孫文軒

（上海華寶生物科技有限公司 上海 201821）

益生菌又稱為益生素，具有多種對人體健康有益的生理功能，主要包括抑制致病菌定植、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)腸道上皮屏障功能、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)腸道神經(jīng)系統(tǒng)的功能［1］。益生菌可以通過食用含有益生菌的相關(guān)保健品和益生菌發(fā)酵類產(chǎn)品獲得［2］。據(jù)相關(guān)規(guī)定，在益生菌保健品中的活菌數(shù)最少要達(dá)到1×106CFU/mL［3］，而益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用必須滿足有足夠數(shù)量活的益生菌在腸道內(nèi)定植這一前提條件［4］。但是，當(dāng)口服益生菌經(jīng)過消化道時，會在胃酸、膽鹽、消化酶等的影響下失活，導(dǎo)致益生菌在人體的活菌數(shù)量遠(yuǎn)低于在人體發(fā)揮生理作用的最小理論值［5］。大多數(shù)腸道益生菌為厭氧型微生物，儲存過程中與氧氣和水分接觸也其活性下降的原因之一。

益生菌微膠囊化是將細(xì)菌包埋在腸溶性壁材中，這些壁材在會腸道環(huán)境中降解，但是在胃部環(huán)境中能保持穩(wěn)定［6］，這既增強(qiáng)益生菌對胃部逆環(huán)境的抵抗能力，也可以控制這些細(xì)胞在腸道中釋放，顯著提高益生菌到達(dá)腸道靶位點(diǎn)的存活率。微囊化包埋還可以給益生菌提供一個厭氧環(huán)境，隔絕氧氣等外界不利因素，提高益生菌在貯存過程中的存活率。

常見的包埋方法有單層包埋法、雙層包埋法及三層包埋法［7］。葛得龍等人［8］以海藻酸鈉和N，O-殼聚糖為壁材，采用靜電液滴法，制備海藻酸鈉-羧甲基殼聚糖微膠囊包埋副干酪乳桿菌與游離的副干酪乳桿菌，微膠囊的胃腸消化的耐受性和耐儲藏性顯著提高。相對于未包埋的菌珠來說，單層包埋法雖然可以顯著提高菌體的消化存活率和儲存穩(wěn)定性，但是也存在干燥損失及包埋率低等不足。雙層包埋是針對單層包埋的不足進(jìn)行再設(shè)計，在微膠囊中加入凍干保護(hù)劑或益生元，以及在微囊表面進(jìn)行包衣，增強(qiáng)對菌種的保護(hù)力度［9］。張瑞采用內(nèi)源乳化法包埋鼠李糖桿菌，制備了“果膠+明膠/乳清分離蛋白雙層微膠囊”，包封率高達(dá)89.3%。雙層包埋雖然在一定程度上避免了菌的泄漏，提高干燥過程中的菌活，但是菌粉往往在未達(dá)到腸道就已經(jīng)被分解失活，無法實(shí)現(xiàn)微囊在腸道的控釋。三層包埋比雙層包埋有更強(qiáng)的耐胃酸性和堅固性。柳永［10］等人采用w-o-w 的三層包埋方式對干酪乳桿菌進(jìn)行包埋，第一層為包含卡拉膠和益生元的水凝膠，第二層為棕櫚油，第三層為海藻酸鈉、碳酸鈣及黃原膠。該方法制備的益生菌微膠囊具有良好的熱穩(wěn)定性及儲藏穩(wěn)定性，并且實(shí)現(xiàn)了益生菌的定性釋放，但是由于三層包埋工藝的復(fù)雜性及包埋層厚度難以控制，導(dǎo)致其難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。

滴丸技術(shù)可通過滴頭擠壓膠液將藥物包裹起來形成微膠囊，常用于脂溶性藥物或益生菌等的包埋，且具有裝量精確、恒定、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［11-12］。利用高精度多重同心圓滴丸技術(shù)，可以輕松實(shí)現(xiàn)三層包埋技術(shù)，制備三層包埋的益生菌菌珠。

目前，市面上大部分益生菌制劑及公開的益生菌微囊包埋技術(shù)始終有一個共性難題還未解決，就是產(chǎn)品在加工、儲藏和使用過程中活菌數(shù)下降和活性降低的問題，并且缺乏對益生菌胃腸道靶向遞送的關(guān)注［13］。益生菌微囊化包埋作為提高益生菌儲存穩(wěn)定性和胃酸耐受性及腸道靶向釋放細(xì)胞的方法，越來越受到人們的重視，成為當(dāng)今研究的熱門課題。

本研究擬采用同心滴丸技術(shù)，以復(fù)合凝膠為壁材，以固態(tài)脂質(zhì)為保護(hù)層，包裹包含益生菌的油性懸浮液，制備一種可以抵抗胃腸消化和耐存儲的益生菌菌珠，可以解決益生菌貯存和服用過程中活性、數(shù)量及效價損失嚴(yán)重的問題，并實(shí)現(xiàn)微膠囊的靶向釋放，具有廣泛的應(yīng)用價值。

1 實(shí)驗材料

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌購自中國金華，葵花籽購自當(dāng)?shù)爻校瑔?、雙甘油脂肪酸酯，棕櫚油購自益海嘉里，MRS瓊脂培養(yǎng)基、明膠、海藻酸鈉購自阿拉丁，胃蛋白酶、脂肪酶、胰酶、膽鹽購自Sigma，濃鹽酸、氯化鈣、氯化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

高精度同心滴丸機(jī)（滴頭自制）、厭氧培養(yǎng)箱（YQX-T）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（ZDX-35BI）、超凈工作臺（SW-CJ-1D）、恒溫振蕩器（SHZ-82）、渦旋振蕩器（XH-C）、數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋（HCJ-4A）、電子分析天平（AL204）。

2 實(shí)驗方法

2.1 益生菌珠的制備

2.1.1 高精度同心滴丸機(jī)

采用高精度同心滴丸機(jī)制備益生菌珠，滴丸機(jī)基本結(jié)構(gòu)如圖1 所示，其中，1、2、3 分別連接著盛放含有益生菌的液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)及膠液的儲料罐，為液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)、膠液的入口，由物料泵將各相物料泵入滴頭；結(jié)構(gòu)4為三相同心滴頭，由內(nèi)到外分別是液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)和膠液；結(jié)構(gòu)5 為冷卻循環(huán)系統(tǒng)，菌珠在該段冷卻成型；結(jié)構(gòu)6為冷卻液保護(hù)套。

圖1 三層同心滴丸設(shè)備滴頭示意圖

2.1.2 液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)及膠皮相的制備

先按比例稱取適量明膠、海藻酸鈉溶于滅菌水中，65℃水浴加熱攪拌3h至完全溶解后保溫除去氣泡，制備成膠液待用。將單、雙甘油脂肪酸酯作為分散劑按比例加入葵花籽油中，于60℃水浴下加熱攪拌30min至完全溶解，冷卻至37℃左右后加入1%（w/w）的副干酪乳桿菌凍干菌粉，經(jīng)分散機(jī)5000rpm分散3min，制備成均勻的液態(tài)菌油相保溫備用。將44℃棕櫚油在50℃水浴中攪拌溶解作為固態(tài)脂質(zhì)相50℃保溫待用。

2.1.3 益生菌珠的制備

將液態(tài)菌油、固態(tài)油相和膠皮相分別置于高精度同心滴丸設(shè)備的儲料罐中，調(diào)節(jié)機(jī)械參數(shù)：膠液罐溫度為65～70℃，固態(tài)脂質(zhì)罐溫度為45～50℃，液態(tài)菌油罐溫度30～35℃，滴頭溫度為50～60℃，制冷溫度為6～7℃，液態(tài)菌油泵、固態(tài)脂質(zhì)泵和膠液泵的轉(zhuǎn)速比為5：4：2。三相物料經(jīng)過如圖1 所示的三層同心圓滴頭流出后，由脈沖裝置快速切割成益生菌珠，再通過6～7℃冷卻循環(huán)系統(tǒng)對菌珠進(jìn)一步冷卻和定型，將成型的益生菌珠置于氯化鈣溶液中交聯(lián)30min后過濾，用蒸餾水清洗3次除去多余的鈣離子，即得到濕膠囊。將濕膠囊置于溫度為25℃、相對濕度為40%的恒溫恒濕環(huán)境下進(jìn)行干燥，即得三層包埋結(jié)構(gòu)的益生菌珠，從內(nèi)到外依次是液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層和膠皮外殼。

按照上述方法，分別制備分散有副干酪乳桿菌的液態(tài)油相的三層包埋益生菌珠和不含固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的雙層包埋益生菌珠。

2.2 益生菌珠尺寸的測量

觀察干燥微膠囊的形態(tài)并拍照，通過游標(biāo)卡尺測量100 個益生菌菌珠來評估微膠囊的平均尺寸、固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)殼層厚度和膠皮層厚度［14］。首先，菌珠測量外徑；然后，小心剝?nèi)ツz皮外衣，測量固態(tài)脂質(zhì)體保護(hù)殼層包裹的菌珠的直徑；最后，將剩下的部分平均切開，稱量其中液態(tài)油相的質(zhì)量，根據(jù)其密度，計算出芯液的體積及半徑。因此，固體脂質(zhì)體保護(hù)殼層厚度和膠皮膜層厚度的計算公式如下：

式中，Tg為外層膠皮相的厚度（mm）；Tsl為固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)殼的厚度（mm）；dext為益生菌菌珠的外徑（mm）；d為固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)殼包裹的菌珠的外徑（mm）；dint為益生菌菌珠的內(nèi)徑，即液態(tài)油相的直徑（mm）。

2.3 益生菌在加工過程中穩(wěn)定性

在菌珠制備過程中，高溫及水分等不良因素會導(dǎo)致益生菌失活。為了探究菌珠在加工過程中對益生菌的保護(hù)作用，分別從三層包埋和雙層包埋菌珠的液態(tài)油相及未經(jīng)過滴頭的分散有副干酪乳桿菌的液態(tài)油相中取樣，用含有5%吐溫-80 的生理鹽水連續(xù)稀釋，接種于MRS 瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下厭氧培養(yǎng)48h 計算菌落總數(shù)。

2.4 益生菌珠在體外模擬消化中的穩(wěn)定性

益生菌從口腔攝入后，經(jīng)過胃及小腸環(huán)境后在結(jié)腸定植并發(fā)揮作用。為了探究益生菌珠對模擬胃液及腸液消化的耐受性，本研究采用Minekus［15］的消化模型稍加改進(jìn)進(jìn)行體外模擬消化。

2.4.1 消化液的配置

模擬胃部消化液（SGF）的配置：取0.7mL 濃鹽酸，200mg 氯化鈉溶解并定溶于100m 蒸餾水中，并提前45min加入3.2mg/mL胃蛋白酶，于37℃加熱攪拌溶解。

模擬小腸消化（SIF）的配置：取10.94g 氯化鈉，1.835g一水合氯化鈣，溶解并定溶于100mL蒸餾水中。

2.4.2 模擬體外消化

分別取三層包埋、雙層包埋及液態(tài)油相菌液1g加入到15mL 模擬胃部消化液中，調(diào)節(jié)pH 值至2，在37℃、100r/min的條件下水浴震蕩消化2h后，取出胃部消化液，加入1.5mL 模擬小腸消化液、3.5mL 膽鹽（含189mg膽鹽，用5mM PBS緩沖溶液配置），調(diào)節(jié)pH值至7，加入2.5mL 脂肪酶（含60mg 脂肪酶，用5mM PBS 緩沖溶液配置）、2.5mL 胰酶（含60mg 胰酶，用5mM PBS緩沖溶液配置），在37℃、100r/min條件下消化2h，由于脂肪被脂肪酶水解成脂肪酸，而導(dǎo)致消化體系pH值下降，因此，每隔30min將體系pH值調(diào)節(jié)至7.0，分別從胃消化和腸消化結(jié)束后的益生菌菌珠中取樣，進(jìn)行梯度稀釋后，經(jīng)過MRS 瓊脂培養(yǎng)基在37℃厭氧培養(yǎng)48h 計算菌落總數(shù)，并對每個消化階段結(jié)束后的益生菌菌珠的形貌進(jìn)行觀察。

2.5 益生菌珠的儲藏穩(wěn)定性

分別將三層包埋和不含固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的雙層包埋菌珠置于4℃及室溫條件下儲存12 個月，每隔一段時間取樣培養(yǎng)，計算益生菌的活菌數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實(shí)驗重復(fù)3次，各組數(shù)據(jù)用SPSS 25軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05 作為差異作為著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，圖表用origin繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 益生菌珠的外觀

如圖2所示，菌珠為大小均勻的白色圓球，其中包含三層保護(hù)結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外分別是：負(fù)載益生菌的液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)體保護(hù)層及外層膠皮。固態(tài)脂質(zhì)及明膠和海藻酸鈉的雙網(wǎng)絡(luò)凝膠膠皮共同支撐起菌珠的球形結(jié)構(gòu)。菌珠的直徑尺寸如表1 所示，含有固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的三層包埋菌珠的平均直徑和液態(tài)油相芯液的平均直徑分別為（4.37±0.12）mm 和（2.63±0.09）mm 膠皮層、固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的平均厚度分別為0.2mm 和0.66mm。不含固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的雙層包埋益生菌珠的平均直徑和液態(tài)油相內(nèi)芯的平均直徑分別為（3.05±0.07）mm 和（2.57±0.06）mm，膠皮層的平均厚度為0.24mm，該菌珠尺寸適合吞服使用。

圖2 益生菌珠的外觀結(jié)構(gòu)

表1 益生菌珠的尺寸

3.2 益生菌在加工過程中的穩(wěn)定性

測定干燥后菌珠的益生菌活性，結(jié)果如圖3所示，包含固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的三層包埋菌珠的菌活顯著高于不含固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的雙層包埋菌珠，分別為（8.97±0.01）lgCFU/g 和（8.73±0.02）lgCFU/g，菌體存活率為（87.48±2.41）%和（50.39±2.86）%。菌珠制備過程中，液態(tài)油相芯液的溫度為30～37℃，固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層的溫度為45～50℃，外層膠皮的溫度為60～75℃。液態(tài)油相中的副干酪乳桿菌在與膠皮層直接接觸時因高溫而失活，在液態(tài)油相芯液與高溫膠皮相之間釋放較低溫的固態(tài)脂質(zhì)作為保護(hù)層，避免益生菌與膠皮直接接觸，顯著提高了益生菌的菌活。同時，固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層還可以阻擋菌珠浸泡氯化鈣溶液及干燥過程中水分進(jìn)入菌珠內(nèi)部，降低因水分導(dǎo)致的益生菌失活。

圖3 液態(tài)菌油和益生菌珠在干燥后活菌數(shù)

3.3 益生菌珠在體外模擬消化中的穩(wěn)定性

將負(fù)載有副干酪乳桿菌菌粉的液態(tài)油相芯液及菌珠經(jīng)過模擬胃液和模擬腸液的連續(xù)處理，測定它們在經(jīng)過模擬胃液和模擬腸液消化后的活菌數(shù)和存活率，結(jié)果如圖4和表2所示。經(jīng)過模擬胃液消化后，未經(jīng)包埋的液態(tài)菌油、三層包埋菌珠及雙層包埋菌珠的菌活分別降低為（7.26±0.08）lgCFU/g、（8.89±0.01）lgCFU/g和（8.51±0.03）lgCFU/g。副干酪乳桿菌的對環(huán)境敏感，液態(tài)菌油直接分散在pH=2的模擬消化液中，副干酪乳桿菌在胃酸和胃白酶的作用下基大量死亡［16］，其菌體存活率顯著低于兩組菌珠樣品。對比兩組菌珠經(jīng)過胃消化液后的菌體存活率發(fā)現(xiàn)，三層包埋菌珠在胃酸環(huán)境中的穩(wěn)定性顯著高于雙層包埋菌珠，存活率分別為（82.31±1.42）%和（60.26±4.04）%。菌珠在胃液中發(fā)生溶脹，膠皮表面產(chǎn)生小孔，胃酸滲透凝膠層，三層包埋菌珠由于固態(tài)脂質(zhì)隔絕了環(huán)境中的胃酸，為芯液中的益生菌提供了保護(hù)作用。

圖4 菌油和菌珠在模擬消化過程中的菌活

表2 益生菌在模擬消化過程中的存活率

模擬腸消化過程中，在消化酶的作用下，菌珠的膠皮被酶解，由于沒有固態(tài)脂質(zhì)的支撐，液態(tài)菌油直接分散在消化液中，副干酪乳桿菌在消化酶和膽鹽的作用下活性降低，小腸消化2h后菌活為（8.18±0.04）lgCFU/g，菌存活率為（28.12±2.43）%。與此相比，三層包埋菌珠的膠皮和部分固態(tài)脂質(zhì)保護(hù)層被酶解，但是在固態(tài)脂質(zhì)的支撐下還能保持球形包埋結(jié)構(gòu)，模擬腸消化結(jié)束后菌活為（8.68±0.03）lgCFU/g，菌存活率為（51.58±4.12）%，顯著提高了益生菌在模擬腸消化過程中的穩(wěn)定性。相比于采用凝膠直接包埋液態(tài)菌油的雙層包埋技術(shù)，在液態(tài)菌油和膠皮之間增加一層固態(tài)脂質(zhì)，可以保護(hù)液態(tài)油相中的益生菌抵抗部分部分胃酸、消化酶及膽鹽的損害，提高益生菌的在消化過程中的存活率。而且在固態(tài)脂質(zhì)中添加腸道粘附因子和益生元，還可以促進(jìn)益生菌在腸道的粘附和定植，實(shí)現(xiàn)益生菌的靶向釋放和結(jié)腸定植。

3.4 益生菌珠的儲藏穩(wěn)定性

將個菌珠分別置于4℃和常溫下儲藏12 個月，每隔3 個月測定菌珠的活菌數(shù)，結(jié)果如圖5 所示，菌體存活率如表3 所示。無論是在4℃，還是在室溫條件下，隨著儲藏時間的延長，兩種菌珠的菌活均顯著下降，但含有固體脂質(zhì)保護(hù)層的三層包埋菌珠的菌活普遍高于雙層包埋菌珠，在4℃儲藏12 個月后，菌活高達(dá)（8.78±0.02）lgCFU/g，室溫下儲藏12月后，菌活仍有（8.69±0.02）lgCFU/g。而僅由水凝膠包埋液態(tài)菌油的雙層包埋在4℃和室溫下儲藏12 個月后，菌活分別從（8.67±0.04）lgCFU/g 降 低 為（8.06±0.13）lgCFU/g 和（7.84±0.01）lgCFU/g，儲藏穩(wěn)定性顯著低于三層包埋的菌珠。因為液態(tài)油相、固態(tài)脂質(zhì)層及凝膠層的協(xié)同屏障作用，可以將益生菌與“水分”“氧氣”等外界不良環(huán)境因素隔絕開，顯著提高益生菌的儲藏穩(wěn)定性［17］。4℃儲藏的菌珠菌活普遍高于室溫下儲藏的菌活，低溫環(huán)境更有利于菌珠的儲藏。

表3 菌珠在儲藏過程中的菌體存活率

圖5 益生菌珠的儲藏穩(wěn)定性

4 結(jié)語

本研究采用高精度同心滴丸技術(shù)包埋副干酪乳桿菌，制備了一種o-o-w三層包埋的益生菌珠，菌珠從里到外分別是液態(tài)菌油、固態(tài)脂質(zhì)體保護(hù)層和膠皮相，干燥菌珠的平均直徑為（4.37±0.12）mm，膠皮層的平均厚度為0.20mm，固體脂質(zhì)體保護(hù)層的厚度0.66mm，液態(tài)油相內(nèi)芯的平均直徑為（2.63±0.09）mm，其活菌數(shù)為（8.97±0.01）lgCFU/g，顯著高于o-w 雙層包埋菌珠。在傳統(tǒng)的o-w 雙層包埋菌珠中增加固態(tài)脂質(zhì)層，可以顯著降低由于菌珠制備過程中高溫和水分導(dǎo)致的益生菌失活，并且提高益生菌在胃腸道消化及儲藏過程中的穩(wěn)定性，為解決益生菌不耐胃酸和儲藏穩(wěn)定性差的問題提供了一個新思路。