趙越 阮祥燕 谷牧青 許新 程姣姣

作者單位：100026 北京 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院內(nèi)分泌科

絕經(jīng)激素治療（menopausal hormone therapy，MHT）是解決絕經(jīng)問題的最佳方案［1］，但是，近年來大量研究表明激素治療可增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險［2-5］，如經(jīng)典的婦女健康倡議（women′s health initiative，WHI）研究發(fā)現(xiàn)激素治療5年后乳腺癌發(fā)生風(fēng)險增加了21%［2］。因此，深入探索激素與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險的機制具有重要意義。既往研究［6］顯示，激素致乳腺癌增殖與孕激素膜受體過表達密切相關(guān)。孕激素膜受體組分 1（progesterone receptor membrane components 1，PGRMC1）屬于膜相關(guān)孕激素受體蛋白家族，相對分子量為22～26 kDa，是多蛋白孕酮復(fù)合物的成員之一。PGRMC1也是細胞膜上孕激素重要的特異性結(jié)合位點，且與腫瘤的生物學(xué)特性密切相關(guān)。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中PGRMC1陽性表達率高達70%，且其表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及組織學(xué)分級相關(guān)［7］，提示PGRMC1可能與乳腺癌的惡性表型有關(guān)。此外，在體外及動物實驗中發(fā)現(xiàn)，PGRMC1高表達的雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌細胞在雌孕激素聯(lián)合刺激下可明顯促進細胞增殖，且這種促癌作用可能與PGRMC1調(diào)控ER信號通路有關(guān)［8-9］。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步探索在雌孕激素聯(lián)合刺激下，PGRMC1與ER信號通路抑制蛋白復(fù)合物的相互作用及其對下游ER信號通路的調(diào)控作用，為闡明PGRMC1在激素治療中促進乳腺癌發(fā)展的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人乳腺癌細胞株MCF7購自國家生物醫(yī)學(xué)實驗細胞資源庫，接種至預(yù)先添加1×10-10moL雌二醇激素（E2758）、1×10-6moL孕烯二酮激素（P0130）的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胚腎細胞HEK293T購自上海研生生化試劑所。雌二醇激素（E2758）、孕烯二酮激素（P0130）購自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，Protein G瓊脂珠購自南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL免疫印跡發(fā)光底物購自Thermo公司，EDU檢測試劑盒（C0075）、ER抑制因子1（PHB1）抗體（ab75766）、PGRMC1抗體（ab194879）、β-actin抗體（ab8226）、血小板凝血酶蛋白1（thrombospondin-1，THBS1）抗體（ab224054）和 GAPDH 抗體（ab8245）均購自美國Abcam公司，標簽抗體Flag-tag抗體（8146）、GST-tag抗體（9101）、His-tag抗體（12698）均購自美國CST公司，ER抑制因子2（PHB2）抗體（sc-133094）購自美國Santa Cruz公司，逆轉(zhuǎn)錄酶、qPCR Mix均購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司，空質(zhì)粒（HA-Vector）、過表達PGRMC1的慢病毒質(zhì)粒均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 細胞系構(gòu)建

1.2.1 穩(wěn)定過表達PGRMC1細胞系的構(gòu)建 按照本課題組前期研究［8］構(gòu)建方法，將PGRMC1蛋白質(zhì)編碼區(qū)構(gòu)建到慢病毒載體PCDH中，并將空質(zhì)粒（HA-vector）和過表達PGRMC1的慢病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至人胚腎細胞HEK293T中，收集細胞上清進行慢病毒濃縮。將濃縮后的慢病毒液感染MCF7細胞系，并用嘌呤霉素篩選陽性細胞，即得到穩(wěn)定過表達PGRMC1細胞系（PGRMC1組）及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HA-vector（對照組）的乳腺癌細胞系。

1.2.2 穩(wěn)定下調(diào)PHB復(fù)合體（PHB1和PHB2）細胞系的構(gòu)建 將shPHB1序列（shPHB1-1、shPHB1-2）構(gòu)建到慢病毒載體SHC201上，質(zhì)粒構(gòu)建均由武漢淼靈生物科技有限公司完成；用人胚腎細胞HEK293T對空質(zhì)粒（shNC）及shPHB1慢病毒質(zhì)粒進行包裝。將濃縮后的慢病毒液感染MCF7細胞系，并用嘌呤霉素進行陽性細胞篩選，即得到穩(wěn)定敲降PHB1細胞系（shPHB1-1組、shPHB1-2組）及空質(zhì)粒的乳腺癌細胞系（NC組）。shPHB1序列如下：shPHB1-1正義5′-CCAGAAATCACTGTGAAATT-3′；shPHB1-2 正義 5′-CGTGGGTACAGAAACCAATT-3′。

1.2.3 敲降PHB1后穩(wěn)定過表達PGRMC1細胞系的構(gòu)建 將穩(wěn)定過表達PGRMC1的慢病毒液感染已穩(wěn)定敲降PHB1的MCF7細胞系，并用滅瘟素S進行陽性細胞篩選，即得到敲降PHB1后穩(wěn)定過表達PGRMC1的細胞系。

1.3 免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析檢測PGRMC1相互作用蛋白

1.3.1 檢測PGRMC1相互作用蛋白PHB1/PHB2 將Flag空載質(zhì)粒和Flag-PGRMC1過表達質(zhì)粒（上海生工構(gòu)建）分別轉(zhuǎn)染MCF7細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用PBS清洗后，加入RIPA細胞裂解液裂解，4℃下14 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，采用BCA法測定蛋白濃度。按照2 μg抗體/1 mg總蛋白的標準加入Protein G瓊脂珠和4 μg抗體，4℃下過夜孵育；次日離心收集Protein G瓊脂珠，用PBS清洗3次，收集蛋白并加入適量蛋白上樣緩沖液，在伯樂SDS-PAGE系統(tǒng)上進行凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色和脫色后，從泳道上端一直到泳道下端將凝膠切下，送至中科院生物物理所質(zhì)譜中心進行質(zhì)譜分析。鑒定到相互作用蛋白后，按照上述流程進行免疫共沉淀，用SDS-PAGE分離蛋白，然后用抗Flag、PHB1和PHB2抗體檢測其相對表達情況。

1.3.2 檢測PHB1與ER的相互作用 實驗分為3組，其中第1組用HA-vector對照細胞系轉(zhuǎn)染Flag空載質(zhì)粒，第2組和第3組分別用HA-vector對照細胞系和過表達PGRMC1的細胞系轉(zhuǎn)染Flag-PHB1。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，加入RIPA細胞裂解液提取蛋白后進行免疫共沉淀，然后用抗ER和PHB1抗體檢測其相對表達情況。

1.4 免疫印跡法檢測PHB1、PHB2和PGRMC1的表達情況

將加入適量RIPA的細胞裂解液置于冰上充分裂解各組細胞，離心后取上清液，按照BCA法檢測蛋白的濃度，根據(jù)蛋白濃度加入適量蛋白上樣緩沖液，調(diào)節(jié)蛋白濃度為1 mg/mL。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入PGRMC1、GAPDH、PHB1、PHB2、Flag、GST、His和β-actin的一抗，4℃過夜孵育；用PBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h后再用PBST洗膜3次，在PVDF膜上加入適量的顯影底物，在免疫印跡顯影儀上顯影檢測目的蛋白的表達。

1.5 GST pull-down實驗驗證蛋白間的直接相互作用

將上海生工構(gòu)建的重組PGRMC1、PHB1和PHB2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21（DE3），并置于含100 mg/L氨芐青霉素或卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用酶標儀檢測各組細胞600 nm波長處的光密度（OD）值，當(dāng)OD值達到0.8～1.0時，添加異丙基-β-D-硫葡糖苷酶至終濃度為0.5 mmol/L，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后，5 000 r/min離心10 min，收集細胞。將細胞重懸于裂解緩沖液（20 mmol/L Tris，pH 8.0，400 mmol/L NaCl）中，超聲裂解后，16 000 r/min 離心30 min去除沉淀，用Ni-NTA親和柱純化PHB1和PHB2，用谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化PGRMC1；通過考馬斯亮藍染色驗證重組蛋白的完整性。

將谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂珠與2 μg的GST或GST-PGRMC1融合蛋白偶聯(lián)，并在4℃下與His標簽的PHB1或PHB2孵育4 h，然后用PBS緩沖液洗滌4次。通過SDS-PAGE分離與偶聯(lián)Flag抗體的微珠（beads）結(jié)合的蛋白，并用抗His和抗GST抗體進行免疫印跡。

1.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

取各組MCF7細胞分別接種至96孔板（5 000/孔）中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)置5個平行。分別在24 h、48 h和72 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液。以加入相應(yīng)量的細胞培養(yǎng)物和CCK-8但未加入細胞的孔作為空白對照。各組細胞在37℃孵育1 h后，用酶標儀測定450 nm波長處的OD值。

1.7 EDU實驗檢測細胞增殖能力

取各組MCF7細胞分別接種至24孔板（2×104/孔）中，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)置3個平行。根據(jù)EDU檢測試劑盒說明書對細胞增殖進行檢測，用熒光顯微鏡拍照記錄。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將各組MCF7細胞分別接種至6孔板（2×105/孔）中，孵育24 h后，用胰蛋白酶消化，離心，洗滌，收集細胞并在4℃的70%乙醇中固定過夜，次日離心除去乙醇固定液。將細胞樣品與含有10 mg/mL的RNase A的碘化丙啶（PI）工作溶液在37℃下繼續(xù)孵育30 min，用FACScan流式細胞儀（BD C6，美國）分析樣品，使用FlowJo 10.0軟件保存并分析數(shù)據(jù)。

1.9 RT-qPCR檢測相關(guān)因子mRNA的表達

使用Trizol試劑提取各組MCF7細胞中的總RNA，并用隨機引物和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈，使用CFX96實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Bio-Rad）進行RT-qPCR反應(yīng)分析。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃2 min；變性95℃30 s；退火58℃30 s；延伸72℃ 30 s。引物序列：GAPDH正義5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反義5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；PHB1正義 5′-GACCACGTAATGTGCCAGTC-3′，反義 5′-GCACACGCTCATCATAGTCC-3′；PHB2 正義 5′-GTTGTCTCGACCCAATGCTC-3′，反義5′-CACTCTTGAGCACCTCGTTG-3′；THBS1 正義 5′-GCTCTACCAGTGTCCTCCTC-3′，反義 5′-TGGCTTGCAAGTCCTTTGTC-3′；趨化因子配體 12（C-X-C chemokine ligand 12，CXCL12）正義5′-ATGAACGCCAAGGTCGTGG-3′，反義 5′-AAGTGGATTCAGGAGTACC-3′；乳腺癌雌激素調(diào)控基因1（growth regulation by estrogen in breast cancer 1，GREB1）正義 5′-ACGTGCTACCAGAATTCCCA-3′，反義 5′-TAGACGGTAAGCAGGAGCTG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，并通過2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。每個樣品重復(fù)測量3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGRMC1與PHB1/PHB2存在直接相互作用關(guān)系

通過免疫共沉淀純化Flag-PGRMC1，再利用質(zhì)譜鑒定技術(shù)分析，結(jié)果顯示PHB1和PHB2均存在于Flag-PGRMC1的免疫共沉淀組分中，見圖1A。通過質(zhì)譜分析鑒定免疫共沉淀產(chǎn)物并進行數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果在MCF7細胞中共鑒定到463種編碼的蛋白質(zhì)；進一步采用免疫共沉淀技術(shù)驗證質(zhì)譜分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在Flag-PGRMC1組分中也檢測到PHB1和PHB2信號，見圖1B。在體外條件下進行GST pull-down實驗，結(jié)果顯示，在無其他蛋白因子干擾情況下，PGRMC1與PHB1和PHB2之間存在直接相互作用關(guān)系，見圖1C。

圖1 PGRMC1與PHB1和PHB2相互作用的鑒定Fig.1 Identification of PGRMC1 interaction with PHB1 and PHB2

2.2 過表達PGRMC1在雌孕激素刺激下促進乳腺癌細胞周期進程及細胞增殖

MCF7細胞經(jīng)雌孕激素聯(lián)合刺激后，免疫印跡和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，PGRMC1組中PGRMC1 mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于對照組（均P＜0.01），表明成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達PGRMC1的MCF7細胞系，見圖2A～B。CCK-8檢測結(jié)果顯示，PGRMC1組細胞增殖速度較對照組明顯加快（均P＜0.05），見圖2C；EDU染色實驗顯示PGRMC1組中EDU標記的陽性細胞明顯多于對照組（P＜0.01），見圖2D。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，PGRMC1組細胞周期中的S期和G2/M期陽性細胞比例均明顯增加（均P＜0.05），G0/G1期陽性細胞分布明顯降低（P＜0.01），見圖2E。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，PGRMC1過表達后MCF7細胞中ER信號通路下游靶基因THBS1、CXCL12和GREB1的表達水平均較對照組明顯升高（均P＜0.01），見圖2F。提示在雌孕激素聯(lián)合作用下，PGRMC1過表達可能通過促進有絲分裂進程促進細胞增殖。

圖2 雌孕激素刺激下過表達PGRMC1可促進乳腺癌細胞周期進程及細胞增殖Fig.2 Overexpression PGRMC1 promoted cell cycle progression and proliferation in breast cancer during hormone stimulation

2.3 PGRMC1通過PHB復(fù)合體調(diào)控ER下游信號通路

免疫印跡和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，兩種shPHB1慢病毒侵染MCF7細胞后，PHB1的mRNA和蛋白表達水平均較NC組顯著降低（均P＜0.01），表明成功構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)PHB復(fù)合體的MCF7細胞系，見圖3A～B。CCK-8檢測結(jié)果顯示，下調(diào)PHB1可促進MCF7細胞增殖（P＜0.01），見圖3C。EDU染色實驗同樣顯示，下調(diào)PHB1后EDU標記的陽性細胞明顯多于NC組（P＜0.001），見圖3D。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也顯示，與NC組相比，下調(diào)PHB1后MCF7細胞周期中S期和G2/M期陽性細胞比例均明顯增加（均P＜0.05）；而下調(diào)PHB1后再過表達PGRMC1，細胞周期中S期和G2/M期陽性細胞比例與單獨下調(diào)PHB1比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3E，提示PGRMC1可能通過PHB1復(fù)合體調(diào)控細胞周期。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，下調(diào)PHB1可促進ER信號通路下游靶基因THBS1、CXCL12和GREB1的表達（均P＜0.01），見圖3F。免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，PGRMC1過表達后MCF7細胞中PHB1與ER的相互作用減弱，見圖3G。以上實驗結(jié)果表明，PGRMC1可能通過PHB復(fù)合體調(diào)控ER下游信號通路從而促進乳腺癌細胞增殖。

圖3 PGRMC1通過PHB復(fù)合體調(diào)控ER下游信號通路Fig.3 PGRMC1 regulated ER downstream signaling through PHB complex

3 討論

MHT中最重要的安全問題是乳腺癌風(fēng)險［10］。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與細胞內(nèi)的信號通路密切相關(guān)，其中ER信號通路在乳腺癌細胞內(nèi)的直接或交互作用尤為重要［11-12］。已知PGRMC1介導(dǎo)的P450代謝途徑可參與調(diào)節(jié)雌孕激素的代謝與合成，其中參與激素合成的羥化酶及芳香化酶都屬于P450基因家族［13］。因此推測，PGRMC1可能參與雌激素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本課題組前期的體內(nèi)外實驗［8，11，14］均顯示了雌激素聯(lián)合孕激素對PGRMC1高表達的ER陽性乳腺癌細胞增殖的協(xié)同效應(yīng)，而且這種增殖作用可被ER拮抗劑完全阻斷，提示PGRMC1可在體內(nèi)外增強雌激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CAHILL等［15］也報道在PGRMC1高表達的ER陽性乳腺癌細胞中添加雌孕激素可明顯促進細胞增殖。臨床研究也發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中PGRMC1表達與ER表達呈高度正相關(guān)［16-17］。本研究也發(fā)現(xiàn)PGRMC1過表達在雌孕激素作用下不僅能明顯促進乳腺癌細胞周期進程及細胞增殖，還能促進ER信號通路下游靶基因THBS1、CXCL12和GREB1的表達，再次印證了上述研究觀點，提示PGRMC1可能通過促進ER信號通路下游靶基因的表達，從而加速激素刺激條件下乳腺癌細胞的惡性增殖。

既往研究［17］顯示ER與ER抑制因子（PHB1/PHB2）結(jié)合可抑制ER下游信號通路傳導(dǎo)，從而阻斷乳腺癌細胞增殖，因此推測PHB1和PHB2可能是PGRMC1的潛在相互作用對象。為了印證這一假設(shè)，本研究首先采用免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析篩選相互作用的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHB1和PHB2均存在于PGRMC1共沉淀的復(fù)合體中，進一步的GST pull-down實驗證實在排除其他蛋白因子干擾下，PGRMC1和ER信號通路抑制因子PHB1和PHB2之間存在直接相互作用的關(guān)系。同時，為了進一步驗證PGRMC1對ER陽性乳腺癌細胞的促進作用是否依賴于PGRMC1與PHB1和PHB2的相互作用，本研究在ER陽性MCF7細胞中通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)PHB1表達，并觀察其對細胞增殖、細胞周期等的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)PHB1可促進乳腺癌細胞增殖，并激活ER信號通路下游靶基因THBS1、CXCL12、GREB1的表達，同時過表達PGRMC1后細胞的有絲分裂進程并未明顯加速。此外，免疫共沉淀檢測還發(fā)現(xiàn)在PGRMC1過表達細胞中PHB1與ER的相互作用明顯減弱，說明PGRMC1可能通過PHB復(fù)合體調(diào)控ER下游信號通路，進而促進乳腺癌細胞增殖。

綜上所述，本研究初步探索了激素與PGRMC1結(jié)合誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖的分子機制，初步證實PGRMC1可通過與PHB復(fù)合體結(jié)合，解除后者對ER信號通路的抑制作用，從而促進ER信號通路的活化及其下游靶基因的表達，最終加速乳腺癌細胞增殖。但本研究的體外實驗培養(yǎng)時間較短，無法完全反映體內(nèi)激素治療的長期過程，此外PGRMC1協(xié)同激素促進乳腺癌細胞增殖確切的作用機制仍需在動物實驗研究中進一步證實。