徐艷梅，韓彬，郝麗娟，高燕霞，張素平

(河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050200)

阿奇霉素為十五環(huán)含氮大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是新型紅霉素的最具代表的藥物之一[1-2]，由克羅地亞的普利瓦(Pliva)制藥公司在20 世紀(jì)70 年代末開發(fā)[3-5]，合成路線是以紅霉素A 原料，經(jīng)過肟化、貝克曼重排、還原和甲基化反應(yīng)得到最終產(chǎn)物[6]。

鹽酸羥胺是合成關(guān)鍵中間體——紅霉素A 肟的主要原料，未反應(yīng)完全的鹽酸羥胺有引入藥物的可能，屬于潛在雜質(zhì)。已報道鹽酸羥胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有遺傳毒性和致基因突變作用[7-9]，致突變機理是改變DNA 的胞嘧啶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA 復(fù)制時堿基配對錯誤而誘發(fā)基因突變。依據(jù)歐洲共同體藥物評審委員會(EMEA)、人用藥品委員會(CHMP)《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》和人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)的指導(dǎo)原則M7 《評估和控制藥物中DNA 反應(yīng)的(誘變的)雜質(zhì)以限制潛在的致癌風(fēng)險》與M7(R1)《評估和控制藥物中DNA 反應(yīng)性(致突變)雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險》的相關(guān)要求，應(yīng)對阿奇霉素原料中殘留的鹽酸羥胺進行測定，依據(jù)《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程技術(shù)指導(dǎo)原則》(CPH1-1)和《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》(CPH3-1)中描述：“與已知毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)，亦被認為是毒性雜質(zhì)”的規(guī)定，因此本方法仍然按照毒性物質(zhì)日允許暴露量為2 μg/d 限度進行控制。

然而鹽酸羥胺在紫外光區(qū)無特征吸收，較難進行測定。目前常用的檢測技術(shù)主要有借助氧化還原反應(yīng)原理的滴定法[10]及復(fù)雜衍生化操作的間接分光光度法[11-14]等，其專屬性不強，易受其它類似化合物干擾——尤其是具有相近性質(zhì)的雜環(huán)仲胺鹽，同時精密度和靈敏度較差，不適用于痕量羥胺的檢測。離子色譜法近年來在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用已日趨成熟，特別是在針對強極性、水溶性好、可電離的有機離子化合物分析方面表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢[15-17]。筆者建立了一種操作簡單、專屬性強、靈敏度高、重復(fù)性好的離子色譜法，用于阿奇霉素中痕量鹽酸羥胺殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：DIONEX ICS-5000 型，配備安培檢測器(ED)和雙泵系統(tǒng)(淋洗液單泵和柱后衍生AXP 泵)，美國賽默飛世爾科技公司。

電子天平：XS205 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多科技(瑞士)有限公司。

阿奇霉素原料藥樣品：批號分別為A20190503、A20190504、A20190505。

鹽酸羥胺對照品：批號為100496-200801，純度(質(zhì)量分數(shù))為100.0%，中國食品藥品檢定研究院。

甲基磺酸(MSA)：純度(質(zhì)量分數(shù))為99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

氫氧化鈉溶液：質(zhì)量分數(shù)為50%，美國賽默飛世爾科技公司。

實驗用水為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 溶液配制

鹽酸羥胺對照品儲備液：20 μg/mL，精密稱取鹽酸羥胺109.21 mg，置于50 mL 容量瓶中，用10 mmol/L MSA 溶解并定容，精密量取1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用10 mmol/L MSA 稀釋至標(biāo)線，搖勻。

鹽酸羥胺對照品溶液：0.2 μg/mL，取鹽酸羥胺對照品儲備液0.5 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。

阿奇霉素樣品溶液：取阿奇霉素原料藥0.25 g，精密稱定，精密加入5 mL 水，振搖30 s，過0.22 μm濾膜。

阿奇霉素樣品加標(biāo)溶液：取阿奇霉素樣品約0.25 g，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，用0.2 μg/mL 鹽酸羥胺對照品溶液溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

MSA 溶液：30 mmol/L，精密量取MSA 0.967 mL，精密加入500 mL 水。

1.3 色譜條件

色譜柱：IonPac CS16 陽離子交換分析柱(250 mm×4 mm，美國賽默飛世爾科技有限公司)，IonPac CG16 陽離子交換保護柱(50 mm×4 mm，美國賽默飛世爾科技有限公司)；柱溫：35 ℃；淋洗液：30 mmol/L MSA 溶液，等度洗脫，流量為0.8 mL/min；進樣體積：25 μL；衍生試劑：500 mmol/L NaOH 溶液，流量為0.2 mL/min；檢測器：電化學(xué)檢測器，電極材料為金電極，參比電極為pH-Ag/AgCl電極；檢測器溫度：30 ℃；電位波形：積分脈沖安培檢測，6 電位波形，安培電位波形表見表1。

表1 安培電位波形表

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液濃度的選擇

在離子色譜分析過程中，淋洗液的組成、濃度及流量等都對出峰情況具有較大影響。其中，淋洗液的濃度對離子的保留時間影響較大，淋洗液濃度越大，保留時間越短，因此需要對淋洗液濃度進行考察，以選擇較為合適的濃度。筆者對不同淋洗液濃度進行了考察，以色譜峰形、理論塔板數(shù)為指標(biāo)，考察了淋洗液濃度對檢測結(jié)果的影響。試驗結(jié)果表明，當(dāng)淋洗液濃度為20 mmol/L 時，色譜峰有較明顯前延；當(dāng)淋洗液濃度為30 mmol/L 和40 mmol/L 時峰形良好，故選擇淋洗液濃度為30 mmol/L。

2.2 淋洗液流量的選擇

淋洗液流量對于離子的保留時間也有較大影響，流量增大可縮短分析時間，但亦會影響色譜峰形，因此合適的淋洗液流量是進行分析不可缺少的前提。試驗考察了淋洗液流量分別為0.7、0.8、0.9 mL/min 時的色譜峰形。結(jié)果表明，當(dāng)流量為0.8 mL/min 時色譜峰形較好，因此選擇淋洗液流量為0.8 mL/min。

2.3 柱溫的選擇

柱溫對于色譜峰保留時間具有顯著影響，不同離子在柱溫變化時呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。為得到較好的色譜峰形及合適的保留時間，對柱溫進行了試驗考察，以色譜峰形、理論塔板數(shù)為指標(biāo)，分別考察比較了柱溫為25、35、45 ℃時的檢測結(jié)果，表明鹽酸羥胺的測定受柱溫影響不大，故選擇更易實現(xiàn)的35 ℃作為柱溫。

2.4 專屬性

以實驗用水作為空白溶液，在優(yōu)化的色譜條件下，分別分析空白溶液、鹽酸羥胺對照品溶液及阿奇霉素品加標(biāo)樣品溶液，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1～圖3。由圖1～圖3 可知，鹽酸羥胺色譜峰峰形較好，且樣品分析無干擾。

圖1 空白溶液色譜圖

圖2 阿奇霉素加標(biāo)樣品溶液色譜圖

圖3 鹽酸羥胺對照品溶液的色譜圖

2.5 線性關(guān)系

分別精密量取鹽酸羥胺對照品儲備溶液0.01、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 mL，分別置于7 只50 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，配制成鹽酸羥胺質(zhì)量濃度分別為0.004、0.04、0.2、0.4、1.2、2.0、4.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。精密量取上述溶液各25 μL，分別注入離子色譜儀，記錄色譜圖，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以鹽酸羥胺質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到回歸方程：y=28.523 7ρ-0.366 6，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸羥胺在0.004 2～4.2 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 定量限與檢出限

精密量取阿奇霉素對照品溶液逐級稀釋并測定，直至信噪比約10，即為定量限溶液。精密量取定量限溶液3 mL，置于10 mL 容量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，搖勻，即為檢出限溶液。分別取定量限溶液和檢出限溶液注入離子色譜儀，連續(xù)測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，羥胺的定量限和檢出限分別為0.207 ng/mL 和0.062 ng/mL。

2.7 加標(biāo)回收與精密度試驗

精密稱取阿奇霉素原料藥0.25 g，共9 份，置于5 mL 容量瓶中，分別精密加入鹽酸羥胺對照品儲備溶液25、50、75 μL 各3 份，加水振搖30 s，用水定容至標(biāo)線，過濾。精密量取上述溶液注入離子色譜儀，記錄色譜圖，測得量與加入量的比值即為回收率，結(jié)果列于表2。由表2 可知，鹽酸羥胺的回收率為94.50%～100.46%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%。說明本方法符合驗證要求，準(zhǔn)確度良好。

表2 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

取新鮮配制的鹽酸羥胺對照品溶液和阿奇霉素加標(biāo)溶液，于室溫放置0、1、2、3、4 h，精密量取不同放置時間的上述溶液注入離子色譜儀，記錄色譜圖，色譜峰面積測定結(jié)果見表3。由表3 可知，對照品溶液及阿奇霉素加標(biāo)樣品溶液放置4 h 時鹽酸羥胺色譜峰面積分別降低10.4%及10.1%左右，這提示鹽酸羥胺在水溶液中不穩(wěn)定，樣品溶液宜臨用新制。

表3 對照品與樣品溶液穩(wěn)定性試驗

2.9 強制破壞試驗

取阿奇霉素原料藥樣品，分別在酸、堿、加熱、光照和氧化條件下，按照表4 方法進行強制降解試驗，按照1.2 項下方法制備溶液，所得溶液注入離子色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖如圖4～圖8 所示。由圖4～圖8 可知，阿奇霉素降解產(chǎn)物對鹽酸羥胺的測定無干擾。

表4 破壞實驗方法

圖5 堿破壞試驗色譜圖

圖6 熱破壞試驗色譜圖

圖7 光破壞試驗色譜圖

圖8 氧化破壞試驗色譜圖

3 結(jié)語

建立了離子色譜-電化學(xué)法測定阿奇霉素中殘留的鹽酸羥胺的方法，通過調(diào)節(jié)淋洗液濃度及流量，獲得了最佳淋洗液條件，可對鹽酸羥胺進行準(zhǔn)確定量。該法具有良好的線性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，檢出限低。本方法具有較好的實用價值，對測定藥物中殘留的鹽酸羥胺具有一定的借鑒作用。