劉月程，田振華

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 250014； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250355)

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國常用中藥材，具有和解表里、疏肝、升陽等功效，其性微寒、味苦[1]?！吨袊幍洹?020 年版將傘形科植物柴胡(又稱北柴胡)或狹葉柴胡(又稱南柴胡)收錄為正品柴胡入藥?，F(xiàn)代研究表明，柴胡主要含皂苷、有機(jī)酸、黃酮、揮發(fā)油及甾醇類，柴胡皂苷為柴胡的主要有效成分。郭敏娜等[2]利用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-Q-TOF-MS)鑒定了柴胡中的21 種化合物。楊印軍等[3]利用UPLC-Q-TOF-MS 分析、比較了北柴胡、竹葉柴胡、藏柴胡和小葉黑柴胡化學(xué)成分。邢威等[4]應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS 法分析了柴胡-白芍藥對(duì)化學(xué)成分。超高效液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)具有靈敏度高、分辨率高、分離度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確的鑒定藥材化學(xué)成分。前述研究對(duì)柴胡的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析，但確認(rèn)的成分?jǐn)?shù)量相對(duì)較少。筆者采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 對(duì)柴胡進(jìn)行分析，并推導(dǎo)出其中化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，為柴胡的成分表征和質(zhì)量控制研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀：Thermo Fisher Ultimate 3000 型及Q Exactive 型，Xcalibur 3.0 工作站，美國賽默飛世爾科技公司。

數(shù)控超聲清洗器：KQ-250E 型，昆山市超聲儀器有限公司。

電子天平：CP225D 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

粉碎機(jī)：DFY-1000C 型，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

綠原酸、阿魏酸、異鼠李素、芹菜素對(duì)照品：純度均不小于98%，批號(hào)分別為PS2049-0100MG、PS0258-0050MG、PS0845-0020MG、PS1300-0100MG，成都普思生物科技股份有限公司。

甲醇：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙腈、甲酸：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

柴胡藥材樣品：批號(hào)為2112300202，產(chǎn)地為山西，亳州市滬譙藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心劉紅燕副教授鑒定為傘形科柴胡屬(Bupleuri Radix)的根。

實(shí)驗(yàn)用水：蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 溶液制備

1.2.1 柴胡樣品溶液

取柴胡藥材粉末約10 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇100 mL，以40 kHz 超聲20 min，放涼，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，得柴胡樣品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液

精密稱取綠原酸、阿魏酸、異鼠李素、芹菜素對(duì)照品適量，用甲醇溶解、定容，制得質(zhì)量濃度均為0.10 mg/mL 的單對(duì)照品溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色 譜 柱：ACQUITY UPLC?HSS T3 柱[100 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動(dòng)相：0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，流量為0.3 mL/min，梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～5 min 為0% B，5～40 min 為0%～100%B；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL。

1.3.2 質(zhì)譜儀

電噴霧離子源(ESI)；正、負(fù)離子模式掃描；鞘氣流量：13.5 L/min；輔助氣流量：3 L/min；噴霧電壓：3.5 kV(+)，3.0 kV(-)；毛細(xì)管溫度：350 ℃；輔助器加熱溫度：350 ℃；S-lens RF level：55；掃描模式：Full MS/dd-MS2(Full MS 分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500)；掃描范圍：80～1 200 Da；碰撞能：20、40、60 eV。

1.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

按照1.3 儀器工作條件分析后，用Thermo Xcalibar 4.3 軟件的Qual Browser 模塊計(jì)算出精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)實(shí)際測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量與理論相對(duì)分子質(zhì)量二者偏差小于5 ×10-6的原則[5]及同位素豐度比、氮規(guī)律，用Qual Browser 軟件擬合分子式，通過二級(jí)碎片離子推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)，再依據(jù)對(duì)照品和相關(guān)參考文獻(xiàn)及碎片離子信息進(jìn)一步推斷待測(cè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，最后以美國賽默飛世爾科技有限公司的Mass Frontier 7.0 軟件的碎片離子匹配(Fragments and Mechanisms)功能對(duì)化合物進(jìn)行驗(yàn)證。部分同分異構(gòu)體采用ChemDraw 18.0 軟件(美國CambridgeSoft 公司)的ClogP值判斷極性大小，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)保留時(shí)間先后，從而進(jìn)行有效區(qū)分[5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品處理

分別選擇50%甲醇-水、70%甲醇-水、甲醇作為提取溶劑超聲提取樣品。通過對(duì)樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)的提取，發(fā)現(xiàn)與水、70%甲醇-水相比，甲醇提取樣品的總離子流圖中有效成分峰更多，響應(yīng)值較高。因此選擇甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 洗脫溶劑與洗脫梯度

為促進(jìn)化學(xué)成分的電離，需在流動(dòng)相中加入適量甲酸，從而有助于提高離子響應(yīng)值[6]。分別選擇0.05%、0.1%、0.2%甲酸溶液作為溶劑，考察溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以上比例甲酸溶液對(duì)色譜峰形與響應(yīng)值沒有顯著影響，最終選擇0.05%甲酸溶液作為基礎(chǔ)流動(dòng)相，流動(dòng)相A 為0.05%甲酸水溶液，B 為0.05%甲酸乙腈溶液，分別選擇洗脫梯度為0～35 min、0%～100% B；35～40 min、100%B 進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)總離子流圖，發(fā)現(xiàn)在某些時(shí)間段內(nèi)色譜峰分離度較差，則適當(dāng)延長此段時(shí)間；在某些時(shí)間段內(nèi)出峰數(shù)量較少，則適當(dāng)縮短此段時(shí)間。最終優(yōu)化的流動(dòng)相洗脫梯度見1.3.1。

2.1.3 碰撞能

將碰撞能逐級(jí)分別設(shè)定為10、25、40 eV 和30、50、70 eV。根據(jù)獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)低碰撞能時(shí)碎片離子信息較少，故需要提高碰撞能；高碰撞能時(shí)分子離子峰強(qiáng)度減弱或幾乎沒有分子離子峰，需要降低碰撞能。最終確定碰撞能為20、40、60 eV。

2.2 柴胡化學(xué)成分鑒定結(jié)果

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 對(duì)柴胡甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析，得到正、負(fù)離子模式下柴胡樣品的總離子流色譜圖如圖1，對(duì)照品溶液的總離子流圖如圖2～圖5。根據(jù)1.4 數(shù)據(jù)分析方法，共鑒定出65 種化學(xué)成分，其中皂苷類32 種，黃酮類11 種，酸類18 種，其它類4 種，具體結(jié)果見表1。

表1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鑒定的柴胡中化學(xué)成分

續(xù)表1

圖1 柴胡樣品UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 總離子流圖

圖2 綠原酸對(duì)照品總離子流圖

圖3 阿魏酸對(duì)照品總離子流圖

圖4 異鼠李素對(duì)照品總離子流圖

圖5 芹菜素對(duì)照品總離子流圖

2.3 化合物質(zhì)譜解析

2.3.1 皂苷類化合物的鑒定

皂苷類成分是柴胡中的主要功效成分，皂苷類化合物含糖，易丟失母核上連接的葡萄糖或葡萄糖殘基、海藻糖基、H2O、CO2等中性碎片[7]?；衔?0 在ESI-模式總離子流圖下得到m/z925.515 50 [M-H]-，擬合分子式為C48H78O17，脫去一個(gè)海藻糖基(Fuc，146 Da)，得到m/z779.457 89[M-H-Fuc]-，脫去一個(gè)葡萄糖基(Glu，162 Da)，得到m/z617.405 33 [M-H-Fuc-Glu]-。m/z971.522 03[M+COOH]-為該化合物結(jié)合一個(gè)羧基。根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，符合柴胡皂苷c 的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為柴胡皂苷c。化合物33 在ESI-模式總離子流圖下得到m/z927.526 00 [M-H]-，擬合分子式為C48H80O17，脫去一個(gè)葡萄糖基，得到m/z765.480 04 [M-H-Glu]-，接著脫去一個(gè)海藻糖基，得到m/z619.421 94[M-H-Glu-Fuc]-。根據(jù)文獻(xiàn)[3]、[16]報(bào)道，符合柴胡皂苷f 的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為柴胡皂苷f，柴胡皂苷f 可能的裂解途徑及相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖6，具體信息見表1?；衔?6、39、45、53 在ESI-模式總離子流圖下均得到m/z779 [M-H]-的分子離子峰，擬合分子式為C42H68O13，脫去一個(gè)葡萄糖，得到m/z617[M-H-Glu]-，再脫去一個(gè)海藻糖基，得到m/z471[M-H-Glu-Fuc]-。m/z825 [M+COOH]-為該化合物結(jié)合一個(gè)羧基，根據(jù)文獻(xiàn)[2]、[3]報(bào)道，符合柴胡皂苷a 或同分異構(gòu)體的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為柴胡皂苷a 或同分異構(gòu)體。同時(shí)根據(jù)四者ClogP值比較，柴胡皂苷g 的ClogP值最高，因此化合物53 為柴胡皂苷g，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 的ClogP值相同，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)[2]、[3]、[16]、[18]報(bào)道，化合物36 為柴胡皂苷a，化合物39 為柴胡皂苷b2，化合物45 為柴胡皂苷d。柴胡皂苷a 可能的裂解途徑及相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖7，具體信息見表1。

圖6 負(fù)離子模式下柴胡皂苷f 可能的裂解途徑及二級(jí)質(zhì)譜圖

圖7 負(fù)離子模式下柴胡皂苷a 可能的裂解途徑及二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3.2 黃酮類化合物的鑒定

黃酮類化合物的質(zhì)譜特征較強(qiáng)，多發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)(RDA)，經(jīng)能量碰撞會(huì)失去H2O、CO2、CO、CHO 等一系列中性小分子[10]，易產(chǎn)生甲基、羧基、糖苷等碎片離子。以化合物14 為例，在ESI+模式總離子流圖下得到m/z611.159 73[M+H]+，擬合分子式為C27H30O16，脫去一個(gè)鼠李糖基(Rha，146 Da)，得到m/z465.102 45 [M+H-Rha]+，接著脫去一個(gè)葡萄糖基，得到m/z303.049 07[M+H-Rha-Glu]+，根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，符合蘆丁的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為蘆丁，蘆丁可能的裂解途徑及相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖8，具體信息見表1?；衔?9 在ESI-模式總離子流圖下得到m/z447.093 72 [M-H]-的分子離子峰，擬合分子式為C21H20O11，脫去一分子鼠李糖基，得到m/z301.035 10 [M-H-Rha]-，接著失去一個(gè)氫，得到m/z300.028 08 [M-H-Rha-H]-。根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，符合槲皮苷的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為槲皮苷?；衔?5 在ESI+模式總離子流圖下得到m/z303.049 29 [M+H]+，擬合分子式為C15H10O7，脫去一分子水，得到m/z285.038 67 [M+H-H2O]+，接著脫去一個(gè)CO，得到m/z257.043 55 [M+H-H2O-CO]+，再脫去一個(gè)CO，得到m/z229.049 01 [M+H-H2O-COCO]+。根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，符合槲皮素的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為槲皮素?；衔?1 在ESI-模式總離子流圖下得到m/z269.046 11 [M-H]-的分子離子峰，擬合分子式為C15H10O5，脫去一個(gè)CO2，得到m/z225.055 50[M-H-CO2]-，母離子C 環(huán)發(fā)生RDA 重排裂解，得到m/z151.054 40 [M-H-C8H6O]-。根據(jù)文獻(xiàn)[9]、[14]報(bào)道，符合芹菜素的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為芹菜素。

圖8 正離子模式下蘆丁可能的裂解途徑及二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3.3 氨基酸、有機(jī)酸等酸類化合物的鑒定

在正負(fù)離子模式下，共鑒定出4 種氨基酸類、14 種有機(jī)酸類化合物。以化合物6 為例，在ESI+模式總離子流圖下得到m/z182.080 89 [M+H]+，擬合分子式為C9H11NO3，以此為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，脫去一個(gè)羥基，得到m/z165.054 28[M+H-OH]+，母離子脫去一個(gè)NO2，重排裂解得到m/z136.075 45 [M+H-NO2]+。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，符合酪氨酸的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為酪氨酸。

有機(jī)酸的脂肪酸類以化合物5 為例，在ESI-模式總離子流圖下得到m/z191.019 17 [M-H]-的分子離子峰，擬合分子式為C6H8O7，以此為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，脫去一個(gè)H2O，得到m/z173.008 59[M-H-H2O]-，脫 去CH4O4，得 到m/z111.007 38[M-H-CH4O4]-，母離子脫去兩個(gè)羧基，得到m/z101.023 00 [M-H-2COOH]-。根據(jù)文獻(xiàn)[5]、[11]報(bào)道，符合檸檬酸的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為檸檬酸。

有機(jī)酸的酚酸類化合物以化合物9 為例，在ESI-模式總離子流圖下得到m/z153.018 39 [M-H]-的分子離子峰，擬合分子式為C7H6O4，以此為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，脫去一個(gè)CO2經(jīng)重排裂解，得到m/z109.028 17 [M-H-CO2]-，再脫去一個(gè)氫，得到m/z108.020 19 [M-H-CO2-H]-。通過與對(duì)照品比對(duì)和文獻(xiàn)[5]、[9]報(bào)道，符合原兒茶酸的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為原兒茶酸。

2.3.4 其它化合物的鑒定

在正負(fù)離子模式下，共鑒定出4 種其它類化合物?；衔?3 在ESI+模式總離子流圖下得到m/z193.049 09 [M+H]+的分子離子峰，擬合分子式為C10H8O4，以此為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，脫去一個(gè)甲基，得到m/z178.024 95 [M+H-CH3]+，脫去一個(gè)CO，得到m/z165.054 33 [M+H-CO]+，接著脫去一個(gè)CO，得到m/z137.059 17 [M+H-CO-CO]+，母離子脫去C2H4O2，經(jīng)重排得到m/z133.064 64[M+H-C2H4O2]+。根據(jù)文獻(xiàn)[5]、[13]、[15]報(bào)道，符合東莨菪內(nèi)酯的裂解規(guī)律，與Mass Frontier 中匹配二級(jí)碎片離子一致，鑒定其為東莨菪內(nèi)酯。

3 結(jié)語

柴胡作為傳統(tǒng)中藥材，現(xiàn)代藥理研究表明柴胡具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能，這些藥效作用源于其主要成分如皂苷類、黃酮類等成分等。筆者采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)快速鑒定柴胡的化學(xué)成分，通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照、文獻(xiàn)檢索、Mass Frontier 驗(yàn)證、ClogP值對(duì)比，共鑒定出65 種成分，其中4 種為首次從該植物發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分，如壬二酸、3，5，6-三羥基-4’，7-二甲氧基黃酮、13-羥基-9，11-十八二烯酸、甲氧基-十五烷酸。本研究可快速鑒別柴胡化學(xué)成分，從而為質(zhì)量控制方法的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但不同皂苷的結(jié)合部位及同分異構(gòu)體通過質(zhì)譜尚不能完全確定結(jié)構(gòu)，有待于進(jìn)一步研究。