王佳 翟志敏 葛健 王興兵 董毅

作者單位：230601 合肥 1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科；230032 合肥 2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科；230001 合肥 3中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科

靶向B細(xì)胞成熟抗原（B cell mature antigens，BCMA）的嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）療法在復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤（relapsed/refractory multiple myeloma，RRMM）治療中取得了較好的應(yīng)答率，總體緩解率（overall remission rate，ORR）為73%～98%，完全緩解（complete remission，CR）率為31%～69%［1-3］。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，部分多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者盡管體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在，但最終依然會復(fù)發(fā)［4］。目前，影響這部分患者緩解持久性的因素尚未明確。既往研究顯示，多種因素均可影響CAR-T的治療反應(yīng)及其耐藥，包括細(xì)胞制備前T細(xì)胞的特征、CAR-T細(xì)胞相關(guān)特征、CAR-T細(xì)胞的丟失、腫瘤細(xì)胞表面抗原表達的丟失導(dǎo)致獲得性抵抗治療以及削弱T細(xì)胞活性的免疫抑制微環(huán)境有關(guān)克隆的出現(xiàn)等［4-5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)髓外病變（extramedullary diseases，EMD）和調(diào)節(jié)T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者CAR-T治療的預(yù)后不良因素［6］。基于此，本研究進一步探索EMD及Tregs對BCMACAR-T細(xì)胞治療RRMM療效及預(yù)后的影響，以期為BCMA-CAR-T療法的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2019年6月至2021年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科收治的RRMM患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴至少接受3線治療或?qū)γ庖哒{(diào)節(jié)劑和蛋白酶體抑制劑耐藥；⑵年齡≥18歲；⑶符合國際骨髓瘤工作組（international myeloma working group，IMWG）2016診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴肝腎功能異常，伴心臟疾?。òǔ曅膭訄DEF＜50%），心功能不全（心功能分級NYHA：Ⅲ/Ⅳ）者；⑵患有其他臟器惡性腫瘤者；⑶乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及結(jié)核病患者活動期，人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性患者；⑷合并未控制的嚴(yán)重感染或代謝性疾病者；⑸不能理解或不遵從研究方案者。本研究通過倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：PJ-YX2019-015）并在中國臨床試驗注冊中心注冊（注冊號：ChiCTR2000040368），患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方案

所有患者經(jīng)預(yù)處理化療后均采用BCMA-CAR-T細(xì)胞制劑治療。預(yù)處理化療方案：氟達拉濱（30 mg/m2，靜脈注射，每天1次，連續(xù)3 d）聯(lián)合環(huán)磷酰胺（300 mg/m2，靜脈注射，每天1次，連續(xù)3 d）；預(yù)處理化療結(jié)束后的第2天靜脈輸注BCMA-CAR-T細(xì)胞制劑，輸注平均劑量為3.5×106個CAR陽性T細(xì)胞/kg。輸注28 d后進行骨髓形態(tài)學(xué)、免疫固定電泳等檢查，評估緩解狀態(tài)；第30～180天，每月監(jiān)測血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、乳酸脫氫酶、β2-微球蛋白、免疫球蛋白定量、血清免疫固定電泳、尿免疫固定電泳、血清游離輕鏈、骨髓形態(tài)學(xué)及骨髓病理，之后每3個月檢測1次。隨訪期間，若發(fā)現(xiàn)可疑的復(fù)發(fā)癥狀，立即檢查并給予相應(yīng)挽救治療。

1.3 信息收集及定義

通過住院及門診病歷收集患者的臨床和實驗室相關(guān)資料，包括年齡、性別、化療線數(shù)、復(fù)發(fā)次數(shù)、預(yù)后危險分層、ECOG評分、骨髓原幼漿細(xì)胞比例、Tregs、EMD等基線特征。EMD定義為骨髓外異常漿細(xì)胞浸潤，通過磁共振成像或正電子發(fā)射計算機斷層掃描確定病變部位，并通過細(xì)胞學(xué)或病理活檢檢測腫塊中的漿細(xì)胞。Tregs檢測方法：所有患者進行CAR-T細(xì)胞治療前均抽取2～5 mL外周血，肝素化管抗凝，4 h內(nèi)檢查；取100 μL外周血，與特異性單抗（FITC-CD25-單抗、PE-CD127-單抗、PC5.5-CD4單抗）于25℃下孵育15 min，紅細(xì)胞被裂解后，用流式細(xì)胞儀FC-500快速評估，并使用CXP 2.0軟件分析。同期收集10名健康人的Tregs，其正常值范圍為4.29%～6.17%。當(dāng)Tregs水平大于正常值上限時定義為Tregs水平異常增高組，否則定義為Tregs水平正?；蜉^低組。

1.4 療效和安全性評價

MM的療效評估參考2016年IMWG療效標(biāo)準(zhǔn)［7］，分為CR、非常好的部分緩解（very good partial remission，VGPR）、部分緩解（partial remission，PR）、疾病穩(wěn)定（steady disease，SD）、疾病進展（progression disease，PD）、復(fù)發(fā)；ORR為CR、VGPR及PR的率的總和。根據(jù)2014年IMWG的預(yù)后評估體系進行危險分層［8］，其中低危指國際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）Ⅰ或Ⅱ期且沒有t（4；14）或17p13-和1q21+，中危指不符合低危及高危標(biāo)準(zhǔn)，高危指ISS分期Ⅱ/Ⅲ期且t（4；14）或17p13-。采用美國國立癌癥研究院通用毒性標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE 3.0）評估不良事件，分為1～5級；根據(jù)美國血液與骨髓移植學(xué)會2018年發(fā)布的共識分級系統(tǒng)［9］對細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）進行診斷和分級（1～4級）。

1.5 隨訪

通過電話、門診復(fù)查進行隨訪，隨訪截至2021年12月。主要觀察指標(biāo)為患者持續(xù)緩解時間（duration of response，DOR）、無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）和總生存期（overall survival，OS）。DOR定義為自評估為CR、VGPR或PR至第一次評估為PD或因任何原因死亡的時間，RFS定義為從接受BCMA-CAR-T細(xì)胞開始至疾病復(fù)發(fā)或因疾病進展死亡的時間，OS定義為從接受BCMA-CAR-T細(xì)胞開始到末次隨訪或因任何原因死亡的時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析?；颊咛卣鞑捎妹枋鲂越y(tǒng)計，分類變量組間比較采用Fisher精確概率法，DOR、RFS及OS采用Kaplan-Meier方法進行評估，采用Cox回歸模型對臨床及實驗參數(shù)進行單因素分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征

共33例RRMM患者符合標(biāo)準(zhǔn)納入研究，其中6例患者因培養(yǎng)失敗未進行細(xì)胞輸注，3例患者放棄治療，最終納入24例。24例RRMM患者中位年齡為62歲（范圍：35～70歲），其中男性14例，女性10例；原發(fā)難治性3例、曾接受自體造血干細(xì)胞移植2例、曾使用CD38單抗1例；高危15例；治療線數(shù)大于3次11例；有EMD 5例，其中漿細(xì)胞白血病2例，侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)1例，同時累及多部位浸潤2例；外周血Tregs水平高于正常值上限15例，其余9例Tregs水平正?；蜉^低。24例RRMM患者的基線資料詳見表1。

表1 24例RRMM患者的基線特征［n（%）］Tab.1 Baseline characteristics of the 24 RRMM patients［n(%)］

2.2 EMD和Tregs對緩解率的影響

輸注BCMA-CAR-T細(xì)胞2個月內(nèi)，所有患者的ORR為87.5%，CR為50.0%，VGPR為29.2%，PR為8.3%。有EMD患者的ORR及CR明顯低于無EMD患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.318，P=0.038；χ2=2.460，P=0.014）；Tregs水平異常增高患者的ORR及CR與Tregs水平正常或較低患者比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3 EMD和Tregs對患者DOR的影響

BCMA-CAR-T細(xì)胞治療后RRMM患者的緩解程度與DOR存在相關(guān)性，其中達到CR、VGPR及PR患者的中位DOR分別為16.6個月、7.8個月及3.5個月，不同緩解程度患者的DOR比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=25.323，P=0.001），見圖1。有無EMD患者的中位DOR分別為5.333（95%CI：1.359～9.307）個月和13.611（95%CI：10.600～16.622）個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.318，P=0.004）；Tregs水平異常增高患者與Tregs水平正?；蜉^低患者的中位DOR分別為8.917（95%CI：6.849～10.984）個月和18.250（95%CI：13.438～23.062）個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.479，P=0.001），見圖2。

圖1 患者緩解深度對持續(xù)緩解時間的影響Fig.1 Effects of depth of remission on duration of response

圖2 EMD和Tregs對患者持續(xù)緩解時間的影響Fig.2 Effects of EMD and Tregs on duration of response

2.4 EMD和Tregs對患者OS及RFS的影響

隨訪截至2021年12月，中位隨訪15.2個月（范圍：2.1～29.0個月），總體OS率為79.2%，RFS率為54.2%。有無EMD患者的OS率分別為60.0%、84.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.187，P=0.013），見圖3A；Tregs水平異常增高患者與Tregs水平正常或較低患者的OS率分別為73.3%、88.9%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.128，P=0.077），見圖3B。有無EMD患者的RFS率分別為40.0%、57.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.397，P=0.007），見圖4A；Tregs水平異常增高患者與Tregs水平正?；蜉^低患者的RFS率分別為40.0%、77.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.478，P=0.011），見圖4B。

圖3 EMD和Tregs對患者總生存的影響Fig.3 Effects of EMD and Tregs on overall survival

圖4 EMD和Tregs對患者無復(fù)發(fā)生存的影響Fig.4 Effects of EMD and Tregs on relapse-free survival

進一步采用單因素Cox回歸分析接受BCMACAR-T細(xì)胞治療患者的基線特征與OS、RFS的關(guān)系，結(jié)果顯示，有無EMD患者的OS和RFS差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=8.465，95%CI：1.150～62.315，P=0.036；HR=5.569，95%CI：1.332～23.285，P=0.019），Tregs水平異常增高患者與Tregs水平正?；蜉^低患者的RFS差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=8.806，95%CI：1.088～71.282，P=0.017）。

2.5 安全性評價

所有患者總體耐受性良好，不良反應(yīng)以血液學(xué)毒性反應(yīng)為主，包括中性粒細(xì)胞減少癥（83.3%）、貧血（41.7%）和血小板減少癥（45.8%）。發(fā)生CRS 19例（79.2%），神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)2例（8.3%），未見因不良反應(yīng)死亡病例。有無EMD組及Tregs水平高低組患者在BCMA-CAR-T細(xì)胞治療中總體不良事件的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 有無EMD及Tregs水平高低患者的不良反應(yīng)發(fā)生情況［n（%）］Tab.3 The adverse reactions of patients with or without EMD and Tregs level［n(%)］

3 討論

BCMA-CAR-T療法在RRMM患者中顯示出良好的療效，但也有部分患者無效或持久性較差，而患者特殊的臨床特征如EMD、Tregs、基線腫瘤負(fù)荷、ISS分層高危等可能是其中原因之一［1，10］。當(dāng)克隆漿細(xì)胞生長在遠離骨髓的解剖部位，或生長在突破皮質(zhì)骨的骨病變附近時，稱為EMD。EMD是MM的一種罕見表現(xiàn)，其特征是累及單個或多個器官，包括皮膚、肝臟、淋巴系統(tǒng)、胸膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。在新診斷的MM患者中，EMD發(fā)病率為3%～5%，而在復(fù)發(fā)MM患者中EMD發(fā)病率高達20%［11］。既往研究顯示，EMD的存在與MM更具侵襲性的表型、血清乳酸脫氫酶升高和高危細(xì)胞遺傳學(xué)如17p缺失、t（4；14）、t（14；16）有關(guān)［12］。EMD治療方案通常遵循高危MM的治療方案，但預(yù)后很差，僅接受化療患者4年OS率和無進展生存（progression-free survival，PFS）率分別為54%和29%；單次自體移植作為鞏固治療并沒有明顯改善患者生存，但接受雙次自體移植后OS率和PFS率分別為83%和52%，該策略可能會克服不良預(yù)后［13］。關(guān)于BCMA-CAR-T細(xì)胞療法，有研究報道部分合并EMD的RRMM患者可在短期內(nèi)受益于BCMA-CAR-T細(xì)胞療法，為橋接造血干細(xì)胞移植、放療和其他治療提供了時間［14］。也有研究顯示，有無EMD的RRMM患者接受人源化抗BCMA-CAR-T細(xì)胞治療后ORR和短期內(nèi)的PFS及OS無明顯獲益，但是隨著時間延長伴EMD患者的PFS和OS率低于無EMD患者［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)，有EMD的RRMM患者ORR、DOR以及RFS率和OS率均較無EMD患者明顯降低，與上述文獻［15］報道相似，提示EMD可能是RRMM患者BCMA-CAR-T細(xì)胞治療預(yù)后不良的指標(biāo)。BCMA-CAR-T細(xì)胞治療不能改善EMD患者的結(jié)局，提示BCMA-CAR-T細(xì)胞治療可能不能改善這部分患者的復(fù)發(fā)問題。因此，對于高Tregs水平患者如何改善其免疫重建，優(yōu)化CAR-T設(shè)計，是需要考慮的問題［16-17］。目前，對于伴EMD的患者，建議通過優(yōu)化CAR設(shè)計、增強持久性和活性的組合方法、優(yōu)化預(yù)處理方案、采用雙抗原靶向以防止抗原逃逸、減少化療線數(shù)、早期應(yīng)用CAR-T細(xì)胞治療等途徑提高CAR-T細(xì)胞治療效力［18-19］。

免疫損傷是MM的一個重要特征，骨髓微環(huán)境高度免疫抑制涉及體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)，包括未受影響的免疫球蛋白水平降低和功能失調(diào)的T細(xì)胞反應(yīng)，同時也與MM患者發(fā)病、復(fù)發(fā)甚至死亡相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中的Tregs在抑制腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，高Tregs水平能促進免疫逃逸和腫瘤生長，致使預(yù)后不良［20］，同時Tregs細(xì)胞亞群對CAR-T細(xì)胞治療惡性腫瘤療效的影響及可能機制也已有初步探討［6，10，21］。但目前 Tregs與BCMA-CAR-T細(xì)胞治療療效的關(guān)系鮮見報道。為了明確Tregs對BCMACAR-T細(xì)胞療效的影響，本研究進一步分析Tregs水平異常增高以及Tregs水平正?；蜉^低患者的近期療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tregs水平高低并不影響患者的總體緩解率，但Tregs水平異常增高患者的DOR明顯縮短，總體RFS率也明顯降低，表明高水平Tregs患者接受BCMA-CAR-T細(xì)胞治療后，Tregs可能影響CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)進一步擴增及作用的持久性，提示高水平Tregs患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險較高。

血液學(xué)毒性是BCMA-CAR-T細(xì)胞治療最常見的不良反應(yīng)，本研究中CRS發(fā)生率為79.2%，ICANS為8.3%，與文獻［22］報道結(jié)果（CRS為 80.3%，ICANS為10.5%）相似。進一步分析有無EMD以及高低Tregs水平患者的不良反應(yīng)發(fā)生率情況，也未發(fā)現(xiàn)其差異性，同時均未見治療相關(guān)死亡事件，說明BCMA-CAR-T療法在RRMM患者治療中具有良好安全性，EMD及高Tregs水平并未增加CAR-T細(xì)胞治療的不良反應(yīng)風(fēng)險。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EMD及Tregs水平可影響RRMM患者的BCMA-CAR-T細(xì)胞治療療效，合并EMD患者近期療效及生存較差，Tregs水平異常增高可能是其復(fù)發(fā)的危險因素，但兩者并不影響B(tài)CMA-CAR-T療法的不良反應(yīng)。但本研究納入的病例數(shù)以及隨訪時間有限，且為回顧性研究，因此有關(guān)結(jié)論仍需進一步驗證。