吳 桐， 樊逸菲， 許博洋， 程 錦， 敖英芳， 胡曉青

(北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性的關(guān)節(jié)退行性疾病，是包括關(guān)節(jié)炎癥、軟骨退變和結(jié)構(gòu)改變?cè)趦?nèi)的關(guān)節(jié)整體的變化，臨床上會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形的表現(xiàn)，影響患者的活動(dòng)、生活質(zhì)量，甚至致殘[1]。當(dāng)前，我國(guó)65歲以上人群中OA的發(fā)病率超過50%，75歲以上人群中超過80%[2]。OA的病因復(fù)雜，目前的治療方法只有消炎鎮(zhèn)痛、軟骨保護(hù)等對(duì)癥治療和關(guān)節(jié)置換手術(shù)，仍無針對(duì)病因的有效治療手段。

OA主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退變及其細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)代謝穩(wěn)態(tài)失衡，OA軟骨退變與衰老、創(chuàng)傷、代謝紊亂及異常應(yīng)力有關(guān)[3]。衰老(aging)參與調(diào)控機(jī)體多種復(fù)雜生理和病理過程，貫穿整個(gè)生命周期[4]。已有研究表明，衰老與OA軟骨退變進(jìn)程密不可分[5, 6]，包括長(zhǎng)年使用所致關(guān)節(jié)軟骨組織磨損，以及關(guān)節(jié)內(nèi)組織出現(xiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象，影響軟骨組織的修復(fù)再生能力[6, 7]。然而，細(xì)胞衰老如何影響OA軟骨退變進(jìn)程及其具體作用機(jī)制仍不清楚，靶向清除衰老細(xì)胞來延緩OA軟骨退變進(jìn)程已成為研究熱點(diǎn)。

學(xué)者們利用多種細(xì)胞衰老標(biāo)記物研究細(xì)胞衰老與疾病的關(guān)系，包括基因Cdkn2a(p16，p16INK4a)和Cdkn1a(p21，p21CIP)編碼的p16和p21蛋白質(zhì)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)、DNA損傷、衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)等[8]?，F(xiàn)有OA動(dòng)物模型大多需要處死動(dòng)物來明確OA疾病進(jìn)程及軟骨損傷程度，缺乏無創(chuàng)、實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞衰老與OA疾病進(jìn)程相關(guān)性的動(dòng)物模型。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得Cdkn2a基因定點(diǎn)敲入Luc-2A-tdTomato-2A-CreERT2-WPRE-pA雜合子小鼠，對(duì)該轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行手術(shù)誘導(dǎo)建立體內(nèi)OA模型，驗(yàn)證該基因工程小鼠對(duì)于OA和衰老關(guān)系研究的作用，并探討該模型小鼠用于靶向衰老治療OA的臨床研究的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的C57BL/6小鼠來自于上海南方模式生物科技股份有限公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查，并遵守北京大學(xué)動(dòng)物保護(hù)規(guī)定。小鼠飼養(yǎng)在特定的無病原體(specific pathogen-freefacility，SPF)設(shè)施條件的動(dòng)物房，動(dòng)物房采用12 h光照和12 h黑暗循環(huán)，同時(shí)保證小鼠可自由進(jìn)食和喝水。年輕小鼠為10 ～ 12周齡，雌鼠和年輕的同窩雄鼠分籠飼養(yǎng)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：LA2020353)，每個(gè)籠子不超過5只。

1.2 熒光示蹤小鼠的獲得

采用CRISPR/Cas9技術(shù),通過同源重組的方式，在Cdkn2a基因Cdkn2a-201轉(zhuǎn)錄本exon 2(第62個(gè)氨基酸之后)定點(diǎn)敲入Luc-2A-tdTomato-2A-CreERT2-WPRE-pA表達(dá)框。簡(jiǎn)要過程如下：通過體外轉(zhuǎn)錄的方式，獲得Cas9 mRNA和gRNA；通過In-Fusion cloning的方法構(gòu)建同源重組載體(donor vector)，該載體包含4.0 Kb 5′同源臂、Luc-2A-tdTomato-2A-CreERT2-WPRE-pA和4.0 Kb 3′同源臂。將Cas9 mRNA、gRNA和donor vector顯微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，獲得F0代小鼠。經(jīng)長(zhǎng)片段PCR鑒定，共獲得2只正確同源重組的F0代小鼠；F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得6只陽(yáng)性F1代小鼠。由F1代小鼠進(jìn)行繁殖和培育，共選取24只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建

將小鼠隨機(jī)分為3組：正常組、假手術(shù)組(sham)、前交叉韌帶橫斷術(shù)組(anterior cruciate ligament transection，ACLT)。ACLT組通過前交叉韌帶切斷術(shù)構(gòu)建小鼠創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎模型。選取的小鼠麻醉后，備皮消毒，在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開皮膚、皮下組織、關(guān)節(jié)囊，暴露前交叉韌帶。用顯微剪切斷前交叉韌帶。并進(jìn)行前抽屜試驗(yàn)檢查前交叉韌帶是否已經(jīng)斷裂。消毒后逐層縫合。實(shí)驗(yàn)組小鼠雙側(cè)腿均進(jìn)行手術(shù)。假手術(shù)組小鼠麻醉后，常規(guī)備皮消毒，在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)逐層切開皮膚、皮下組織、關(guān)節(jié)囊，不切斷前交叉韌帶。隨后消毒、逐層縫合。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查，并遵守北京大學(xué)動(dòng)物保護(hù)規(guī)定。上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都依據(jù)相應(yīng)的國(guó)際準(zhǔn)則實(shí)施。

1.4 活體成像

采取異氟烷麻醉小鼠，在其關(guān)節(jié)內(nèi)注射10 μL熒光素酶底物，15 min后用 IVIS Spectrum體內(nèi)成像系統(tǒng)測(cè)量發(fā)光。

1.5 熱板分析

將小鼠置于55 ℃熱板儀(UGO BASILE srl，意大利)。出現(xiàn)后肢反應(yīng)(例如，搖晃、跳躍或舔舐)時(shí)間被記錄為手術(shù)前和手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間。每只小鼠至少進(jìn)行了3次測(cè)量，每次測(cè)量間隔時(shí)間≥30 min。觀察者和記錄者對(duì)小鼠的基因型和干預(yù)措施不知情。

1.6 顯微CT

采用顯微CT(Micro-CT，Siemens，Inveon MM Gantry，美國(guó))檢測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)形態(tài)、骨贅形成和軟骨下骨質(zhì)結(jié)構(gòu)情況。收取ACLT術(shù)后 4 周的小鼠膝關(guān)節(jié)，切除關(guān)節(jié)囊周圍的肌肉和其他軟組織。使用Micro-CT對(duì)標(biāo)本進(jìn)行掃描(每組n=7 只)。使用Mimics Research software 對(duì) micro-CT 圖像進(jìn)行3D 重建。對(duì)脛骨平臺(tái)處軟骨下骨的形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)估。使用Inveon Research Workplace software對(duì)其進(jìn)行CT定量分析，測(cè)量數(shù)據(jù)包括骨體積分?jǐn)?shù)(trabecular bone volume pertotal volume，BV/TV)和骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor，Tb. Pf)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

收取各組小鼠的膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。移除關(guān)節(jié)囊周圍的皮膚和軟組織、肌肉等，將組織放入10%的中性甲醛中浸泡固定3 d。固定后的標(biāo)本沖洗后脫鈣24 h，隨后流水沖洗過夜。組織脫水后石蠟包埋、切片(厚度5 μm)。石蠟切片脫蠟、過氧化物酶阻斷、胃蛋白酶抗原修復(fù)、Cdkn2a一抗(稀釋比例1∶200，abcam ab54210，英國(guó))4 ℃孵育過夜、山羊抗小鼠二抗、DAB顯色、脫水、透明、封片。

1.8 番紅O固綠液染色

小鼠膝關(guān)節(jié)組織的石蠟切片脫蠟、固綠染液染色、1%冰醋酸固定，番紅O染液染色，95%乙醇洗去浮色，脫水、透明、封片。

1.9 OARSI評(píng)分

OARSI評(píng)分采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：正常軟骨為0分，蛋白質(zhì)多糖、基質(zhì)、軟骨細(xì)胞丟失及基質(zhì)出現(xiàn)纖維化，占全部軟骨的5% ～ 10%為1分，上述病變占軟骨11% ～ 25%為2分，占26% ～ 50%為3分，占全部軟骨51% ～ 75%為4分，75%以上為5分?？偡譃? ～ 30分。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 18.0 statistical software(IBM Corp)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.05。采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建Cdkn2a小鼠，且術(shù)后關(guān)節(jié)區(qū)域熒光增加

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在Cdkn2a-201基因的轉(zhuǎn)錄本exon 2(第62個(gè)氨基酸之后)敲入Luc-2A-tdTomato-2A-CreERT2-WPRE-pA，獲得Cdkn2a-e(Luc-2A-tdTomato-2A-CreERT2-WPRE-pA)1定點(diǎn)敲入的雜合子小鼠。該小鼠體內(nèi)Cdkn2a陽(yáng)性的衰老細(xì)胞可以通過熒光報(bào)告，在體外也可以通過紅色熒光原位顯示Cdkn2a的表達(dá)及分布。

為了在手術(shù)誘導(dǎo)模型小鼠中觀察OA進(jìn)展和局部衰老的情況，對(duì)小鼠進(jìn)行了ACLT手術(shù)，建立手術(shù)誘導(dǎo)OA的模型。在術(shù)后4周收取小鼠，通過動(dòng)物活體成像跟蹤C(jī)dkn2a表達(dá)來確定衰老細(xì)胞是否在小鼠關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后發(fā)生(Fig.1A)。通過ACLT手術(shù)在小鼠中誘導(dǎo)了創(chuàng)傷后OA。在ACLT手術(shù)后，Cdkn2a示蹤小鼠關(guān)節(jié)區(qū)域的熒光均值31 483p/s遠(yuǎn)高于正常組和假手術(shù)組9 749 p/s和5 822 p/s(Fig.1B)，提示Cdkn2a表達(dá)升高。進(jìn)行熒光發(fā)光的量化統(tǒng)計(jì)，也存在顯著的差異(P<0.05)。

Fig.1 Representative luminescence imaging in vivo after surgery The CRISPR/Cas9 technique was used to get heterozygous mice with Cdkn2a-e (Luc-2A-tdTomato-2a-CreerT2-Wpre-PA)1. The Cdkn2a tracer mice were treated with no surgery，sham and ACLT, respectively. Cdkn2a expression was shown by fluorescence imaging in vivo (normal, n=5; sham, n=7; ACLT, n=6) of ACLT mice 4 weeks after surgery (A) and quantification of the luminescence (B) was shown (in arbitrary units, p/s). Values were presented as mean ± SD. **P<0.01. Scale bars, 1 cm

2.2 ACLT術(shù)后4周發(fā)生膝關(guān)節(jié)軟骨退變

在ACLT術(shù)后4周，通過組織學(xué)檢測(cè)來驗(yàn)證骨關(guān)節(jié)炎的情況和軟骨的退化。對(duì)比正常組和假手術(shù)組的番紅O固綠染色，ACLT術(shù)引起損傷減少了蛋白多糖的番紅O染色，在組織學(xué)層面也可以觀察到軟骨變薄、表面軟骨面不連續(xù)(Fig.2A)，表明ACLT術(shù)明顯誘導(dǎo)了小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的退變。同時(shí)，采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)(OARSI)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)OA的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。OARSI評(píng)分表明，與正常組和假手術(shù)組相比，ACLT術(shù)后膝關(guān)節(jié)軟骨組織的OARSI評(píng)分明顯升高，大于0和1分(P<0.05)，表明ACLT術(shù)成功誘導(dǎo)了的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展與軟骨組織的退行性病變(Fig.2B)。

Fig.2 Cartilage degeneration after surgery for 4 weeks Knee tissues of Cdkn2a mice were collected after surgery for 4 weeks. Safranin O-Fast Green Staining(A)and OARSI Score(B)were then performed to confirm the degeneration of cartilage (normal, n=7; sham, n=7; ACLT , n=7). Values were presented as mean ± SD. ****P<0.0001. Scale bars, 200 μm

2.3 術(shù)后膝關(guān)節(jié)Cdkn2a陽(yáng)性衰老軟骨細(xì)胞表達(dá)升高

為了驗(yàn)證骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中衰老的表達(dá)和定位關(guān)節(jié)中衰老軟骨細(xì)胞，對(duì)Cdkn2a進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。在ACLT手術(shù)誘導(dǎo)的小鼠中，Cdkn2a陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多，主要出現(xiàn)在淺表的軟骨區(qū)域(Fig.3A)。相反，在非手術(shù)和假手術(shù)對(duì)照組小鼠中，Cdkn2a蛋白染色陽(yáng)性的細(xì)胞較少。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未進(jìn)行ACLT手術(shù)的小鼠相比，表達(dá)Cdkn2a的細(xì)胞數(shù)目在ACLT小鼠的軟骨表面更多。

Fig.3 Expression of Cdkn2a positive cells in the cartilage Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of senescence markers in OA. The Cdkn2a positive cells were also shown (normal, n=4; sham, n=4; ACLT, n=4). Scale bars, 100 μm

2.4 術(shù)后小鼠出現(xiàn)疼痛癥狀及軟骨下骨改變

采用功能學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)ACLT小鼠的骨關(guān)節(jié)炎疼痛進(jìn)行評(píng)估。骨關(guān)節(jié)炎引起的疼痛癥狀評(píng)估表明，將小鼠置于55 ℃的發(fā)熱平臺(tái)上，因?yàn)橄リP(guān)節(jié)損傷，小鼠對(duì)于高溫的疼痛耐受限度更低，小鼠表現(xiàn)出舔舐、跳躍等規(guī)避疼痛動(dòng)作的反應(yīng)時(shí)間更短(平均反應(yīng)時(shí)間10.35 s)(Fig.4A)。這一反應(yīng)時(shí)間在非手術(shù)組(平均時(shí)間13.22 s)和假手術(shù)組(平均時(shí)間13.37 s)都更長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了ACLT術(shù)小鼠膝關(guān)節(jié)骨贅和軟骨下骨的變化。小鼠的Micro-CT檢測(cè)的3D重建影像證明，在小鼠ACLT術(shù)后4周時(shí)，脛骨平臺(tái)處有少量的骨贅形成、表面粗糙等骨關(guān)節(jié)炎的典型影像學(xué)變化(Fig.4B)。同時(shí)，在Micro-CT掃描成像圖上選擇感興趣區(qū)域做閾值分割等操作，進(jìn)行CT定量分析發(fā)現(xiàn)，ACLT小鼠的骨密度均值為1 166 mg/cm3，低于正常組(均值為1 309 mg/cm3)和假手術(shù)組(均值為1 272 mg/cm3)，提示松質(zhì)骨密度或骨礦物質(zhì)密度降低。在感興趣區(qū)骨組織(TV)相同的條件下，ACLT小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV均值為44.40%，這一均值低于正常組的71.41%和假手術(shù)組的62.76%，提示骨量減少。通過3D重建能對(duì)骨小梁微結(jié)構(gòu)進(jìn)行無損3D成像，通過骨小梁的微結(jié)構(gòu)計(jì)算得到骨小梁模式因子(trabecular pattern factor，Tb.Pf)，可以表現(xiàn)骨質(zhì)狀態(tài)。對(duì)比非手術(shù)、假手術(shù)對(duì)照組都小于0 mm-1的均值，ACLT小鼠的Tb.Pf均值增加為3.990 mm-1，提示骨小梁從板狀變?yōu)闂U狀，發(fā)生了骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)。測(cè)量各組的平均皮質(zhì)骨厚度未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Fig.4C)。

Fig.4 Pain symptoms and imaging detection in mice after surgery The Cdkn2a mice were placed on the heating platform at 55℃ and the reaction time of licking and jumping was shown(A). Micro-CT of joints from mice was performed. The 3D reconstruction of CT indicates the bone changes and the tibial plateau section shows the structure of bone trabeculae(B). Bone density(mg/cm3), bone volume fraction(BV/TV，%)，trabecular pattern factor(Tb.Pf，1/mm)and cortical bone thickness were used to assess subchondral bone changes in osteoarthritis by quantitative CT(C). Values were presented as mean ± SD. *P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001(normal, n=7; sham, n=7; ACLT, n=7)

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是世界上最為常見的關(guān)節(jié)疾病。隨著社會(huì)進(jìn)步發(fā)展與人口老齡化問題凸顯，OA的發(fā)病率也逐年上升，成為巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。臨床上主要是對(duì)癥治療[9, 10]，最終只能進(jìn)行手術(shù)置換關(guān)節(jié)[11]。這阻礙了高齡和存在基礎(chǔ)疾病的患者得到治療。因此，明確OA發(fā)生發(fā)展的病理生理，尋找針對(duì)病因的根治手段，是研究者和臨床醫(yī)生都迫切希望解決的問題。

衰老是OA的最大危險(xiǎn)因素之一。研究者從接受關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者的軟骨組織中發(fā)現(xiàn)了衰老的軟骨細(xì)胞[6, 12, 13]。細(xì)胞衰老是細(xì)胞周期停滯的一種永久性狀態(tài)，在衰老的機(jī)制中發(fā)揮主要作用。衰老"清除"小鼠模型的應(yīng)用是研究衰老與機(jī)體機(jī)制的里程碑。表達(dá)p16INK4a的衰老細(xì)胞被靶向消除后，可以顯著改善小鼠的健康和活力，延長(zhǎng)其壽命[14]。靶向衰老的治療可以緩解衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[15-19]。但衰老在OA病理發(fā)展中確切作用尚未完全清楚，靶向衰老調(diào)節(jié)治療OA仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。

目前，主要研究障礙之一是缺乏合適的研究關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老的體內(nèi)模型，現(xiàn)有的幾種模型也各有利弊[20]。當(dāng)這些模型應(yīng)用于靶向衰老研究OA時(shí)，均存在一個(gè)共同的缺點(diǎn)，無法直觀地、無創(chuàng)地觀測(cè)活體動(dòng)物中的衰老細(xì)胞及其標(biāo)志物，缺乏研究衰老細(xì)胞在OA發(fā)生發(fā)展中的即時(shí)變化數(shù)據(jù)。為了克服這一障礙，本研究提出一種Cdkn2a示蹤小鼠模型。該模型可在體外直觀、無創(chuàng)地即時(shí)跟蹤C(jī)dkn2a的表達(dá)來觀察衰老細(xì)胞在小鼠關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后的變化情況。

本文評(píng)估了該模型在研究創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)病理中的軟骨細(xì)胞衰老的適用性。本文將Cdkn2a示蹤小鼠分別進(jìn)行假手術(shù)及前交叉韌帶的橫切術(shù)，以評(píng)估各組關(guān)節(jié)軟骨中衰老標(biāo)志物的表達(dá)及骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生情況。首先，通過使用動(dòng)物活體成像觀察關(guān)節(jié)腔發(fā)光的方法，本文能夠直觀地觀察到骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)衰老的出現(xiàn)(Fig.1)。同時(shí)通過組織學(xué)檢測(cè)驗(yàn)證了小鼠ACLT術(shù)后骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和軟骨的退化(Fig.2)。本文發(fā)現(xiàn)，ACLT術(shù)后小鼠關(guān)節(jié)軟骨的Cdkn2a表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[15]，進(jìn)一步表明該模型能有效地利用熒光示蹤方法直觀地反映細(xì)胞衰老的變化(Fig.3)總之，本文發(fā)現(xiàn)通過使用細(xì)胞衰老小鼠模型，利用Cdkn2a示蹤的方法可以有效地研究ACLT術(shù)后誘導(dǎo)引起骨關(guān)節(jié)炎的病理特征及其與衰老的關(guān)系。

本研究的突出優(yōu)勢(shì)在于，通過結(jié)合活體小鼠成像和影像學(xué)的檢查，可以在特定時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠OA的進(jìn)展及衰老的變化情況。這使得對(duì)OA和衰老進(jìn)展變化的觀察更具有即時(shí)性也更直觀無創(chuàng)，這種觀察無需處死動(dòng)物，卻能實(shí)時(shí)獲取疾病的進(jìn)展和衰老的變化特征，為后續(xù)用藥物靶向衰老治療OA的研究提供了跟蹤治療全程的便利，這對(duì)于OA的新型藥物治療的研究無疑也是有力的工具。熒光素酶底物發(fā)光可以多次應(yīng)用，熒光素酶底物的半衰期為3 h。每次顯色間隔3 h以上，耗盡底物后即可無創(chuàng)的進(jìn)行二次發(fā)光評(píng)估，這也為重復(fù)實(shí)驗(yàn)提供了便利。除此之外，本文的Cdkn2a示蹤小鼠也同時(shí)插入了tdTomato基因片段，在離體組織或細(xì)胞中可以進(jìn)行Cdkn2a表達(dá)的原位觀察。同時(shí)，此基因敲除小鼠也可以作為Cre工具鼠，在Cdkn2a陽(yáng)性的細(xì)胞中特定敲除某種基因，這為進(jìn)一步開展OA的機(jī)制研究提供了更便利的模型工具。由于CRISPR/Cas9技術(shù)的使用，該模型小鼠全身Cdkn2a基因表達(dá)都可以通過熒光示蹤。因此，我們也期待Cdkn2a示蹤小鼠模型的建立能夠?yàn)槠渌ダ舷嚓P(guān)疾病的研究提供輔助作用。

本研究的局限性在于，只分析了特定的傳統(tǒng)細(xì)胞衰老標(biāo)記物，未詳細(xì)分析衰老的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組標(biāo)記物。這可能是探索ACLT術(shù)后骨關(guān)節(jié)炎中細(xì)胞衰老發(fā)生發(fā)展機(jī)制的一個(gè)角度；另外，本研究缺乏展示該模型小鼠可用于Cdkn2a動(dòng)態(tài)觀察的多時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)，我們將在未來工作中深入進(jìn)行研究。

總而言之，本研究是一次嘗試，利用了Cdkn2a示蹤小鼠作為骨關(guān)節(jié)炎的衰老模型。結(jié)果提示，在未來的研究中應(yīng)當(dāng)更多地關(guān)注Cdkn2a示蹤小鼠，進(jìn)一步探究細(xì)胞衰老在衰老引起的疾病(例如骨關(guān)節(jié)炎)進(jìn)展中的作用機(jī)制，以及去除衰老細(xì)胞是否能減輕疾病的表型等應(yīng)用前景。該模型的使用將有助于識(shí)別細(xì)胞衰老及骨關(guān)節(jié)炎之間的相互作用，為尋找有效的治療手段提供了未來的方向。