張紅梅， 王旺田， 張 芮， 楊 科， 王寶強(qiáng)， 王翠玲

( 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730070 )

葡萄是世界最古老的落葉果樹之一，各地均有栽培，已成為重要的果樹經(jīng)濟(jì)作物，種植面積和產(chǎn)量居世界首位，是我國(guó)的重要果樹。中國(guó)北方的葡萄由于低溫凍害使得產(chǎn)量減少，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究葡萄的低溫響應(yīng)機(jī)理，提高葡萄對(duì)低溫的適應(yīng)性是十分必要的。

作為AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子群的一個(gè)亞科，基因在對(duì)非生物脅迫的耐受性中發(fā)揮核心作用，植物在低溫脅迫下表現(xiàn)出依賴的應(yīng)答通路。能夠與啟動(dòng)子中的核心片段(CCGAC)相結(jié)合從而調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄水平(Haake, 2002)。研究表明擬南芥1、2和3都位于Ⅳ染色體上，且緊密分布于短臂72.8 cM處，它們編碼與AP2/ERF家族密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控基因啟動(dòng)子中存在的CRT/DRE DNA調(diào)控元件結(jié)合。2基因能夠負(fù)調(diào)控1 和3，從而調(diào)控下游COR等抗寒基因的表達(dá)來提高植物抗寒性(Novillo et al., 2004；呂勝男等，2011；董亞茹等，2017)。而4則位于擬南芥的Ⅴ號(hào)染色體上，是唯一已知的基因參與脫落酸(ABA)依賴的信號(hào)通路(沙麗娜，2009)。這些研究成果說明轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的抗寒、抗旱和抗鹽堿等脅迫過程發(fā)揮著重要作用。研究表明，硅(Si)可以提高水稻(任學(xué)坤等，2007)、小麥(鄭世英等，2015)、高粱(劉朋等，2014)等植物的抗逆性，施加外源硅能夠提高低溫脅迫下葡萄葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率，緩解活性氧積累，增強(qiáng)耐寒性(鄭凱翔等，2019)。

目前，國(guó)內(nèi)基因主要集中于擬南芥(Michael et al., 2010)、大豆(Kidokoro et al., 2014)、玉米(Zhang et al., 2010)、番茄(Yuasa et al., 2014)等植物的研究，對(duì)葡萄中基因的抗寒作用等方面研究較少，尤其對(duì)4在外源硅與低溫協(xié)同作用下的表達(dá)未見報(bào)道。本研究對(duì)4基因編碼的蛋白進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，對(duì)葡萄幼苗進(jìn)行低溫和硅酸鉀處理，并對(duì)4基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，以期為4 基因的表達(dá)特性及其功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

利用NCBI數(shù)據(jù)庫獲取釀酒葡萄基因4(GenBank:DQ497624.1)。

1.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

1.2.1 一級(jí)結(jié)構(gòu) 通過Expasy進(jìn)行氨基酸殘基的數(shù)目和組成以及蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析。

1.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu) 利用SOPMA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；利用ProtScale預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性；利用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；利用SignalP 4.0預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽。

1.2.3 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 分別使用KinasePhos和NetOGlyc 4. 0預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)。

1.2.4 CBF4蛋白的細(xì)胞定位 使用PSORT Prediction 預(yù)測(cè)蛋白的細(xì)胞定位。

1.2.5 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 使用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu) 通過 SWISSMODEL對(duì)葡萄4基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。

1.3 同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過NCBI在線比對(duì)，找出與該蛋白同源性較高的其他植物的氨基酸序列，再利用MEGA X軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4 低溫脅迫對(duì)葡萄組織CBF4基因的熒光定量PCR分析

以釀酒葡萄試管苗貝達(dá)為試驗(yàn)材料，當(dāng)植株長(zhǎng)至5片葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗煉苗3 d后移入裝有1/2強(qiáng)度Haogland營(yíng)養(yǎng)液的水培盆(10 cm × 10 cm × 9 cm)，用泡沫板固定，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度25 ℃；濕度60%；光照強(qiáng)度5 000 lx)60 d，營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換1次。外源硅處理一周后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行常溫(25 ℃)及室內(nèi)模擬低溫(5 ℃)處理，各處理過程持續(xù)光照，對(duì)照為不加硅酸鉀的葡萄水培苗，且其他條件相同。低溫處理3 h和9 h后分別取各組幼苗的中部幼嫩葉片和根部，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以葡萄管家基因ubiquitin(AY684131.1)為內(nèi)參基因?qū)ζ咸讶~片和根部的4基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，根據(jù)TAKARA SYBR GREEN試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)液的配制，在定量PCR儀器上進(jìn)行試驗(yàn)，所有試樣重復(fù)3次，qRT-PCR生成的數(shù)據(jù)由定量分析軟件讀取，采用2法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，得到引物序列如下：4(正向：5′-AAGTGGGTATGCGAGGTAAG-3′，反向：5′-TTCTGAATGTCCTTGGCG-3′)，退火溫度為60 ℃；ubiquitin(正向：5′-GGCTTGGGAGATGGGAAAC-3′，反向：5′-TCCTACAATACCACCAAACATAGCA-3′)，退火溫度為60 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，運(yùn)用Duncan雙因素方差分析每個(gè)處理之間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 一級(jí)結(jié)構(gòu) 對(duì)CBF4蛋白的理化性質(zhì)分析得到葡萄CBF4蛋白的分子式為CHNOS；相對(duì)分子量為24.22 kD；理論等電點(diǎn)(pI)為5.42；不穩(wěn)定系數(shù)為51.89，總平均親水性為-0.621，表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白；脂肪系數(shù)為61.83，表明脂溶性比較差；正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)和負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)分別為27和34。

由表1可知，葡萄CBF4蛋白的20種氨基酸中，丙氨酸(Ala)含量最多(11.0%)，其次為精氨酸(Arg)(8.7%)與天冬氨酸(Asp)(8.3%)，氨基酸含量最小的是谷氨酸胺(Gln) (0.9%)。其中極性氨基酸占56.9%，非極性氨基酸占43.1%。

表 1 CBF4蛋白氨基酸組成分析Table 1 Analysis of amino acid compositions of CBF4 protein

2.1.2 二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖1)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無規(guī)則卷曲，其次是α-螺旋，其中所占比例分別為56.88%和27.52%，延伸鏈占比為13.76%，β-轉(zhuǎn)角占比最小(1.83%)。

圖 1 CBF4基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 1 Prediction results of secondary structure of CBF4 gene encoded protein

通過ProtScale分析CBF4蛋白質(zhì)親/疏水性(圖2)，預(yù)測(cè)結(jié)果說明整條多肽鏈沒有明顯的疏水區(qū)域。跨膜域的預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，CBF4蛋白是一個(gè)膜外蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)跨膜螺旋區(qū)域，這與沒有明顯疏水區(qū)域的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。利用SignalP 4.0在線工具預(yù)測(cè)分析信號(hào)肽，對(duì)于CBF4蛋白，總結(jié)分析得到預(yù)測(cè)的目的蛋白中不存在信號(hào)肽(圖4)。

圖 2 CBF4蛋白親疏水性分析Fig. 2 Analysis of affinity and hydrophobicity of CBF4 protein

圖 3 CBF4蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)果Fig. 3 Results of CBF4 protein transmembrane region

圖 4 CBF4蛋白信號(hào)肽結(jié)果Fig. 4 Results of CBF4 protein signal peptides

2.1.3 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 分別通過KinasePhos和NetOGlyc 4.0預(yù)測(cè)葡萄CBF4蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)，表明該蛋白含有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖5)和14個(gè)糖基化位點(diǎn)。

圖 5 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 5 Results of phosphorylation site prediction

2.1.4 CBF4蛋白的細(xì)胞定位 通過PSORT Prediction預(yù)測(cè)葡萄CBF4蛋白的細(xì)胞定位，結(jié)構(gòu)顯示該蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，因此可以推斷葡萄4基因主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.1.5 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 應(yīng)用NCBI中的 CDD 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)葡萄CBF4蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)結(jié)果(圖6)顯示葡萄CBF4蛋白的氨基酸序列的第57位至第115位為AP2超家族結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化上非常保守，該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍坠δ艿陌l(fā)揮非常重要。

圖 6 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 6 Results of domain prediction

2.1.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過同源建模方法構(gòu)建葡萄CBF4基因蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，結(jié)果顯示該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲折疊形成，其預(yù)測(cè)結(jié)果和二級(jí)結(jié)構(gòu)相一致。

圖 7 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig. 7 Prediction of tertiary structure of protein

2.2 CBF4蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建及多序列比對(duì)分析

將葡萄4基因的序列與同一物種及其他相近物種的序列進(jìn)行比對(duì)分析(圖8)，結(jié)果顯示釀酒葡萄與美洲葡萄同源性最高，為99.62%，與洋薊、短腳草、爬山虎、獼猴桃、白樺、花生、茶花、赤蘚和咖啡同源性分別為99.64%、92.78%、93.31%、85.71%、81.55%、81.23%、80.13%、78.51%和75.49%。

圖 8 多序列比對(duì)結(jié)果Fig. 8 Results of multiple sequence alignment

葡萄4基因與13種同物種和相近物種同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖9所示，釀酒葡萄與美洲葡萄的關(guān)系最密切，其次是河岸葡萄、山葡萄、沙地葡萄、洋薊、爬山虎、短腳草，與獼猴桃、茶花、白樺、花生、赤蘚、咖啡關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離也隨之增加。

圖 9 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果Fig. 9 Results of system evolution tree construction

2.3 葡萄CBF4基因在低溫脅迫下的表達(dá)

葡萄水培苗經(jīng)低溫脅迫處理后，4基因的表達(dá)結(jié)果顯示，低溫脅迫下葡萄葉片4基因隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，低溫脅迫3 h和9 h的上調(diào)幅度分別為對(duì)照的1.209倍、13.812倍；施加外源硅后常溫條件下4基因表達(dá)水平上調(diào)但差異不顯著，低溫條件下4基因表達(dá)水平下調(diào)(圖10：A)。在相同處理時(shí)間內(nèi)，低溫脅迫相對(duì)常溫比較，葡萄根部相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，3 h和9 h的下調(diào)幅度分別為對(duì)照的0.573倍和0.422倍，在常溫及低溫條件下，施硅處理較對(duì)照，4基因表達(dá)均上調(diào)(圖10：B)。

A. 葉片； B. 根部。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。A. Leaves; B. Roots. Different small letters indicate significant differences (P<0.05).圖 10 CBF4基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析Fig. 10 Expression analysis of CBF4 gene under low temperature stress

3 討論與結(jié)論

植物受到逆境脅迫會(huì)使植物在生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、物質(zhì)和能量代謝等方面發(fā)生一系列的變化。相比于傳統(tǒng)育種，利用生物信息學(xué)能夠快速準(zhǔn)確地探索植物抗逆基因資源，克隆相關(guān)基因并且利用相關(guān)基因提高植物抗逆性(賈翠翠，2015)。釀酒葡萄的種植會(huì)受到冷凍、干旱和高鹽的限制，低于-20 ℃的溫度會(huì)對(duì)葡萄樹造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，影響許多葡萄栽培種的產(chǎn)量，降低種植者收入，若將相關(guān)抗性基因克隆并轉(zhuǎn)入釀酒葡萄中，則可以顯著提高釀酒葡萄的產(chǎn)量。目前，對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的研究較為深入和廣泛，該轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用(Feng et al., 2011；Novillo et al., 2012)。研究發(fā)現(xiàn)1基因在馬鈴薯中超表達(dá)，能夠增強(qiáng)馬鈴薯的抗寒性(Pino et al., 2008)。將歐洲越桔中的1基因在擬南芥中超表達(dá)可增強(qiáng)其抗寒性(Oakenfull et al., 2013)。綜上所述，基因參與了植物體低溫脅迫的響應(yīng)，這與本研究結(jié)果保持一致。

通過分析可知，葡萄CBF4蛋白氨基酸組成中極性氨基酸占56.9%，非極性氨基酸占43.1%，CBF4蛋白無信號(hào)肽，是一個(gè)不穩(wěn)定的、親水的、脂溶性較差的膜外蛋白，與極性氨基酸所占比例一致。采用SOPMA及SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)CBF4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，表明該蛋白主要結(jié)構(gòu)單元是無規(guī)則卷曲，其次是α-螺旋，其中所占比例分別為56.88%和27.52%，該結(jié)果為研究4基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能提供了更多的信息。CBF4蛋白的多序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，釀酒葡萄與美洲葡萄的同源性最高、親緣關(guān)系最近，這種同源性一方面體現(xiàn)出各物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，另一方面也表明多個(gè)不同物種的4基因編碼產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)特征中比較穩(wěn)定，保守性較高。通過對(duì)葡萄CBF4蛋白的結(jié)構(gòu)域分析得到，葡萄4包含一個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，屬于AP2型DNA保守結(jié)合大家族中的CBF/DREB家族，具有該家族典型的特征，含有YRG元件和WLG基序，具有高度保守性，該結(jié)構(gòu)域?qū)幋a蛋白功能發(fā)揮著極其重要的作用，可調(diào)節(jié)植物抵御低溫和干旱相關(guān)基因的表達(dá)，推測(cè)4基因與植物逆境脅迫可能密切相關(guān)(韓志萍等，2006；邵文靖等，2020)，這說明4在葡萄的抗逆性中有著非常重要的作用，具有深入研究的價(jià)值。

低溫能夠誘導(dǎo)大多數(shù)植物體內(nèi)的基因表達(dá)，如山葡萄在寒冷、鹽度、脫落酸和水楊酸處理下，4轉(zhuǎn)錄本積累增加(Dong et al., 2013)。在葡萄樹中，4基因通常通過冷處理誘導(dǎo)，低溫條件下葡萄4轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)快速地增加，并且可以在葉片中保持很多天(Xiao et al., 2010)。本研究分析表明，發(fā)現(xiàn)4基因低溫脅迫3 h和9 h在葡萄葉片中表達(dá)水平顯著上調(diào)，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄激活因子與CRT/DRE調(diào)控元件特異性結(jié)合，激活啟動(dòng)子中目的基因表達(dá)，說明4基因可能參與了葡萄葉片響應(yīng)外界冷脅迫的信號(hào)途徑，因此推測(cè)出4基因可能參與了葡萄葉片低溫脅迫的響應(yīng)。低溫條件下施加硅酸鉀， 在葡萄葉片中的表達(dá)下調(diào)，而在葡萄根部表達(dá)上調(diào)，可能是因?yàn)槠咸迅繉?duì)低溫和硅酸鉀交互作用比較敏感，揭示了該基因在不同的葡萄組織中對(duì)硅酸鉀的響應(yīng)機(jī)制可能不同。目前，應(yīng)對(duì)低溫傷害的方法中使用外源物質(zhì)提高作物抗性更為簡(jiǎn)單，并且效果顯著，為了防止葡萄受到低溫傷害，應(yīng)該在根部追施硅肥，本研究進(jìn)一步為施用外源硅提高葡萄抗寒性提供理論依據(jù)。

本研究對(duì)4基因編碼的蛋白進(jìn)行全面的生物信息學(xué)及低溫和硅酸鉀響應(yīng)分析，結(jié)果顯示低溫脅迫后4基因在葡萄葉片中表達(dá)水平上調(diào)，說明4基因可能參與了葡萄葉片低溫脅迫的響應(yīng)。低溫條件下施加硅酸鉀后，4基因在不同的葡萄組織中對(duì)硅酸鉀的響應(yīng)不同，說明該基因表達(dá)具有組織特異性。本研究對(duì)深入了解4基因在葡萄非生物逆境脅迫中的功能，分析CBF4蛋白對(duì)植物抗逆的分子機(jī)制，以及深入探究外源硅對(duì)葡萄抗寒調(diào)節(jié)機(jī)理，為甘肅乃至北方釀酒葡萄抗寒栽培提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。