劉 毅,孔德艷,王飛名,張安寧,劉國(guó)蘭,余新橋,羅利軍

(上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心,上海 201106)

高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)是作物育種最基本和最重要的目標(biāo)。在水資源日益短缺、耕地面積減少、氣候變化帶來(lái)的非生物和生物脅迫愈加嚴(yán)重的不利影響下,提高和穩(wěn)定作物產(chǎn)量是育種面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年來(lái),包括持久的抗病蟲害能力、非生物脅迫耐受性以及養(yǎng)分和水分利用效率等與產(chǎn)量穩(wěn)定性和可持續(xù)性相關(guān)性狀的改良越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注[1-3]。

然而,上述性狀大多為數(shù)量性狀,在DNA分子標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)之前,快速發(fā)現(xiàn)微效多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)是極其困難的[4]。分子標(biāo)記技術(shù)促進(jìn)了作物遺傳學(xué)的發(fā)展,DNA標(biāo)記能夠檢測(cè)潛在性狀基因的等位變異,為作物遺傳育種提供了便利。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection,MAS),是指利用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或共分離的功能標(biāo)記,對(duì)個(gè)體的目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè),從而在群體中篩選獲得期望的個(gè)體,是一種將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物育種的輔助選擇手段,可以大大提高育種效率和精度[5]。全基因組選擇是指在利用分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇的同時(shí),也利用分布于全基因組的與目標(biāo)基因非連鎖的分子標(biāo)記對(duì)遺傳背景進(jìn)行選擇,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因和遺傳背景的共同選擇,達(dá)到定向改良目標(biāo)性狀目的[6]。分子標(biāo)記在質(zhì)量性狀和主效QTL,如抗病蟲基因滲入、聚合等方面展現(xiàn)出很高的效率。節(jié)水抗旱稻是通過水旱稻雜交,結(jié)合在目標(biāo)環(huán)境強(qiáng)脅迫條件下篩選培育的既具有水稻的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì),又具有旱稻的節(jié)水抗旱特性的一種新的栽培稻類型,在節(jié)水抗旱的遺傳背景下,利用分子標(biāo)記輔助技術(shù),增添其他有價(jià)值綠色性狀的加值育種,為選育少打農(nóng)藥、少施化肥、節(jié)水抗旱、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的綠色超級(jí)稻提供了可行、有效的途徑。本研究主要介紹利用分子標(biāo)記前景和背景選擇技術(shù)進(jìn)行節(jié)水抗旱稻加值育種的研究進(jìn)展,總結(jié)加值育種過程中的經(jīng)驗(yàn),并對(duì)今后需要關(guān)注的關(guān)鍵性狀和方向進(jìn)行展望。

1 分子標(biāo)記

DNA分子標(biāo)記是揭示突變∕變異的DNA片段,可用于檢測(cè)群體或基因庫(kù)中特定DNA序列的不同基因類型或等位基因之間的多態(tài)性。在分子標(biāo)記輔助選擇育種中,有效使用的理想DNA標(biāo)記應(yīng)具備以下標(biāo)準(zhǔn):(1)多態(tài)性強(qiáng);(2)在全基因組均勻分布(不是在特定區(qū)域集中);(3)共顯性(可以區(qū)分純合和雜合);(4)不同等位基因的特征容易辨別;(5)單拷貝;(6)使用成本低,便于分析和高通量自動(dòng)化。目前作物遺傳育種中應(yīng)用比較廣泛的是基于PCR檢測(cè)的SSR(Simple sequence repeat)和SNP(Simple nucleotide polymorphisms)標(biāo)記[7-8]。

2 分子標(biāo)記輔助回交育種

分子標(biāo)記輔助回交育種(Marker-assisted backcrossing,MABC)是MAS主要應(yīng)用之一,目的是在不改變受體遺傳背景的情況下,將一個(gè)或多個(gè)有利基因從一個(gè)品系(供體)導(dǎo)入到另一個(gè)品系(受體)。主要選擇過程為:(1)選擇一個(gè)綜合表現(xiàn)較好、部分性狀待改良的親本作為受體,攜帶目標(biāo)基因的親本作為供體,受體和供體雜交;(2)利用目標(biāo)基因的分子標(biāo)記檢測(cè)雜合基因型F1代,并與輪回親本回交;(3)在BC1F1群體繼續(xù)利用分子標(biāo)記檢測(cè),選擇目標(biāo)基因雜合的單株與輪回親本回交,根據(jù)實(shí)際需求可連續(xù)回交3—4代。(4)在BC4F2群體中,利用分子標(biāo)記篩選目標(biāo)基因純合單株,自交收種進(jìn)行下一步評(píng)價(jià)。

分子標(biāo)記輔助回交的效率取決于許多因素,包括每個(gè)回交世代群體的大小、分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離以及使用標(biāo)記的數(shù)量等,傳統(tǒng)回交育種恢復(fù)到輪回親本99%的遺傳背景可能需要6—8代,結(jié)合分子標(biāo)記的前景選擇、重組選擇、背景選擇,標(biāo)記輔助回交育種僅需要3—4代,可以極大加速回交計(jì)劃[9-10]。

2.1 前景選擇

前景選擇是基于分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果,選擇攜帶供體目標(biāo)基因的個(gè)體,以確?；蛟陔s交和回交過程不會(huì)丟失,并且在自交階段以純合的形式固定下來(lái)。前景選擇最早由Tanksley等[11]提出,可以在作物苗期階段進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè),以便選擇最合適的單株進(jìn)行回交,對(duì)表型篩選過程費(fèi)力或耗時(shí)的性狀特別有用。

2.2 重組選擇

重組選擇的目的是減少含有目標(biāo)基因的供體基因組片段的大小。在回交過程中,與其他染色體相比,攜帶目標(biāo)基因的染色體上的輪回親本基因組恢復(fù)得更慢,因?yàn)楹茈y打破與目標(biāo)基因連鎖的供體基因組片段。特別是當(dāng)這些連鎖區(qū)段存在控制不良農(nóng)藝性狀的基因時(shí),會(huì)帶來(lái)一些連鎖累贅的問題。需要選擇使用位于目標(biāo)基因兩側(cè)的標(biāo)記,在至少兩個(gè)回交世代檢測(cè)重組的發(fā)生,最終獲得在兩個(gè)側(cè)翼標(biāo)記上是受體等位基因,而在目標(biāo)基因座上具有供體等位基因的個(gè)體[26]。

2.3 背景選擇

背景選擇是借助標(biāo)記信息對(duì)受體的遺傳背景進(jìn)行選擇,以加快受體遺傳背景的恢復(fù)速度。在背景選擇中所用到的標(biāo)記是與目標(biāo)基因不連鎖的,除目標(biāo)基因外,其他所有標(biāo)記盡可能選擇受體親本的基因型,受體基因組恢復(fù)的進(jìn)展取決于所用標(biāo)記數(shù)量,標(biāo)記數(shù)量越多,恢復(fù)的速度越快,但是需要更大的群體規(guī)模和更多的基因分型[8]。

近年來(lái),利用水稻抗病蟲和米質(zhì)相關(guān)的前景選擇標(biāo)記(表1),筆者團(tuán)隊(duì)以節(jié)水抗旱稻主要親本為受體,以攜帶不同抗性基因的種質(zhì)資源為供體,通過分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種相結(jié)合的手段,創(chuàng)制了一批富含綠色性狀的新種質(zhì)[27]。安正帥等[28]利用分子標(biāo)記輔助回交育種的方式,將稻瘟病抗性基因(Pi1,Pi2和Pi9)導(dǎo)入節(jié)水抗旱稻保持系滬旱1B和恢復(fù)系旱恢3號(hào)中,稻瘟病抗性鑒定結(jié)果表明,攜帶抗性基因的改良株系抗病性顯著高于其輪回親本。劉毅等[29]利用白葉枯病抗性基因Xa23來(lái)改良節(jié)水抗旱稻親本滬旱1B的抗性,獲得了白葉枯病抗性顯著提高的改良保持系及其不育系。張安寧等[30]將褐飛虱抗性基因Bph6、Bph9、Bph14和Bph15單獨(dú)或聚合的方式導(dǎo)入到節(jié)水抗旱稻親本旱恢3號(hào)中,獲得了一系列含有1—4個(gè)褐飛虱抗性基因的改良株系,并對(duì)這些改良株系進(jìn)行效應(yīng)評(píng)價(jià),結(jié)果表明:多基因聚合改良株系抗性優(yōu)于單基因改良系,Bph9的褐飛虱抗性最強(qiáng)。通過分子標(biāo)記輔助選擇、常規(guī)雜交結(jié)合在目標(biāo)環(huán)境高強(qiáng)度脅迫篩選,Liu等[31]將廣譜抗稻瘟病基因Pi9、Pi54和Pi5導(dǎo)入到節(jié)水抗旱兩系不育系滬旱1S中,獲得一個(gè)新的節(jié)水抗旱稻光溫敏核不育系滬旱74S,14個(gè)稻瘟病菌的人工接種鑒定表明:滬旱74S抗性頻率為85.7%,在田間自然誘發(fā)條件下,滬旱74S及其雜交組合對(duì)苗瘟和穗頸瘟也表現(xiàn)出較好的抗性。Liu等[15]根據(jù)軟米基因Wxhp基因第4外顯子第77位堿基A∕G的SNP突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)開發(fā)了特異引物,可以準(zhǔn)確進(jìn)行基因型鑒定,利用軟米基因Wxhp可在改良南方秈稻品種食味品質(zhì)方面發(fā)揮重要作用。

表1 抗性基因前景選擇標(biāo)記Table 1 Foreground selection markers for resistance genes

3 全基因組分子標(biāo)記背景選擇育種

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)成本的降低,在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行背景選擇成為可能。通過基因組測(cè)序,可以獲得大量的SNP標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的高密度覆蓋,顯著提高選擇的準(zhǔn)確性,在全基因組選擇育種中具有廣泛的應(yīng)用前景[32]。Wing等[33]提出利用基因組育種技術(shù)培育綠色超級(jí)稻的策略。基因組育種包括兩個(gè)組成部分:基因組設(shè)計(jì)和全基因組選擇?；蚪M設(shè)計(jì)是以特定的優(yōu)良品種為受體或底盤親本,設(shè)計(jì)在目標(biāo)區(qū)域種植所需要的性狀以及這些性狀涉及到的基因∕標(biāo)記,然后收集包含這些目標(biāo)基因的種質(zhì)資源作為供體,確定組裝這些基因并將其導(dǎo)入底盤品種中的技術(shù)路線。全基因組選擇包括基因分型平臺(tái)和基因特異性選擇系統(tǒng),分別對(duì)目標(biāo)基因和基因組背景進(jìn)行選擇?；蚍中推脚_(tái)采用的是育種芯片,利用大規(guī)模重測(cè)序項(xiàng)目和水稻功能基因組研究成果,已經(jīng)開發(fā)設(shè)計(jì)制作了3款水稻SNP基因芯片(RICE6K、RICE60K、RICE90K),分別有4 500個(gè)、4.3萬(wàn)個(gè)、8.5萬(wàn)個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)目[34-36]。基于對(duì)來(lái)自全球89個(gè)國(guó)家和地區(qū)的3 024份水稻樣品進(jìn)行全基因組重測(cè)序的信息,華智生物技術(shù)有限公司與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院合作開發(fā)了水稻56 K高密度SNP芯片,包含約5.6萬(wàn)個(gè)SNP標(biāo)記,其中4 700多個(gè)SNP標(biāo)記與已知的2 300多個(gè)水稻功能基因緊密連鎖。隨著基因型檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,基于靶向測(cè)序基因型檢測(cè)的液相芯片技術(shù)更加靈活,成本更低,同一套標(biāo)記可以通過控制測(cè)序深度,應(yīng)對(duì)不同標(biāo)記密度的檢測(cè)要求[37]。基因特異性選擇系統(tǒng)包括選擇目標(biāo)基因的功能標(biāo)記和每個(gè)目標(biāo)基因兩個(gè)側(cè)翼用來(lái)檢測(cè)供體和受體基因組之間重組的DNA標(biāo)記,便于選擇目標(biāo)基因已被精確導(dǎo)入的品系。

種植多系品種可以提高作物群體的遺傳多樣性,是一種控制病蟲害的生態(tài)學(xué)方法。Zhu等[38]提出將具有相似背景的抗病(80%—90%)和感病(10%—20%)品種混合種植可有效減少稻瘟病新生理小種的形成,制約稻瘟病菌的快速變異,延長(zhǎng)水稻抗病品種的使用年限。利用分子標(biāo)記前景和全基因組背景策略進(jìn)行多系品種選育有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):一是提高了效率,純合改良系在3年基本可以獲得,而傳統(tǒng)常規(guī)育種方法需要5—6年;二是除了能將抗性基因準(zhǔn)確導(dǎo)入受體親本,減少遺傳累贅,獲得遺傳背景基本一致、農(nóng)藝性狀相似、攜帶不同抗性基因的近等基因系,為作物獲得持久抗性提供了一種思路。此外,不同性狀的基因可以很容易地通過一個(gè)雜交組合成一個(gè)同質(zhì)的遺傳背景。因此,可以通過將多個(gè)基因整合到一個(gè)單獨(dú)的品系中來(lái)培育多抗綠色超級(jí)稻品種[33]。節(jié)水抗旱稻雜交組合‘旱優(yōu)73’是目前長(zhǎng)三角推廣面積最大的品種,由不育系滬旱7A和恢復(fù)系旱恢3號(hào)選育而來(lái)[39]。筆者團(tuán)隊(duì)采用全基因組背景選擇育種的方法,將不同稻瘟病抗性基因(Pi2、Pi9、Pigm)、白葉枯病抗性基因(xa5、Xa21、Xa23)、褐飛虱抗性基因(Bph6、Bph9、Bph14)分別導(dǎo)入到恢復(fù)系旱恢3號(hào)中,在雜交和回交過程利用目標(biāo)基因的分子標(biāo)記進(jìn)行前景選擇;在BC1F1和BC2F1個(gè)體中,利用SNP芯片進(jìn)行全基因組背景分析,篩選輪回親本背景回復(fù)率最高的個(gè)體進(jìn)行回交;在BC3F1個(gè)體中,利用48對(duì)SSR標(biāo)記[40]進(jìn)行背景檢測(cè),選擇48對(duì)SSR標(biāo)記差異最小的單株自交收種;在BC3F2群體中,利用目標(biāo)基因分子標(biāo)記和差異SSR標(biāo)記作為前景選擇標(biāo)記,篩選目標(biāo)基因純合且差異SSR標(biāo)記與輪回親本一致的個(gè)體自交收種,進(jìn)行下一步抗旱性和農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)。在構(gòu)建單個(gè)抗性基因的等基因系時(shí),在不同的回交世代,可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)目標(biāo)基因的個(gè)體雜交進(jìn)行不同抗性基因的聚合(圖1)。經(jīng)過這樣的選擇方式,獲得了平均遺傳背景與旱恢3號(hào)相似性為97.5%的近等基因系和三基因聚合系,這些改良系及與不育系滬旱7A配制的組合農(nóng)藝性狀基本一致,為提高節(jié)水抗旱稻品種抗病蟲能力,延長(zhǎng)品種生命周期提供了可行的技術(shù)手段。

圖1 分子標(biāo)記前景和背景選擇進(jìn)行加值育種Fig.1 Molecular marker foreground and background selection for value-added breeding

4 基于分子標(biāo)記輔助選擇的節(jié)水抗旱稻加值育種

節(jié)水抗旱是綠色超級(jí)稻重要的性狀之一,然而,植物的抗旱性是極其復(fù)雜的,受到多基因控制和環(huán)境影響。盡管尋找抗旱基因并將其應(yīng)用于育種實(shí)踐一直是一個(gè)熱門的研究課題,但到目前為止,利用這些基因培育抗旱品種并將其應(yīng)用于實(shí)踐的報(bào)道還很少。實(shí)際上,正如Pennisi[41]指出,在基因組學(xué)揭示的大量候選抗旱基因中,幾乎在田間旱脅迫條件下很難有表型。這是因?yàn)榭购敌允且粋€(gè)復(fù)雜的性狀,受到數(shù)千個(gè)抗旱基因及其與環(huán)境的交互作用的影響[42-43]?？购档男纬墒嵌鄠€(gè)抗旱基因相互作用的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果,而不是單個(gè)抗旱基因的結(jié)果。為此,許多研究者提出了一種聚合不同抗旱機(jī)制基因的育種策略[44-45],節(jié)水抗旱稻即通過常規(guī)育種方法導(dǎo)入旱稻的避旱基因和水稻的耐旱基因而選育而成。經(jīng)過20多年的努力,目前已經(jīng)成功培育了20多個(gè)節(jié)水抗旱稻新品種,這些新品種在我國(guó)旱地和灌溉生態(tài)系統(tǒng)中都有種植,部分在亞洲和非洲各國(guó)示范種植表現(xiàn)良好,在中國(guó)累計(jì)推廣面積超過百萬(wàn)公頃[46]。筆者團(tuán)隊(duì)利用分子標(biāo)記輔助選擇,將抗病蟲基因?qū)氲焦?jié)水抗旱稻親本中,獲得了抗性顯著提高的改良親本,表明以節(jié)水抗旱稻為底盤品種,利用分子標(biāo)記前景選擇和背景選擇,是選育綠色超級(jí)稻一種有效的途徑。

Wei等[47-48]研究表明,常規(guī)雜交結(jié)合在目標(biāo)環(huán)境高強(qiáng)度脅迫選擇下,大量的干旱適應(yīng)和抗旱轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因被保留并聚集在育種后代的基因組中。依據(jù)這個(gè)育種策略,筆者利用分子標(biāo)記前景選擇將3個(gè)抗稻瘟病基因通過雜交的方式導(dǎo)入節(jié)水抗旱稻親本滬旱1S中,在確定3個(gè)抗性基因純合的前提下,進(jìn)行避旱性、耐旱性、產(chǎn)量及品質(zhì)性狀的交替篩選,新育的光溫敏核不育系滬旱74S抗旱性與滬旱1S一致,抗病性顯著提高,驗(yàn)證了分子標(biāo)記結(jié)合逆境脅迫選擇的高效性[31]。在育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),在同類抗性基因聚合中,存在明顯的加性效應(yīng),多基因聚合的改良系抗性水平高于單基因?qū)胂?對(duì)稻瘟病抗性基因而言,Pi2、Pi9、Pi25、Pigm在多個(gè)節(jié)水抗旱稻親本(秈或者粳)遺傳背景下均表現(xiàn)出廣譜的抗性;對(duì)于白葉枯病抗性基因,抗性效應(yīng)是xa5＞Xa23＞Xa21,xa5基因兼具抗細(xì)菌性條斑病,但由于是隱性抗性基因,適合在常規(guī)稻抗白葉枯病改良中利用[49-50]?？购诛w虱單基因的抗性效應(yīng)是Bph9＞Bph6＞Bph15＞Bph14,但聚合兩個(gè)抗性基因以上的改良系的結(jié)實(shí)率低于受體親本[30]。為了減少遺傳累贅,利用全基因組選擇恢復(fù)受體遺傳背景,加快回交育種進(jìn)程,獲得了3個(gè)不同類型抗病蟲基因(Pi9、Bph6和Xa23)聚合的改良系,背景回復(fù)率高達(dá)97.5%,綜合農(nóng)藝性狀與輪回親本保持一致,無(wú)明顯差異,但稻瘟病、褐飛虱和白葉枯抗性水平顯著高于輪回親本,達(dá)到了精準(zhǔn)定向改良的目的(圖1)。

5 展望

以節(jié)水抗旱稻為代表的綠色超級(jí)稻的成功推廣應(yīng)用,在生產(chǎn)上大面積實(shí)現(xiàn)了“資源節(jié)約、環(huán)境友好”的綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)目標(biāo)。節(jié)水抗旱稻加值育種的目標(biāo)是在保留抗旱性的遺傳背景下,選育多抗、優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)輕簡(jiǎn)化栽培的新種質(zhì),培育綠色低碳的節(jié)水抗旱稻新品種。第一,利用分子標(biāo)記輔助選擇,創(chuàng)制了富含抗病蟲基因的節(jié)水抗旱稻新種質(zhì)和育種中間材料,以此為供體可以大大減少直接從地方種質(zhì)資源或野生稻中利用這些抗性基因的難度和時(shí)間。在加值育種過程中,除了通過回交和背景選擇盡可能保持節(jié)水抗旱的遺傳背景,分離世代還是應(yīng)該堅(jiān)持在沒有犁底層的旱地(山地)選擇避旱性,在水分脅迫的旱田選擇耐旱性,在灌溉的水田選擇高產(chǎn)性狀,通過交替篩選整合不同的抗旱機(jī)制。第二,加值育種應(yīng)注重稻米品質(zhì)特別是優(yōu)良食味、營(yíng)養(yǎng)功能等性狀的改良,提高稻米的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,滿足人們對(duì)美好生活的向往以及特殊人群的需求。第三,加強(qiáng)耐鹽堿、高光效等性狀的篩選和利用,進(jìn)一步拓展節(jié)水抗旱稻品種應(yīng)用面積和區(qū)域,保障糧食安全。第四,關(guān)注適應(yīng)輕簡(jiǎn)化栽培的性狀,如低氧萌發(fā)、早生快長(zhǎng)、抗除草劑、抗倒伏等有利等位基因,推廣直播旱管、低碳環(huán)保的種植模式。第五,利用基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的快速精準(zhǔn)改良。第六,陸稻在旱作馴化中受到雙向選擇,蘊(yùn)藏豐富的節(jié)水抗旱、養(yǎng)分高效、易栽培等綠色遺傳資源,加強(qiáng)對(duì)陸稻基因資源的挖掘和利用,解析重要基因資源的分子機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)制科學(xué)、高效、可行的分子設(shè)計(jì)育種方案。