韓禎禎， 劉禹辰， 王 建*

(1)安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 合肥 230032；2)軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所， 北京 102206)

肝癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，近幾十年，許多國(guó)家的肝癌發(fā)病率呈增加態(tài)勢(shì)。據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2020年全球肝癌新發(fā)病例是全部癌癥的第7位，死亡病例占第4位[1]。我國(guó)是肝癌的高發(fā)國(guó)家，肝癌的發(fā)病率占全國(guó)癌癥的第5位，且中國(guó)男性肝癌的新發(fā)病例約占全球總數(shù)的1/2，肝癌的死亡率占我國(guó)癌癥死亡率的第2位。因此，肝癌致病機(jī)制的研究和治療新技術(shù)的開發(fā)對(duì)于降低肝癌患者的死亡率至關(guān)重要。原發(fā)性肝癌主要分為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和HCC-ICC混合型3種不同病理學(xué)類型，其中肝細(xì)胞癌是最常見的原發(fā)性肝癌，約占總體肝癌病人的85%～90%，是肝癌診斷比例最高，死亡人數(shù)最多的類型。2018年中國(guó)肝癌新發(fā)病例和死亡病例幾乎占全球1/2，70%的患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期。因此，肝癌是人民健康的重大風(fēng)險(xiǎn)因素，迫切需要研究其發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的診治技術(shù)。

去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)通過(guò)去除泛素修飾來(lái)調(diào)控許多細(xì)胞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、相互作用或定位[2]。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶主要包括7個(gè)家族：泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, USPs)，卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶(ovarian tumor proteases, OTUs)，泛素羧基末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases, UCHs)，含有Machado-Josephin結(jié)構(gòu)域蛋白酶(MJDs)，MINDY(MIU-containing novel DUB)蛋白酶家族，ZUP1(zinc finger containing ubiquitin peptidase 1)蛋白酶家族和鋅依賴的JAB1/MPN/MOV34蛋白酶家族 (JAMMs，也稱為MPN+)[3]。其中，MJD家族作為去泛素化酶家族中最小的家族，含有4個(gè)蛋白質(zhì)，分別為Ataxin-3 (ATXN3)、Ataxin-3 樣蛋白質(zhì) (ATXN3L)、Josephin-1 (JOSD1)和Josephin-2 (JOSD2)[4, 5]。JOSD2作為MJD家族中只含有Josephin結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，已經(jīng)被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌中作為促癌因子，通過(guò)葡萄糖的分解代謝來(lái)調(diào)控癌癥的發(fā)生[6]。另有研究報(bào)道，JOSD2作為促癌分子能通過(guò)調(diào)控YAP(yes-associated protein)/TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)來(lái)調(diào)控膽管癌的發(fā)生[7]。但目前它在肝細(xì)胞癌中的作用尚不明確，本文在TCGA-LIHC(TCGA-liver hepatocellular carcinoma)RNA-seq的生物信息分析中發(fā)現(xiàn)，JOSD2是該DUB家族唯一在肝細(xì)胞癌腫瘤樣本表達(dá)量顯著高于癌旁(P<0.0001)，且與總生存期顯著相關(guān)的基因(P<0.05)，細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)JOSD2能促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的存活、遷移和侵襲(P<0.01)。本研究提示，JOSD2可能作為促癌因子調(diào)控肝細(xì)胞癌。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2和MHCC-97H細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、質(zhì)粒pCMV-Myc由本實(shí)驗(yàn)室保存，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、XhoI、NotI和T4 DNA連接酶(New England Biolabs)，HRP標(biāo)記Myc標(biāo)簽抗體(Sigma)，2×PCR預(yù)混液(Molecular Cloning Laboratories)，DMEM培養(yǎng)基(北京沃比森科技有限公司)，血清(Biological Industries)，轉(zhuǎn)染試劑PEI(Polyscisences)、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒(Promega)、Cell Counting Kit-8(Dojindo)、Transwell小室(FALCON)。

1.2 肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)來(lái)源及肝細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)去泛素化酶篩選

利用工具Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/)TCGA-LIHC mRNA的RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)去泛素化酶進(jìn)行分析[8]，計(jì)算總生存期(overall survival，OS；樣本數(shù)n=364)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival, RFS；樣本數(shù)n=316)，得到去泛素化酶表達(dá)量與病人生存的相關(guān)性的P值(log rankP)和風(fēng)險(xiǎn)率(hazard ratio)，卡值設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為Kaplan-Meier Plotter自動(dòng)最佳卡值(auto select best cutoff)。本文進(jìn)一步從TCGA下載LIHC RNA-seq FPKM數(shù)據(jù)集，共計(jì)377例病人的樣本和對(duì)應(yīng)的臨床信息。計(jì)算對(duì)應(yīng)去泛素化酶在腫瘤和癌旁樣本的FPKM(fragments per kilobase million)表達(dá)量差異。OS或RFS風(fēng)險(xiǎn)率大于1且FPKM表達(dá)顯著上調(diào)(倍數(shù)變化1.5倍，P<0.05)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到與肝細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)的去泛素化酶17個(gè)。為了進(jìn)一步確定JOSD2在肝細(xì)胞癌病例生存分析中的結(jié)果，本文使用了感染乙肝中國(guó)肝癌病人數(shù)據(jù)集(Chinese HCC patients with HBV infection, CHCC-HBV)中包含159例樣本的臨床和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)JOSD2進(jìn)行了生存分析，臨床信息及表達(dá)數(shù)據(jù)見附表(supplementary table S1)。OS、RFS曲線由Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)頁(yè)工具繪制。

1.3 去泛素化酶JOSD2在不同組織及腫瘤樣本中的表達(dá)分析

根據(jù)HPA(Human Protein Atlas, https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)給出的表達(dá)譜數(shù)據(jù)[9]，查詢JOSD2，獲得均一化的人體各組織的mRNA表達(dá)水平數(shù)據(jù)。根據(jù)1.2中下載的TCGA RNA-seq FPKM數(shù)據(jù)，對(duì)應(yīng)樣本的臨床信息，將樣本按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(the American Joint Committee on Cancer, AJCC)癌癥分期系統(tǒng)分別得到其在腫瘤不同分期、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、區(qū)域淋巴結(jié)類型中的表達(dá)量，并計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，統(tǒng)計(jì)方法為Student’st檢驗(yàn)。為確定TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)得出的結(jié)論具有普遍性，本文通過(guò)2個(gè)有完整臨床信息(包括AJCC分期)的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)，對(duì)JOSD2在腫瘤和癌旁中的表達(dá)量進(jìn)行了進(jìn)一步分析。GSE76427是包含115個(gè)肝細(xì)胞癌腫瘤樣本和52個(gè)癌旁樣本的RNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，使用數(shù)據(jù)提供的RNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)RSN均一化后的表達(dá)量進(jìn)行分析；GSE36376是包含240個(gè)肝細(xì)胞癌腫瘤樣本和193個(gè)癌旁樣本的RNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，使用數(shù)據(jù)提供的RNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)分位數(shù)均一化后的表達(dá)量進(jìn)行分析。箱線圖由R包ggplot2繪制。

1.4 JOSD2表達(dá)差異病人的差異基因篩選

根據(jù)Kaplan-Meier Plotter對(duì)去泛素化酶的自動(dòng)最佳卡值(FPKM=10，高表達(dá)樣本224例，低表達(dá)樣本140例)，將TCGA下載的RNA-seq樣本數(shù)據(jù)分為高表達(dá)和低表達(dá)組，篩選差異基因。將RNA-seq數(shù)據(jù)以轉(zhuǎn)錄本為單位進(jìn)行差異分析，統(tǒng)計(jì)方法為雙樣本異方差雙尾t檢驗(yàn)，之后采用Benjamini & Hochberg(False Discovery Rate, FDR)假設(shè)檢驗(yàn)矯正，取FPKM倍數(shù)變化2倍以上，F(xiàn)DR<0.05為卡值標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)R語(yǔ)言包ggplot2繪制火山圖?；蜣D(zhuǎn)錄本通過(guò)基因ID轉(zhuǎn)換為基因名進(jìn)行GO和通路富集分析。GO和通路富集分析使用R包Clusterprofiler，分別獲得上調(diào)和下調(diào)基因的顯著富集條目和通路，再通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)臈l目繪制條形圖，生物學(xué)過(guò)程按假設(shè)檢驗(yàn)校正后的P<0.05選取富集條目，KEGG通路按P<0.05選取富集通路，差異基因列表和富集條目總列表見附表(supplementary Table S2-4)，條形圖由R語(yǔ)言包ggplot2繪制。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞系HepG2和MHCC-97H接種到六孔板培養(yǎng)，待密度長(zhǎng)到70%～80% 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法：取滅菌的1.5 mL離心管，加入150 μL 雙無(wú)培養(yǎng)基，再加入1.5 μg pCMV-Myc-JOSD2質(zhì)粒，最后再加入7.5 μL PEI轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒：轉(zhuǎn)染試劑：雙無(wú)培養(yǎng)基=1∶5∶100)，吹打混勻，室溫靜置20 min。將離心管中的混合液體加入到六孔板中，輕輕混勻后放入37 ℃，5% 的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后換液，24～48 h后進(jìn)行Western 印跡鑒定表達(dá)。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

將細(xì)胞裂解提取的蛋白質(zhì)加入等體積的上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白質(zhì)變性。取10 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)完成后在5% 的脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1～2 h。封閉后先用1×TBST(Tris buffered saline solution with Tween 20)溶液洗去膜上的封閉液，用稀釋好的一抗孵育液4 ℃ 孵育過(guò)夜，一抗結(jié)束后，用1×TBST洗膜，一共3次，每次10 min。再進(jìn)行二抗孵育，將硝酸纖維素膜放在按一定比例稀釋好的二抗孵育液中40 min，結(jié)束后用1×TBST洗膜，一共3次，每次10 min。顯色，將顯色底物A和B等體積混合，加在膜上4 min，放入成像儀顯影。

1.7 細(xì)胞存活檢測(cè)

將pCMV-Myc-JOSD2和pCMV-Myc空載體轉(zhuǎn)染到HepG2和MHCC-97H細(xì)胞，孵育18～24 h棄去培養(yǎng)基將細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化、離心、重懸和細(xì)胞計(jì)數(shù)。HepG2細(xì)胞按照每孔2 500個(gè)細(xì)胞(100 μL/孔)、MHCC-97H細(xì)胞按照每孔3 500個(gè)細(xì)胞(100 μL/孔)并做3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后向每孔中加入10 μL CCK8(Cell Counting Kit-8)溶液，分別檢測(cè)0、24、48、72、96 h的細(xì)胞存活情況。

1.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將pCMV-Myc-JOSD2和pCMV-Myc空載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞，18～24 h后棄去培養(yǎng)基并將細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化和離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。HepG2細(xì)胞密度調(diào)整至6×104/mL，MHCC-97H細(xì)胞密度調(diào)整至1×105/mL，計(jì)數(shù)后取所需的細(xì)胞數(shù)目，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)至200 μL。取200 μL細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)用Transwell小室，24孔板下室加入600 μL 含有20% 血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，放在甲醇溶液中固定20 min。再用0.1% 結(jié)晶紫染色20 min，結(jié)束后用流水沖洗和晾干，在顯微鏡下隨機(jī)選9個(gè)視野，進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將pCMV-Myc-JOSD2和pCMV-Myc空載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞,18～24 h后棄去培養(yǎng)基并將細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化和離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。HepG2細(xì)胞密度調(diào)整至7×104/mL，MHCC-97H細(xì)胞密度調(diào)整至1×105/mL，計(jì)數(shù)后取所需的細(xì)胞數(shù)目，再用無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)至200 μL，取200 μL細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用Transwell小室，24孔板下室加入600 μL含有20% 血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，并用PBS沖洗3次，放在甲醇溶液中固定20 min。再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，結(jié)束后用流水沖洗和晾干，在顯微鏡下隨機(jī)選9個(gè)視野，進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

其他功能實(shí)驗(yàn)采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去泛素化酶JOSD2與肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

本文分析了63種去泛素化酶在肝細(xì)胞癌中的總生存期和無(wú)病生存期與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。同時(shí)分析了相應(yīng)去泛素化酶在腫瘤組織與癌旁組織的基因表達(dá)量差異，最終發(fā)現(xiàn)，其中17個(gè)去泛素化酶在腫瘤組織中顯著高表達(dá)(Table 1，倍數(shù)變化大于1.5倍，P<0.05)，且與無(wú)病生存期或總生存期顯著相關(guān)(log rankP<0.05，HR>1)。發(fā)現(xiàn)MJD去泛素化酶家族中，只有JOSD2在肝細(xì)胞癌組織中比癌旁高表達(dá)(P=2.92E-27)，并且與病人總生存期顯著相關(guān)(P<0.05)。本文進(jìn)一步對(duì)JOSD2在組織中的分布進(jìn)行了分析，根據(jù)HPA的人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Table 2)發(fā)現(xiàn)，JOSD2在HPA檢測(cè)的所有組織中均有分布，屬于組成型表達(dá)，但在腦、肌肉和肝組織中表達(dá)豐度最高，提示其可能在肝中發(fā)揮重要功能。通過(guò)進(jìn)一步查詢HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的17種腫瘤組織中JOSD2的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示(Table 3)，JOSD2在各種腫瘤組織中均表達(dá)，未見腫瘤特異性，此結(jié)果與JOSD2在正常組織中組成型表達(dá)是一致的。在肝細(xì)胞癌中JOSD2的表達(dá)水平屬于中等，未見明顯高于其他腫瘤組織。

Table 1 List of 17 deubiquitinases associated with the prognosis of hepatocellular carcinoma

Table 3 TCGA mRNA expression level of JOSD2 in different human tumors

通過(guò)TCGA中下載的364例肝細(xì)胞癌樣本的mRNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，JOSD2的表達(dá)量在癌組織中顯著高于癌旁(P<0.0001, Fig.1A)。進(jìn)一步對(duì)肝細(xì)胞癌樣本分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)AJCC癌癥TNM分期，在不同癌癥分期中，JOSD2的表達(dá)量隨肝細(xì)胞癌往晚期發(fā)展而未見顯著性變化(Fig.1B)，為了排除腫瘤癌旁表達(dá)量差異對(duì)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的干擾，本文單獨(dú)分析腫瘤和癌旁組織中的JOSD2表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)量同樣無(wú)顯著差異(Fig.1C, D)。盡管TCGA-LIHC數(shù)據(jù)中，JOSD2在腫瘤中的表達(dá)量顯著高于癌旁，但是其表達(dá)量不隨腫瘤發(fā)展階段的進(jìn)展而升高，為了確認(rèn)這種現(xiàn)象的普遍性，本文選擇了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中2組具有完整臨床信息的肝細(xì)胞癌RNA表達(dá)芯片的數(shù)據(jù)GSE76427(114例腫瘤，52例癌旁樣本)和GSE36376(240例腫瘤，193例癌旁樣本)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，2組肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)中JOSD2在腫瘤中的表達(dá)量均顯著高于癌旁(P<0.0001, Fig.1E和1G)，而在不同AJCC分期中JOSD2表達(dá)量無(wú)顯著差異(Fig.1F和1H)。

肝細(xì)胞癌分期通過(guò)腫瘤(tumor, T)、淋巴結(jié)(node, N)和轉(zhuǎn)移(metastasis, M)三個(gè)指標(biāo)共同評(píng)估，進(jìn)一步分析了JOSD2在不同腫瘤分型中淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移樣本中的表達(dá)量。在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移分類中，M0為無(wú)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，M1為有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，MX為無(wú)法評(píng)估，JOSD2的表達(dá)量在三類轉(zhuǎn)移樣本中表達(dá)量均無(wú)差異(Fig.1I)。在淋巴結(jié)受累程度評(píng)估中，N0為無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)，N1為少數(shù)淋巴結(jié)受累，NX為情況無(wú)法評(píng)估。JOSD2的表達(dá)量在不同類型區(qū)域淋巴結(jié)樣本中表達(dá)量均無(wú)差異(Fig.1J)。這些結(jié)果顯示，JOSD2表達(dá)量不隨肝細(xì)胞癌的發(fā)展階段的進(jìn)程而增加，并且其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響與表達(dá)量無(wú)相關(guān)性。

Fig.1 Bioinformatics analysis of TCGA-LIHC, GEO and CHCC-HBV datasets (A) The difference of JOSD2 expression between tumor and non-tumor tissue in TCGA-LIHC data,****P<0.0001. (B) The difference of JOSD2 expression between different stages of cancer in all TCGA-LIHC sample. ns, no significance. (C) The difference of JOSD2 expression between different stages of cancer in TCGA-LIHC tumor sample. ns, no significance. (D) The difference of JOSD2 expression between different stage of cancer in TCGA-LIHC non-tumor sample. ns, no significance. (E) The difference of JOSD2 expression between tumor and non-tumor tissue in GSE76427 sample,****P<0.0001. (F) The difference of JOSD2 expression between different stages of cancer in all GSE76427 sample. ns, no significance. (G) The difference of JOSD2 expression between tumor and non-tumor tissue in GSE36376 sample.****P<0.0001. (H) The difference of JOSD2 expression between different stages of cancer in all GSE36376 sample. ns, no significance. (I) The difference of JOSD2 expression of between different levels of distant metastases. ns, no significance. (J) The difference of JOSD2 expression between various nearby (regional) lymph nodes. ns, no significance. (K) Overall survival analysis of JOSD2 in TCGA-LIHC mRNA-seq data. (L) Recurrence-free survival analysis of JOSD2 in TCGA-LIHC mRNA-seq data. (M) Overall survival analysis of JOSD2 in CHCC-HBV mRNA-seq data. (N) Recurrence-free survival analysis of JOSD2 in CHCC-HBV mRNA-seq data

HPA對(duì)JOSD2的病理注釋為肝癌的不良預(yù)后基因。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示，JOSD2的高表達(dá)是與總生存期顯著相關(guān)(P<0.05)的風(fēng)險(xiǎn)因素(HR>1, Fig.1K,n=364)。但是其高表達(dá)與無(wú)復(fù)發(fā)生存期無(wú)顯著關(guān)系(Fig.1L,n=316)。這些結(jié)果顯示，JOSD2的高表達(dá)可能是肝細(xì)胞癌中總生存期顯著降低的風(fēng)險(xiǎn)因素。乙肝病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌是我國(guó)肝細(xì)胞癌的主要類型，而TCGA數(shù)據(jù)中與乙肝病毒相關(guān)肝癌的病例極少。CHCC-HBV數(shù)據(jù)是乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌研究，有完善和業(yè)內(nèi)普遍認(rèn)可的臨床和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，因此，本文使用該數(shù)據(jù)集對(duì)JOSD2在乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌做了生存分析。結(jié)果表明，在總生存期(Fig.1M,n=159)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(Fig.1N,n=159)JOSD2的高表達(dá)同樣是風(fēng)險(xiǎn)因素，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。針對(duì)不同來(lái)源的肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，JOSD2的高表達(dá)整體與預(yù)后呈不良趨勢(shì)，但是其統(tǒng)計(jì)學(xué)不顯著可能是由于不同樣本中具有較大異質(zhì)性導(dǎo)致的。

2.2 JOSD2高表達(dá)病人的差異基因功能分析

根據(jù)Kaplan-Meier Plotter分析給出的最佳卡值(FPKM=10)，將所有364例病人樣本分為高表達(dá)和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組224例，低表達(dá)組140例。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載FPKM矩陣，對(duì)高表達(dá)、低表達(dá)樣本組，進(jìn)行差異分析，統(tǒng)計(jì)方法采用雙樣本異方差雙尾t檢驗(yàn)(Welcht.test)，進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正。差異基因的選取標(biāo)準(zhǔn)為倍數(shù)變化2倍以上，F(xiàn)DR<0.05。分析結(jié)果得到上調(diào)轉(zhuǎn)錄本1 338個(gè)(代表非冗余基因889個(gè))，下調(diào)轉(zhuǎn)錄本197個(gè)(代表非冗余基因103個(gè))(Fig.2)。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析顯示，上調(diào)蛋白質(zhì)中主要富集有Wnt、Hippo、ECM(extracellular matrix)等通路(Fig.3A)；下調(diào)蛋白質(zhì)中主要富集有細(xì)胞色素P450、類固醇激素生物合成和PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)等通路。GO(gene ontology)生物學(xué)過(guò)程功能富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白質(zhì)則顯著富集與腫瘤發(fā)生相關(guān)的Wnt、G蛋白偶聯(lián)受體、BMP(bone morphogenetic proteins)通路等；下調(diào)蛋白質(zhì)的生物過(guò)程顯著富集類固醇、膽固醇和激素等相關(guān)條目(Fig.3B)。根據(jù)GO和通路富集分析，JOSD2過(guò)表達(dá)上調(diào)的Wnt、Hippo、BMP等通路均與細(xì)胞增殖有關(guān)，提示JOSD2可能影響細(xì)胞增殖和分化，從而進(jìn)一步影響腫瘤的轉(zhuǎn)移(Fig.3)。

Fig.2 Differential expression gene analysis between samples with JOSD2 high and low expression Welch t test P value was corrected by Benjamini & Hochberg multiple hypothesis test and FDR<0.05 was considered as differentially expressed genes with statistical significance. Red dots represent significantly up-regulated genes with a log2 fold change greater that one, while blue dots represent significantly down-regulated genes with a log2 fold change greater that one

Fig.3 KEGG pathway and gene ontology enrichment analysis of differential expression genes (A) Significantly enriched KEGG pathways of differential expression genes, P<0.05. (B) Significantly enriched biological process terms of differential expression genes, q value (FDR)<0.05

2.3 JOSD2促進(jìn)HepG2細(xì)胞的存活、遷移和侵襲

根據(jù)前述的分析結(jié)果提示，JOSD2可能影響肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移，為了驗(yàn)證此推測(cè)，本文在肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)JOSD2，采用pCMV-Myc空載體作為對(duì)照。通過(guò)Western 印跡結(jié)果表明轉(zhuǎn)染和表達(dá)JOSD2成功(Fig.4A)。隨后進(jìn)行了細(xì)胞存活、遷移和侵襲能力的分析。細(xì)胞存活結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)JOSD2能提高細(xì)胞存活能力(*P<0. 05,**P< 0.01, Fig.4B)。細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)JOSD2能促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力(***P<0.001,****P<0.0001, Fig.4C-D)。

Fig.4 Effects of JOSD2 on HepG2 cell proliferation, migration and invasion (A) Overexpression of JOSD2 protein was detected using Western blotting. GAPDH was used as an internal control. (B) CCK8 assay was performed to detect the survival ability of HepG2 cells after transfection of Myc-JOSD2.*P<0.05,**P<0.01. (C) Transwell migration assay was used to detect the migration ability of HepG2 cells after transfection of Myc-JOSD2 (left). Statistical analysis of migration ability of HepG2 cells after transfection of Myc-JOSD2 (right).***P<0.001. Scale bars, 20 μm. (D) Transwell invasion assay was used to detect the invasion ability of HepG2 cells after transfection of Myc-JOSD2 (left). Statistical analysis of HepG2 cell invasion ability after Myc-JOSD2 transfection (right).****P<0.0001. Scale bars, 20 μm

2.4 JOSD2促進(jìn)MHCC-97H細(xì)胞的存活、遷移和侵襲

由于HepG2細(xì)胞為肝母細(xì)胞癌細(xì)胞，為了進(jìn)一步確定JOSD2在肝細(xì)胞癌中的作用，將pCMV-Myc-JOSD2和pCMV-Myc空載體轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC-97H細(xì)胞中，Western 印跡結(jié)果表明轉(zhuǎn)染和表達(dá)成功(Fig.5A)。隨后進(jìn)行了細(xì)胞存活、遷移和侵襲能力的分析。細(xì)胞存活結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)JOSD2能明顯的提高細(xì)胞的存活能力(**P< 0.01, Fig.5B)。細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)JOSD2能明顯的促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力(****P<0.0001, Fig.5C-D)。

Fig.5 Effects of JOSD2 on MHCC-97H cell proliferation, migration and invasion (A) Overexpression of JOSD2 protein was detected using Western blotting. GAPDH was used as an internal control. (B) CCK8 assay was performed to detect the survival ability of MHCC-97H cells after Myc-JOSD2 transfection.**P<0.01. (C) Transwell migration assay was used to detect the migration ability of MHCC-97H cells after Myc-JOSD2 transfection (left). Statistical analysis of migration ability of MHCC-97H cells after Myc-JOSD2 transfection (right).****P<0.0001. Scale bars, 20 μm. (D) Transwell invasion assay was used to detect the invasion ability of MHCC-97H cells after Myc-JOSD2 transfection (left). Statistical analysis of invasion ability of MHCC-97H cells after Myc-JOSD2 transfection (right). ****P<0.0001. Scale bars, 20 μm

3 討論

去泛素化酶(DUB)是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的重要組分，能夠維持體內(nèi)功能蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，在調(diào)控細(xì)胞周期、表觀遺傳修飾和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10, 11]。JOSD2作為去泛素化酶MJD家族中的一員，它定位于19號(hào)染色體，并且只含有MJD家族共有的Josephin結(jié)構(gòu)域，可以直接移除蛋白質(zhì)的泛素鏈[12]。目前JOSD2的研究較少。有研究表明，JOSD2去泛素化并穩(wěn)定了包括醛縮酶 A、磷酸果糖激酶-1 和磷酸甘油酸脫氫酶在內(nèi)的葡萄糖代謝酶復(fù)合物，提高它們的活性和糖酵解速率，與非小細(xì)胞肺癌的腫瘤表達(dá)譜和不良預(yù)后相關(guān)[6]。另外，JOSD2通過(guò)去泛素酶活性依賴性方式切割多聚泛素鏈來(lái)維持蛋白質(zhì)的水平，JOSD2的消耗會(huì)促進(jìn)YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子通過(guò)蛋白酶體進(jìn)行降解，從而阻礙膽管癌細(xì)胞的增殖[7]。同時(shí)，JOSD2能調(diào)控PHGDH(phosphoglycerate dehydrogenase)蛋白質(zhì)水平從而調(diào)控肺腺癌的發(fā)生[13]。本文首次發(fā)現(xiàn)JOSD2在肝細(xì)胞癌中可能發(fā)揮促癌作用。

首先，本文對(duì)63種去泛素化酶與肝細(xì)胞癌生存期和預(yù)后的關(guān)系，以及對(duì)在肝腫瘤和癌旁表達(dá)量的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)17個(gè)去泛素化酶在腫瘤組織中高表達(dá)，其中包括與肺癌密切相關(guān)的OUT家族中的OTUB2[14](OTU deubiquitinase, ubiquitin aldehyde binding 2)和OTUD3[15, 16](OTU deubiquitinase 3)，與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)的USP家族中的USP27[17, 18](ubiquitin-specific peptidase 27)和USP22[19, 20](ubiquitin specific peptidase 22)等，本文發(fā)現(xiàn)，MJD家族中只有JOSD2在肝細(xì)胞癌組織中比癌旁高表達(dá)，并且與病人總生存期顯著相關(guān)。對(duì)JOSD2在正常和癌癥組織中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論正常組織還是癌癥樣本中，其分布無(wú)顯著特異性，但是在肝中表達(dá)的排名較高；進(jìn)一步對(duì)TCGA-LIHC肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，JOSD2在腫瘤中的表達(dá)量顯著高于癌旁，但是其mRNA水平并不隨著腫瘤發(fā)展階段的變化而變化，在不同分期的肝腫瘤的轉(zhuǎn)移和區(qū)域淋巴結(jié)樣本中也無(wú)顯著性變化，該結(jié)果也與兩組不同來(lái)源的芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致；最后對(duì)TCGA-LIHC和CHCC-HBV的生存分析，JOSD2仍然與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，但是在不同來(lái)源病人樣本中具有異質(zhì)性。這些結(jié)果提示，該蛋白質(zhì)與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系更多的是可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平之外的蛋白質(zhì)水平、蛋白質(zhì)翻譯后修飾或調(diào)控肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白質(zhì)的豐度來(lái)實(shí)現(xiàn)。JOSD2高表達(dá)的TCGA-LIHC病人樣本中，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)基因的功能和通路富集分析顯示W(wǎng)nt、Hippo、BMP等通路顯著富集(P<0.05)，提示JOSD2可能通過(guò)這些通路分子發(fā)揮調(diào)控作用，但是具體的分子和細(xì)胞學(xué)生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。隨后，在肝癌細(xì)胞系中通過(guò)細(xì)胞存活、遷移和侵襲的結(jié)果表明，表達(dá)JOSD2可以明顯的促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些結(jié)果初步證明，JOSD2在肝細(xì)胞癌中可能發(fā)揮促癌因子的作用。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)JOSD2在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤病人總生存期相關(guān)。但JOSD2調(diào)控肝細(xì)胞癌的具體作用機(jī)制、可能調(diào)控的靶基因以及信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步闡明。