結構增大的同時剛性增強，2 個化合物均與氨基酸殘基形成了較強的疏水結合作用；此外共軛體系還與酶蛋白形成了更為穩(wěn)定的Pi-Pi T shape 鍵，增強了化合物與UGT1A1的疏水結合作用。

體外UGT1A1 抑制實驗結果顯示，trans-EPD 和cis-EPD 均對UGT1A1表現(xiàn)為競爭型抑制，且抑制作用較強。體外細胞毒性實驗結果表明，trans-EPD 和cis-EPD 均具有肝細胞毒性作用，低、中、高濃度下可對UGT1A1 mRNA 表達產生顯著抑制作用，并且存在明顯的劑量依賴關系。

綜上所述，初步推測二蒽酮成分trans-EPD 和cis-EPD 可通過作用于UGT1A1影響膽紅素代謝，進而可能產生肝毒性作用，同時提示具有這類母核結構的化合物可能同樣存在毒性風險。本研究結果將為探討二蒽酮類成分的臨床肝毒性提供參考。