翁菲菲，馮文化，郭青榜，李如男，李強(qiáng)

糖尿病是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要原因，并增加了心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[1]。持續(xù)高糖狀態(tài)可引起氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等，導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙以及糖尿病性心肌病的發(fā)生[2]。最近在糖尿病動(dòng)物模型中的研究表明心肌細(xì)胞功能下降是心力衰竭的重要中介機(jī)制[3]。因此，保護(hù)心肌細(xì)胞在糖尿病心肌病的治療中具有重要的作用。紅景天苷（SAL）是被譽(yù)為“高原人參”的傳統(tǒng)藏藥紅景天的主要有效成分之一，其具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[4]。近年來，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝腎、腫瘤的作用也備受關(guān)注[5]。張彥燕等[6]研究發(fā)現(xiàn)SAL能夠抑制高糖誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶b（AKT）信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，與擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外PI3K/AKT通路的激活可能導(dǎo)致核因子促紅細(xì)胞生成素2相關(guān)因子2（Nrf2）表達(dá)上調(diào)，是一個(gè)重要的抗氧化途徑[7]。然而，SAL的保護(hù)作用是否通過PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)尚不清楚。因此，本研究旨在探討PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路在SAL預(yù)防高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用，以期為SAL防治糖尿病心肌病的藥理學(xué)活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大鼠心肌細(xì)胞株 H9c2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料紅景天苷（S A L i d r o s i d e，SAL）購自南京郎朗科技銷售公司，批號(hào)：10339-51-9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%；特異性PI3K抑制劑LY294002（批號(hào)：NSC293100）購自美國 MedChemExpress公司；Dulbecco改良Eagle高糖培養(yǎng)基（DMEM）、葡萄糖購自美國 Sigma公司；CCK-8 試劑盒、2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）購自美國Sigma-Aldrich公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和半胱天冬酶-3（caspase-3）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司；免疫印跡一抗磷酸化 （p）-AKT（Ser473）、AKT、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、p-GSK-3β（Ser256）、Nrf2購自美國ABGENT公司；免疫印跡二抗IgG 購自Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將H9c2心肌細(xì)胞置于在DMEM培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清）中，在95%空氣和5%CO2、飽和濕度、37℃的環(huán)境中培養(yǎng)。每隔2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞接近80%時(shí)傳代至新的培養(yǎng)基。將H9c2細(xì)胞分為空白組、高糖組、高糖+SAL組、高糖+SAL+LY294002組?？瞻捉M細(xì)胞用含有5.5 mmoL/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；其余3組細(xì)胞用含有33.3 mmoL/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；另外高糖+SAL組在更換為高糖培養(yǎng)液前2 h加入29.6 mmol/L SAL進(jìn)行預(yù)處理。而高糖+SAL+LY294002組則在加入SAL前加入10 μmol/L LY294002預(yù)處理2 h。

1.3.2 細(xì)胞增殖活性檢測取常規(guī)DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞接種在96孔板中（3000個(gè)/孔），分別加入不同濃度的SAL（終濃度：0、1.09、3.29、9.87、29.6、88.8、266.4 mmol/L）[8]，培養(yǎng)2 h后，更換為含有正常葡萄糖（5.5 mmoL/L）或高糖（33.3 mmoL/L）的培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，混勻，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，于490 nm波長下測吸光度值（OD）。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）＝（OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組）×100%

1.3.3 細(xì)胞凋亡情況檢測使用TUNEL凋亡檢測試劑盒對H9c2細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行熒光檢測。各組H9c2細(xì)胞進(jìn)行爬片，用4%多聚甲醛固定后，加入TDT溶液37℃避光孵育60 min，而后用PBS緩沖液沖洗2次，各10 min。與DAPI（藍(lán)色）融合的TUNEL陽性細(xì)胞（綠色）為凋亡細(xì)胞。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測收集各組經(jīng)處理后的細(xì)胞（1500 r/min離心10 min），用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞制備成10%的細(xì)胞勻漿，放置在-20℃，反復(fù)凍融3次，用顯微鏡觀察細(xì)胞是否完全破碎，如不完全則繼續(xù)凍融2次，再以4000 r/min離心15 min。BCA法定量蛋白濃度，用試劑盒檢測MDA、SOD、GSH-Px3含量。

1.3.5 ROS含量檢測各組心肌細(xì)胞離心后用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解并收集上清液，加入10 μmol/L的DCFH-DA溶液于37℃避光孵育1 h，用流式細(xì)胞儀檢測在500 nm和525 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下DCF的熒光值，每個(gè)樣本至少分析3×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果表示為空白組的平均熒光強(qiáng)度（MFI）的倍增變化。

1.3.6 蛋白免疫印跡法（western blot）用預(yù)冷的R I P A 裂解液提取各組心肌細(xì)胞總蛋白后，將蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與針對p-AKT（Ser473）（1:250）、AKT（1:250）、p-GSK-3β（Ser256）（1:1000）、GSK-3β（1:1000）、Nrf2（1:2000）和β-actin（1:2000）的一抗在4℃下孵育一夜，用免疫印跡二抗IgG孵育。采用增化學(xué)發(fā)光法（ECL）對蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描分析，以β-actin為內(nèi)參檢測各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAL對高糖作用下心肌細(xì)胞H9c2增殖活性的影響在正常糖環(huán)境下，SAL對H9c2細(xì)胞存活率幾乎無影響（P＞0.05）。在高糖環(huán)境下，與空白組相比，高糖組H9c2細(xì)胞的存活率顯著降低（P＜0.05）；加入不同濃度SAL預(yù)處理后，H9c2細(xì)胞的存活率較高糖組升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性；但當(dāng)SAL濃度≥29.6 mmol/L時(shí)，H9c2細(xì)胞的存活率變化不明顯，故選擇29.6 mmol/L濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，圖1。

圖1 SAL對正常糖或高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞H9c2存活率的硬性

2.2 高糖作用對H9c2心肌細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響經(jīng)western blot法檢測，與空白組相比，高糖組細(xì)胞p-AKT/AKT蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），圖2。

圖2 高糖作用對H9c2心肌細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白磷酸化的影響

2.3 SAL對高糖作用下H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響與空白組（3.32±0.41%）相比，高糖組（23.07±3.12%）細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+SAL組（11.82±2.30%）細(xì)胞凋亡率則顯著降低（P＜0.05）；與高糖+SAL組相比，高糖+SAL+LY294002組（17.44±3.09%）細(xì)胞凋亡率則顯著增加（P＜0.05），圖3。

圖3 SAL能夠抑制高糖作用下H9c2心肌細(xì)胞的凋亡

2.4 SAL對高糖作用下心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響與空白組相比，高糖組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA的含量顯著升高，同時(shí)SOD和GSH-Px的含量顯著降低（P＜0.05）；與高糖組相比，高糖+SAL組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA的含量顯著降低，同時(shí)SOD和GSH-Px的含量顯著升高（P＜0.05）；然而與高糖+SAL組相比，高糖+SAL+LY294002組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA、SOD和GSH-Px含量則被逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），表1。

表1 SAL對H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA、SOD、GSH-Px含量的影響（n=8）

2.5 SAL對高糖作用下H9c2心肌細(xì)胞中ROS生成的影響與空白組（MFI：4386.23±452.64）相比，高糖組細(xì)胞中ROS含量顯著增加（MFI：35876.59±768.45）；與高糖組相比，高糖+SAL組細(xì)胞中ROS的含量則顯著降低（MFI：12069.23±852.64），（P＜0.05）；與高糖+SAL組相比，高糖+SAL+LY294002組細(xì)胞中ROS的含量則有所升高（MFI：21084.23±1352.64），（P＜0.05），圖4。

圖4 SAL能夠抑制高糖作用下H9c2心肌細(xì)胞中ROS的生成

2.6 高糖作用對H9c2心肌細(xì)胞PI3K/AKT/Nrf2通路的影響經(jīng)western blot法檢測，與高糖組相比，高糖+SAL組細(xì)胞p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與高糖+SAL組相比，高糖+SAL+LY294002組細(xì)胞中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達(dá)則被逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），圖5。

圖5 SAL能夠激活高糖作用下H9c2心肌細(xì)胞中PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路

3 討論

糖尿病性心肌病最初被描述為在沒有冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓和心臟瓣膜疾病的情況下發(fā)生心力衰竭的人類病理生理狀況。高血糖是糖尿病最重要的特征，被認(rèn)為是微血管（如視網(wǎng)膜病變）或大血管并發(fā)癥（如糖尿病性心肌?。┌l(fā)生的危險(xiǎn)因素[9]。高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病性心肌病發(fā)展的病變基礎(chǔ)。因此，本研究通過高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞建立糖尿病心肌病體外細(xì)胞模型。目前關(guān)于糖尿病性心肌病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏有效的預(yù)防手段[10]。從植物中分離有效的活性成分已經(jīng)成為慢性疾病防治領(lǐng)域的重要途徑之一。SAL是一種從紅景天中提取的苯丙素苷，有助于身體適應(yīng)各種壓力，調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)等，而不會(huì)產(chǎn)生不利的副作用。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SAL對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡具有一定保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為抑制ROS產(chǎn)生，降低細(xì)胞凋亡率并顯著提高細(xì)胞活力。初步探討其作用機(jī)制時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路在高糖作用下處于抑制狀態(tài)，而SAL可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制Nrf2蛋白降解，進(jìn)而上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px等抗氧化因子的合成和分析，從而對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

SAL是中藥紅景天的主要活性組分，有良好的抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。心肌細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞數(shù)量過度減少是糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制之一。例如，SAL能夠抑制過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元的損傷[11]。同時(shí)，也能夠保護(hù)心肌細(xì)胞免受谷氨酸毒性，以及鈣超載和LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡[12]。因此上述數(shù)據(jù)均說明SAL可能是一種潛在的治療或預(yù)防心血管疾病發(fā)生、進(jìn)展的藥物。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞增殖和存活中起重要作用。急性激活A(yù)KT可以抑制有害刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死和凋亡。在本研究中，我們首先證實(shí)高糖作用下，H9c2細(xì)胞AKT蛋白磷酸化水平降低，說明PI3K/AKT信號(hào)通路被抑制可能是導(dǎo)致H9c2細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。

持續(xù)性高糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致ROS過度產(chǎn)生，進(jìn)而影響心肌收縮和舒張功能。NADPH氧化酶被認(rèn)為是高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要來源。在生理?xiàng)l件下，NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS可被抗氧化防御系統(tǒng)有效地抑制，但是若過度激活則可進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激性損傷、線粒體功能障礙和抗氧化基因表達(dá)受損。而Nrf2/抗氧化應(yīng)答元件信號(hào)通路在體外預(yù)防心肌細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮著重要作用[13]。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈（BZIP）轉(zhuǎn)錄因子Cap‘n’Collar（CNC）家族。在非應(yīng)激條件下，Nrf2通過泛素-蛋白酶體途徑以keap1依賴的方式持續(xù)降解。在氧化性或親電性應(yīng)激信號(hào)的存在下，Nrf2蛋白降解下降，使其在胞核中大量積累，從而上調(diào)許多細(xì)胞保護(hù)酶II相解毒酶和抗氧化基因的表達(dá)，這些因子共同抑制心肌細(xì)胞中的氧化性壓力，有助于維持心臟收縮和舒張功能[14]。而PI3K/AKT通路是調(diào)節(jié)Nrf2核積累的重要途徑之一，如Tsai等[15]證實(shí)抗氧化劑通過上調(diào)PI3K/AKT/Nrf2通路，保護(hù)高血糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生及其介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們也證實(shí)高糖處理可以降低p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)，這些結(jié)果也提供了高糖抑制PI3K/AKT通路激活的證據(jù)。此外與高糖組相比，高糖+SAL組細(xì)胞生存活性增加，且呈劑量依賴性；凋亡率和細(xì)胞中ROS合成量降低，同時(shí)p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達(dá)升高，說明SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與激活PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí)，為了明確PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路在SAL心肌保護(hù)過程中發(fā)揮的作用，我們設(shè)置了挽救實(shí)驗(yàn)，在高糖+SAL的基礎(chǔ)上，增加特異性PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理，結(jié)果表明，與高糖+SAL組相比，高糖+SAL+LY294002組細(xì)胞生存活力、凋亡率、ROS生成量均被部分逆轉(zhuǎn)，說明激活PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路是SAL抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的作用途徑之一，可能還有其他的分子通路參與了SAL心肌保護(hù)作用，這是本研究的局限性之一。此外我們僅在體外細(xì)胞模型上進(jìn)行了研究，結(jié)果可能與臨床患者的實(shí)際情況有所不同。

總之，本研究證實(shí)SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用，可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，抑制細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞存活能力，其作用機(jī)制之一可能與激活激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制Nrf2蛋白降解，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px等抗氧化因子合成有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為預(yù)防糖尿病性心肌病的發(fā)生提供了一種潛在的天然藥物化合物-SAL，但還需更多工作以證實(shí)該結(jié)論的可靠性。