王卓為， 戴夢怡， 程少禹， 王小德， 王亞玲， 申亞梅， 張 超*

( 1. 浙江省園林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室/南方園林植物種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室/浙江農林大學 風景園林與建筑學院， 杭州 311300； 2. 西安植物園， 西安 710061 )

花色是觀賞植物重要的品質性狀之一，花青素苷(anthocyanin)是由花青素苷元(anthocyanidin)和糖組成的糖苷，是影響花色的一類重要色素物質(戴思蘭和洪艷，2016)。目前，關于花青素的生物合成途徑的研究已經比較深入。圖1顯示花青素生物合成通路上的3條主鏈產生矢車菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)以及飛燕草素(delphinidin)，矢車菊素甲基化生成芍藥色素(peonidin)，矮牽牛色素(petunidin)和錦葵色素(malvidin)則由飛燕草素不同程度的甲基化而來，共同構成了自然界中6種主要花色素(朱麗娟等，2012)。對花青素苷元進行糖基化修飾，可形成穩(wěn)定的花青素苷并對呈色具有重要作用(招雪晴等，2017)。

在植物花色形成過程中，UDP-類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶(UDP-flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT)通常作用于花青素苷合成途徑的最后一步，能夠催化UDP-葡萄糖中的糖分子轉移到花色素的C3羥基位點上，將花青素轉化生成該通路上第一個穩(wěn)定的花青素苷(Sui et al., 2011)。花青素在自然條件下性質不穩(wěn)定，易通過糖苷鍵與糖形成花青素苷(Nakatsuka et al., 2008)，構成花青素苷的單糖主要有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖(莊維兵等，2018)。從化學的角度來看，糖的結合增加了花青素苷的穩(wěn)定性和水溶性，花青素最常在C3位發(fā)生O-糖基化，其次是C5位的糖基化，糖基化使花青素很容易從細胞質的生產部位轉移到液泡(Nakatsuka et al., 2008)，從而使顏色稍微向紅色轉變(Tanaka et al., 2008)。由此可見，糖基化對花色的形成起到關鍵作用。

第一個被發(fā)現可以催化花青素C3羥基糖基化的酶是玉米() Bronze-1 (X13500)，由于花青素的積累較少，突變體呈現出蒼白的色粒(Dooner & Nelson, 1977；Larson & Coe, 1977)。迄今為止，3基因已經在矮牽牛()(Jonsson et al., 1984)、三花龍膽()(Tanaka et al., 1996)、荷蘭鳶尾()(Yoshihara et al., 2005)、小蒼蘭()(Sui et al., 2011)、滇牡丹()(王毅等，2017)、葡萄風信子()(杜靈娟等，2017)等觀賞植物中克隆得到。在大多數植物中，3的表達常常與花青素的積累正相關，如3和，然而在有的植物中，如3，其表達并不呈現正相關的趨勢(Ban et al., 2009；Sui et al., 2011；Hu et al., 2016； Qian et al., 2021)。3在蝴蝶蘭()紅色形成中起著重要作用，抑制3的表達導致花青素含量的顯著下降(Chen et al., 2011)。舒慶艷等(2018)利用VIGS技術沉默紫斑牡丹()3基因，3G型糖苷和3G5G型糖苷都有不同程度的降低。由此可見，3基因在植物花色形成中具有重要作用。

紫玉蘭‘紅元寶’(‘Hongyuanbao’)為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬()的多年生落葉灌木，是紫玉蘭()的栽培品種，該品種花色深于紫玉蘭。課題組前期研究顯示，紫玉蘭和紫玉蘭‘紅元寶’花被片中均含有4種在C3位蕓香糖苷修飾的花青素苷，即矢車菊素3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(Cy3Ru5G)、矢車菊素3-O-蕓香糖苷(Cy3Ru)、芍藥素3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(Pn3Ru5G)、芍藥素3-O-蕓香糖苷(Pn3Ru) (Wang et al., 2019)。花青素的C3位蕓香糖苷化修飾分兩步完成，首先在3GT作用下C3位發(fā)生O-葡萄糖基化，隨后鼠李糖轉移酶(3-O-rhamnosyltransferase，3RT)才可以轉移O-鼠李糖苷與O-葡萄糖苷相連形成蕓香糖苷基團(Yamazaki et al., 2002)。由此推測紫玉蘭‘紅元寶’花色形成過程中，3基因對4種花青素苷的合成具有重要作用。為進一步揭示其功能，本研究基于轉錄組數據，篩選出3基因，并對其進行克隆和表達分析，研究結果為木蘭屬植物花色形成機理研究提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫玉蘭‘紅元寶’十年生實生苗種植于浙江農林大學平山試驗基地(119°42′54.67″ E、30°15′50.09″ N)，選擇生長健壯且無病蟲害的植株，于2019年4月采取花蕾期(bud period)(S1)、露色期(dew color period)(S2)、初開期(initial flowering period)(S3)、半開期(half-flowering period)(S4)、盛開期(fully-flowering period)(S5)5個時期的最外輪花瓣(圖2)，錫紙包裹，液氮速凍固樣。由于紫玉蘭‘紅元寶’為花葉同放，同時采集根、莖、老葉、嫩葉等組織部位的樣品，保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取和熒光定量分析。

CHS. 查爾酮合成酶; FLS. 黃酮醇合成酶; CHI. 查爾酮異構酶; F3H. 黃烷酮3-羥基化酶; F3′H. 類黃酮-3′-羥基化酶; F3′5′H. 類黃酮-3′,5′-羥基化酶; DFR. 二氫黃酮醇還原酶; ANS. 花青素合成酶; UF3GT. UDP-類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶; LAR. 無色花青素還原酶; ANR. 花青素還原酶。CHS. Chalcone synthase; FLS. Flavonol synthase; CHI. Chalcone isomerase; F3H. Flavanone 3-hydroxylase; F3′H. Flavonoid-3′-hydroxylase; F3′5′H. Flavonoid-3′,5′-hydroxylase; DFR. Dihydroflavonol reductase; ANS. Anthocyanin synthase; UF3GT. UDP-flavonoid 3-O-glucosyltransferase; LAR. Leucoanthocyanin reductase; ANR. Anthocyanin reductase.圖 1 花青素生物合成途徑Fig. 1 The biosynthetic pathway of anthocyanin(Petroni & Tonelli, 2011; Liu et al., 2018)

圖 2 不同開花階段的紫玉蘭‘紅元寶’Fig. 2 Flowering stages of Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’

1.2 總RNA的提取、檢測與cDNA的合成

使用諾禾致源UltraClean Polysaccharide and phenol Plant RNA Purification Kit (DNA free)RNA提取試劑盒(NHUC002S)，提取紫玉蘭‘紅元寶’S1～S5時期花瓣和根、莖、老葉、嫩葉等組織部位的總RNA。使用PrimeScriptRT Master Mix (Perfect Real Time) (TaKaRa code: RR036A)進行反轉錄反應。反轉錄后得到的cDNA保存在-20 ℃冰箱備用。

1.3 Ml3GT1基因克隆

利用本課題組前期構建的紫玉蘭‘紅元寶’花瓣轉錄組數據庫(結果未發(fā)表)，以anthocyanidin/ flavonoid 3-O-glucosyltransferase為檢索詞，對注釋到Nr(non-redundant protein database)數據庫的基因注釋進行篩選，對得到的序列CL3388.Contig1進一步通過NCBI的BLAST功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進行blast比對。在開放閱讀框(open reading frame, ORF)框的兩側使用Prime Prime 5.0軟件設計引物(表1)，引物由杭州有康生物技術有限公司合成。將紫玉蘭‘紅元寶’花發(fā)育的S1～S5共5個時期的cDNA等量混勻，稀釋10倍作為模板，進行RT-PCR擴增。20 μL PCR反應體系如下：上下游引物(10 μmol·L)各1 μL，cDNA模板1 μL，Premix Taq 10 μL，ddHO 7 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min后運行35個循環(huán)(95 ℃變性 30 s，59.6 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min)；72 ℃ 10 min，10 ℃ 5 min。PCR反應結束后，通過1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段。切膠后，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa code: No.9762)試劑盒按照使用說明書進行膠回收。回收后，取適量的回收產物連接至pMD18-T Vector(TaKaRa code: No.6011)。連接產物轉化大腸桿菌DH5α Competent Cells(TaKaRa code: No. 9057)，藍白斑篩選后挑單克隆進行菌落PCR鑒定，條帶正確的送至杭州有康生物技術有限公司進行DNA測序。

表 1 紫玉蘭‘紅元寶’Ml3GT1基因克隆及實時熒光定量引物Table 1 Primers for cloning and real-time quantitative PCR of Ml3GT1 in Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’

1.4 Ml3GT1基因的生物信息學分析

使用SnapGene 4.1.8軟件去除載體序列，獲得目的基因序列；使用DANMAN 7.0軟件將核苷酸序列翻譯成蛋白質序列；利用NCBI提供的ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析序列的編碼區(qū)；利用CDD蛋白保守結構域數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白的保守域；利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對紫玉蘭‘紅元寶’Ml3GT1蛋白序列的分子量、等電點、不穩(wěn)定系數、脂肪指數和親疏水性等理化性質進行預測；利用protscale 在線網站分析該蛋白質的親/疏水性(https://web.expasy.org/protscale/)；利用SOPMA 在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預測Ml3GT1蛋白序列的二級結構；利用SWISS-MODEL在線網站(swissmodel.expasy.org)預測Ml3GT1蛋白的三級結構；使用DNAMAN 7.0軟件進行多序列比對，并使用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建在序列比對后，采用鄰接法建樹(neighbor-joining，NJ)，bootstrap重復1 000次獲得分支可信度。

1.5 Ml3GT1在花開放的不同時期與組織的表達分析

使用Light Cycler 480 Ⅱ (Roche)實時定量PCR儀進行基因表達相對定量分析。反應體系：模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，熒光染料BCG Qpcr Master Mix(2×) 10 μL和6.4 μL ddHO。通過兩步法進行qRT-PCR，擴增程序為95 ℃預變性30 s后運行40個循環(huán)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)，然后再運行(95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)。對反轉錄得到的cDNA分別進行5倍數梯度稀釋，以為內參基因(王寧杭等，2019)，每個樣品設置3個生物學重復。采用2計算目的基因的相對表達量。使用SigmaPlot 14.0軟件進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 Ml3GT1基因克隆及序列分析

紫玉蘭‘紅元寶’的RT-PCR結果顯示，擴增產物長1 863 bp(圖3)，將測序得到的序列通與轉錄組序列CL3388.Contig1進行比對，核苷酸序列相似性為99.84%。利用NCBI的ORF finder分析發(fā)現其最長開放閱讀框1 374 bp，編碼457個氨基酸，推導的氨基酸序列與轉錄組序列相似性為100%。將該基因命名為31，在GenBank登錄號為MW454862。

M. DL2000 DNA Marker; 1. Ml3GT1。圖 3 紫玉蘭‘紅元寶’Ml3GT1基因克隆Fig. 3 Gene cloning of Ml3GT1 from Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’

通過NCBI的CDD蛋白保守結構域數據庫，對紫玉蘭‘紅元寶’Ml3GT1蛋白保守區(qū)進行預測，結果表明，Ml3GT1具備尿嘧啶二磷酸-糖基轉移酶結構域(PLN02670)，UDP-葡萄糖醛酸基/葡萄糖基轉移酶保守域(UDPGT)，表明Ml3GT1屬于糖基轉移酶超家族，具有GT1_Gtf-like結構域，表明其屬于植物界中最大的家族1糖基轉移酶(GT1s)。按照蛋白質的三維折疊模式，糖基轉移酶可以大致劃分為GT-A、GT-B和GT-C三大類(Coutinho et al., 2003)，預測結果顯示，Ml3GT1為GT-B類的糖基轉移酶。

利用NCBI的在線Blastp功能，將Ml3GT1的氨基酸序列與其他植物的氨基酸序列進行在線比對，結果表明，Ml3GT1與沉水樟()3GT的相似性最高，達60.35%，與荷花()、楊梅()、海棗()、美洲葡萄()、蓖麻()等物種3GT的相似性較高，為49.00%～54.27%。

使用DNAMAN 7.0軟件將Ml3GT1推導的氨基酸序列與其他物種已發(fā)表的3GT氨基酸序列進行多序列比對。圖4結果顯示，Ml3GT1與擬南芥、蘋果、玉米、矮牽牛、葡萄、三花龍膽3GT蛋白的相似性分別為46.20%、44.20%、41.60%、38.40%、47.20%、41.80%，且Ml3GT1與其他3GT蛋白類似，其C端具備典型的由44個氨基酸組成的保守序列，即植物次生產物糖基轉移酶信號序列(PSPG box)，表明Ml3GT1具備植物糖基轉移酶特征，可能參與次生代謝產物的糖基化修飾。Ml3GT1的PSPG基序為WAPQTMVLGHVALGAFV THCGWNSVMESITAGVPMICRPFFGDQ，已有的研究表明，糖供體特異性部分由PSPG盒中的最后氨基酸殘基確定，當為Q時使用葡萄糖作為糖供體，當為H時則使用半乳糖(Kubo et al., 2004)，Ml3GT1的PSPG基序最后一個殘基為Q，表明Ml3GT可能屬于UDP-類黃酮糖基轉移酶，使用UDP-葡萄糖作為糖供體。

黑色陰影和其他陰影框分別表示相同和相似的氨基酸，下劃線表示PSPG保守基序。Black shaded and other shaded boxes show identical and similar amino acids, respectively, and the underline indicates the PSPG conservative motif.圖 4 推導的Ml3GT1氨基酸序列與其他物種3GT氨基酸序列比對Fig. 4 Multiple alignment of deduced Ml3GT1 amino acid sequences and 3GT amino acid sequences from other plants

2.2 Ml3GT1基因的生物信息學分析

通過ProtParam在線軟件分析Ml3GT1氨基酸的理化性質，結果表明：Ml3GT1編碼457個氨基酸，分子式為CHNOS，相對分子質量為49.37 kDa，理論等電點(pI)為6.04，小于7，說明其為酸性蛋白；其中帶負電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)數為50，帶正電荷氨基酸殘基(Arg + Lys)數為45，丙氨酸含量最多，占10.9%， 酪氨酸含量最少， 占0.9%； 該蛋白不穩(wěn)定系數為40.71，不穩(wěn)定系數大于40，表明其為不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性的負值表示親水性，正值表示疏水性，且正值越大表示疏水性越強，Ml3GT1總平均親水性為0.090，說明該蛋白是疏水性蛋白。

通過SOPMA在線網站對紫玉蘭‘紅元寶’3GT1蛋白的二級結構預測 (圖5)， 結構表明Ml3GT1蛋白中α-螺旋(39.39%)和無規(guī)則卷曲(38.29%)含量最多，而延伸鏈和β-轉角含量分別為16.85%和5.47%。將Ml3GT1序列提交到SWISS-MODEL在線網站預測編碼蛋白質的三維結構，3D預測結果顯示(圖6)，QMEAN分值在-4～0之間，越接近于0，表明待測蛋白與模板蛋白的匹配度越好，可信度越高，Ml3GT1的QMEAN分值為-0.88，表明Ml3GT1與模板蛋白UDP-葡萄糖類黃酮3-O糖基轉移酶(2c1x.1.A )匹配度較好，相似性較高，達52.67%，推測其可能為類黃酮3-O糖基轉移酶；GMQE可信度評分為0.83，介于0～1之間，且較接近1，說明以上述蛋白模板構建的模型質量較好；Ml3GT1具備GT-B家族典型的Rossmann折疊結構域，表明其為GT-B家族成員，這也與CDD的預測結果一致。

藍線. α-螺旋; 紫線. 無規(guī)則卷曲; 紅線. 延伸鏈; 綠線. β-轉角。Blue line. α-helix; Purple line. Random coil; Red line. Extended strand; Green line. β-turn.圖 5 Ml3GT1蛋白二級結構預測結果Fig. 5 Results of Ml3GT1 protein secondary structure prediction

圖 6 Ml3GT1蛋白三級結構預測結果Fig. 6 Results of Ml3GT1 protein tertiary structure prediction

2.3 Ml3GT1氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將紫玉蘭‘紅元寶’Ml3GT1與其他植物中已報道的參與類黃酮途徑的糖基轉移酶共同構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，圖7結果顯示，GTs分為5GTs、7GTs、3GTs進化分支，Ml3GT1與小蒼蘭Fh3GT1親緣關系較近聚為一支，屬于3GTs進化大支，該分支還有葡萄Vv3GT、草莓Fa3GT、矮牽牛Ph3GT、番薯Ib3GT，且與其他類黃酮糖基轉移酶5GTs、7GTs的親緣關系較遠，表明其可能與Fh3GT1功能類似，屬于3GT糖基轉移酶家族成員，參與類黃酮3-O的糖基化。

圖 7 Ml3GT1蛋白與其他植物的GT蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 7 Molecular phylogenetic tree of Ml3GT1 protein and GT proteins from other plants

2.4 Ml3GT1基因在花開放的不同時期與不同組織中的表達分析

以紫玉蘭‘紅元寶’花開放不同時期(S1～S5)以及老葉、嫩葉、根、莖等組織部位的cDNA為模板，探究31基因在紫玉蘭‘紅元寶’中的表達模式(圖8)。結果表明，隨著花的開放進程，31基因的表達量呈現先降低后升高的趨勢，其表達量在盛花期(S5)達到峰值。各組織部位的熒光定量結果顯示，31基因具有組織特異性，在花中的表達量最高，在老葉和嫩葉中有少量表達，而在根和莖中幾乎不表達，且其在花朵開放的各個時期中的表達量均高于其他組織部位。

圖 8 Ml3GT1在紫玉蘭‘紅元寶’花開放的不同時期以及組織部位的表達分析Fig. 8 Expression analysis of Ml3GT1 in different flowering periods and tissue parts of Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’

3 討論與結論

本文克隆得到紫玉蘭‘紅元寶’31基因，生物信息分析發(fā)現Ml3GT1序列具有植物次生產物糖基轉移酶信號序列——PSPG box，推測其可能參與次生代謝產物的糖基化修飾。GTs根據其催化位點的不同，可分為3-O-糖基轉移酶(3GTs)、5-O-糖基轉移酶(5GTs)、7-O-糖基轉移酶(7GTs)(王應麗等，2014)。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結果顯示Ml3GT1和小蒼蘭Fh3GT1親緣關系較近，聚為一支，進一步表明其可能和Fh3GT1功能類似，具有參與類黃酮3-O的糖基化修飾的功能(Sun et al., 2016)。

有研究結果表明，3具有花器官組織特異表達模式(王毅等，2017)。滇牡丹(王毅等，2017)和葡萄風信子(杜靈娟等，2017)中3基因在花青素苷大量積累的組織中高表達，而在少量積累和無花青素苷的組織中，3表達量極低甚至不表達。與前人研究結果一致，在本研究中，31基因在花中大量表達， 而在其他營養(yǎng)器官組織中幾乎不表達或者表達量很低，表明31可能參與花青素苷的生物合成。

3參與小蒼蘭和葡萄風信子花瓣中花青素苷的生物合成， 其表達量往往與花瓣中花青素苷的積累呈正相關(Sui et al., 2011；梁沛雯等，2019)。但是31基因表達模式與小蒼蘭和葡萄風信子不同，其表達量隨著花的開放呈現先下降后上升的趨勢，這可能與不同植物花瓣中花青素苷的糖苷類型不同有關。葡萄風信子花瓣中花青素苷糖苷類型均為葡萄糖苷(梁沛雯等，2019)，因此葡萄風信子花青素苷的積累與3基因表達量緊密相關。在紫玉蘭‘紅元寶’花瓣中，4種花青素苷C3位均發(fā)生蕓香糖基化修飾，其中Pn3Ru含量最高(約占總花青素苷含量的71%)(Wang et al., 2019)。由于花青素的C3位蕓香糖苷化修飾依次由3GT和3RT催化完成(Yamazaki et al., 2002)，紫玉蘭‘紅元寶’蕓香糖苷型花青素苷的合成不僅受3基因的調控，同時還與3基因的表達有關。由此表明31參與調控紫玉蘭‘紅元寶’的花青素苷的生物合成，但是該基因不是紫玉蘭‘紅元寶’花青素苷生物合成的限速酶基因。