陳佳琪，段志強(qiáng)，阮 涌，龍丹丹，嵇辛勤*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州貴陽 550025)

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感染部分野生和家禽類引起的一種急性高度接觸性傳染病。根據(jù)AIV的致病性不同，可分為高致病性AIV、低致病性AIV和無致病性AIV[1]。近年來我國H6亞型AIV的流行呈上升趨勢[4]，在監(jiān)測的家禽中鴨分離率最高，鴨在AIV跨種屬屏障傳播中起重要作用，且各亞型之間不斷地發(fā)生遺傳重組[5-6]。也有研究表明H6亞型AIV可以跨越動(dòng)物種屬屏障，直接感染哺乳動(dòng)物小鼠和水貂等，甚至在健康人群血清中檢測到抗H6亞型AIV的特異性抗體[7-9]。AIV強(qiáng)毒株如H5或H7亞型感染宿主可在肺臟或脾臟高效復(fù)制，并且刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的先天性免疫應(yīng)答，造成對(duì)宿主的高致病性。當(dāng)前對(duì)AIV弱毒株感染宿主后引起的免疫應(yīng)答研究較少，尤其在H6N6亞型感染宿主造成的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化研究方面尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測鴨感染H6N6亞型AIV后不同時(shí)間點(diǎn)免疫器官(脾臟、胸腺、法氏囊)中IL-2、IL-10、IFN-α細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化，為低致病性禽流感病毒感染鴨后引起的免疫應(yīng)答相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要毒株和病料 鴨源H6N6亞型禽流感病毒分離株A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6)由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所分離和保存。1日齡非免疫雛鴨購自貴陽綠源禽業(yè)有限公司，飼養(yǎng)至3周齡用于動(dòng)物試驗(yàn)。攻毒后于第1、3、5天分別處死對(duì)照組和試驗(yàn)組鴨并采集免疫器官，置于-80℃中保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 Trizol Reagent，Invitrogen上海有限公司產(chǎn)品；SYBR Premix ExTaqⅡ、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs和pMD18-T載體，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀(CFX96)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；超微量紫外分光光度計(jì)(SMA2000)，Thermo公司產(chǎn)品；電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將36只3周齡非免疫健康麻鴨隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組：試驗(yàn)組用107.0EID50/0.1 mL劑量通過滴鼻點(diǎn)眼方式接種，對(duì)照組用0.1 mL PBS接種，于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)。

1.2.2 病料的采集 攻毒后于第1、3、5天分別處死對(duì)照組和試驗(yàn)組鴨后采集免疫器官(脾臟、法氏囊、胸腺)，置于-80℃中保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 本研究用于檢測IL-2、IL-10、IFN-α三種細(xì)胞因子的引物序列參考文獻(xiàn)[10]，選擇管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，引物均由Invitrogen公司合成(表1)。

表1 細(xì)胞因子引物Table 1 Primers for cytokine gene amplification

1.2.4 鴨IL-2、IL-10、IFN-α 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立 采集鴨的胸腺、法氏囊、脾臟，參照Trizol提取試劑盒說明書的操作步驟提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后對(duì)目的基因進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，以此建立IL-2、IL-10、IFN-α實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。

1.2.5 H6N6亞型AIV感染鴨后免疫器官中IL-2、IL-10、IFN-α轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài) 將采集的樣品參照Trizol提取試劑盒說明書，進(jìn)行組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA按建立的方法對(duì)IL-2、IL-10、IFN-α進(jìn)行熒光定量PCR檢測，用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量鑒定

提取鴨的免疫器官總RNA，經(jīng)12 g/L普通瓊脂凝膠電泳，顯示清晰的5.8 S、18 S、28 S條帶，并且超微量紫外分光光度計(jì)測定的RNA純度(OD260/OD280)在2.0左右，提示總RNA的質(zhì)量和純度較好(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.胸腺RNA; 2.法氏囊RNA; 3.脾臟RNA

2.2 IL-2、IL-10、IFN-α基因real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用Blast軟件對(duì)設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)引物與其他亞型AIV無同源性。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線表明，各個(gè)目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線呈單一波峰，說明無引物二聚體或其他非特異性雜帶。分別挑選IL-2、IL-10、IFN-α、GAPDH陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為108copies/μL～103copies/μL)中的6個(gè)稀釋度作為PCR反應(yīng)模板，根據(jù)各稀釋度得到相應(yīng)的Ct值，儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗(yàn)建立的熒光定量檢測方法線性關(guān)系良好，范圍為0.996～1.000，可用于目的基因表達(dá)量的檢測(圖2～圖6)。

圖2 IL-2基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.3 H6N6亞型AIV感染后鴨免疫器官中IL-2、IL-10、IFN-α的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

將采集的樣品處理后，提取組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以管家基因GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR方法檢測，用2-ΔΔCt法計(jì)算得出胸腺、脾臟、法氏囊中的IL-2、IL-10、IFN-α細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。鴨接毒后胸腺中IL-2、IL-10呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最后趨近于對(duì)照組，在第3天達(dá)到高峰，后降低。而IFN-α呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在第3天時(shí)處于較高的轉(zhuǎn)錄水平，之后逐漸降低，第5天時(shí)低于對(duì)照組(圖6)。

圖3 IL-10基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖4 IFN-α基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖5 GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖6 H6N6亞型AIV感染鴨不同時(shí)間點(diǎn)胸腺中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

2.4 H6N6亞型AIV感染后鴨法氏囊中IL-2、IL-10、IFN-α轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

法氏囊IL-2轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在第1天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平較低，在第3天時(shí)立即升高，后保持轉(zhuǎn)錄水平不變的趨勢。IL-10的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)降低后升高的趨勢，至第3天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)升高趨勢，其中在第5天時(shí)達(dá)到最高值。法氏囊中的IFN-α轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)降低的趨勢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組(圖7)。

圖7 H6N6亞型AIV感染鴨不同時(shí)間點(diǎn)法氏囊中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

2.5 H6N6亞型AIV感染后鴨脾臟中IL-2、IL-10、IFN-α轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

脾臟中IL-2的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)錄水平在第1天處于最佳，第3天后逐漸降低，后低于對(duì)照組。IL-10的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于對(duì)照組呈現(xiàn)下降趨勢，但是對(duì)于第1天時(shí)，第3天呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。而IFN-α呈現(xiàn)升高后降低后低于對(duì)照組，在第1天時(shí)胸腺中的IFN-α有較高的轉(zhuǎn)錄水平，第5天逐漸降低，后立即降低(圖8)。

圖8 H6N6亞型AIV感染鴨不同時(shí)間點(diǎn)脾臟中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

3 討論

A型流感病毒感染宿主后主要引起呼吸道感染，病毒除了能直接引起的局部呼吸癥狀外，許多典型的并發(fā)癥都是由免疫調(diào)節(jié)者細(xì)胞因子所引起。經(jīng)流感病毒感染的上皮細(xì)胞和炎性粒細(xì)胞能產(chǎn)生許多促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、以及其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，這些因子可促進(jìn)血液中單核細(xì)胞的外滲、抗病毒及1型輔助性T細(xì)胞(Th1)的免疫應(yīng)答，也就是說禽流感感染會(huì)引起細(xì)胞因子水平顯著升高[11]。有研究表明，在人的自然殺傷細(xì)胞(NK)和T細(xì)胞中，IFN-α可以與其他因子的表達(dá)量增強(qiáng)，說明IFN-α在抗流感病毒和其他病毒的天然免疫中有著重要的作用。王玉亮研究證實(shí)，IL-10是一種多效的抑制性細(xì)胞因子，不僅能抑制T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的活化及各類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，也能促進(jìn)B細(xì)胞和天然殺傷性細(xì)胞的分化和增殖[12]。IL-2可以激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等能產(chǎn)生TNF-α和NO，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答等，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[13]。另外，IL-2對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)具有促進(jìn)作用[14]。因此，細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IFN-α在抵抗流感病毒感染與復(fù)制過程中發(fā)揮了重要的作用。

高致病性AIV對(duì)動(dòng)物脾臟、胸腺、法氏囊等免疫器官造成的損傷，能引起機(jī)體免疫功能抑制，降低機(jī)體的抗病毒能力等[15-16]。而在低致病性AIV對(duì)宿主免疫器官損傷研究方面，除H13亞型以外，H1～H12亞型AIV均能增強(qiáng)雞的淋巴細(xì)胞活性，促使外周血淋巴細(xì)胞合成和釋放IL-2增多[17]。H9亞型AIV感染引起雛雞誘導(dǎo)IFN-α活性降低可能與其導(dǎo)致Th細(xì)胞數(shù)量減少和增殖功能減弱，致使IFN分泌水平降低密切相關(guān)[18-19]；也可能與IL-2分泌減少，IFN分泌缺乏刺激因素，而導(dǎo)致活性下降。本研究建立了IL-2、IL-10、IFN-α細(xì)胞因子的熒光定量PCR相對(duì)定量檢測方法，相關(guān)性好，熔解曲線整齊單一，重復(fù)性變異系數(shù)都小于9%，符合基因表達(dá)分析方法2-ΔΔCt法的應(yīng)用要求。用建立的方法對(duì)H6N6亞型AIV感染鴨免疫器官(胸腺、法氏囊、脾臟)后3種細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)H6N6亞型AIV感染鴨后免疫器官中的IL-2、IL-10、IFN-α轉(zhuǎn)錄水平普遍呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，并且在感染第5天普遍降到最低，結(jié)果表明鴨在感染H6N6亞型AIV后會(huì)影響細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，而該影響相對(duì)高致病性AIV要小。但是對(duì)于宿主細(xì)胞IL-2、IL-10、IFN-α等細(xì)胞因子如何抵抗H6N6亞型AIV感染仍需進(jìn)一步試驗(yàn)探討。