戴 京， 葉 茂

(湖南大學生物學院分子科學與生物醫(yī)學實驗室，長沙 41000)

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的一大惡性特征，也是導致腫瘤治療效果不佳，腫瘤患者死亡率居高不下的重要原因之一。大量的研究表明，腫瘤在轉(zhuǎn)移過程中通常伴隨著上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)現(xiàn)象的發(fā)生，因此，有效抑制EMT的發(fā)生將為阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移提供的可能。EMT是指上皮細胞失去極性轉(zhuǎn)為間質(zhì)細胞的過程，而正是這種極性的喪失為腫瘤的轉(zhuǎn)移和遠端定植奠定了基礎(chǔ)。大量蛋白質(zhì)分子過表達和信號通路的過度活化通常會促進EMT的發(fā)生。去泛素化酶利用自身的酶活性以維持這些分子高表達，以及通路的活化進而促進EMT。以這些去泛素化酶作為可能的治療靶點將為腫瘤的治療提供可能性和有效的治療手段。

1 泛素蛋白酶體系統(tǒng)

泛素是指一種具有76個氨基酸的小分子多肽，普遍存在于真核生物中，并具有高度的保守性。泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。它是泛素分子在一系列的酶的作用下，與靶蛋白質(zhì)共價結(jié)合的修飾過程。蛋白質(zhì)的泛素化修飾主要有單泛素化修飾和多聚泛素化修飾兩種形式，多聚泛素化修飾包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位的修飾，其中以K48、K63位多聚泛素化修飾研究居多，K48位的多聚泛素化修飾主要發(fā)揮降解和調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用，K63位作用主要是介導信號轉(zhuǎn)導、參與DNA修復和調(diào)控蛋白質(zhì)的活性[1]。蛋白質(zhì)泛素化修飾參與調(diào)控包括細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復以及免疫應答等在內(nèi)的多種細胞活動[2]。蛋白質(zhì)泛素化降解是泛素化修飾一種常見的作用結(jié)果。真核細胞內(nèi)80%～85%的蛋白質(zhì)都是通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解[3]。泛素蛋白酶體途徑主要過程是由ATP供能。泛素活化酶E1將游離的泛素分子活化，即游離的泛素的C端甘氨酸與活化酶E1的半胱氨酸殘基相連；泛素結(jié)合酶E2將活化的泛素分子通過硫酯鍵結(jié)合到其高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBC)的半胱氨酸殘基上，形成E2-泛素復合物；最后泛素連接E3將泛素分子特異性轉(zhuǎn)移到靶蛋白質(zhì)上，并被26S蛋白酶體識別和降解[4,5]。

與其他的翻譯后修飾類似，在生物體內(nèi)的泛素化修飾也是一個被嚴格調(diào)控的可逆過程。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)能夠移除底物蛋白質(zhì)上的單泛素分子或多聚泛素鏈，逆轉(zhuǎn)泛素化過程。人類基因組可編碼100多種去泛素化酶，其主要可分為半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶兩大類，半胱氨酸蛋白酶可細分為ubiquitin-specific proteases(USPs)、ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases(UCHs)、otubain/ovarian tumor-domain containing proteins(OTUs)、Machado-Joseph disease domain superfamily(MJDs)、motif interacting with Ub-containing novel DUB family(MINDYs)、zinc finger-containing ubiquitin peptidase 1(ZUP1)六大家族；金屬蛋白酶因含有JAMMs結(jié)構(gòu)域而又被稱為JAMM蛋白質(zhì)家族[6]。DUBs除了能夠逆轉(zhuǎn)底物蛋白質(zhì)的泛素化修飾外，還參與泛素鏈的編輯，泛素分子的回收以及泛素前體的加工和成熟[7]。因此，去泛素化酶的異常表達或活化都會直接或間接影響相應的信號通路，進而導致腫瘤等多種人體疾病。

2 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤

EMT是指在特定的生理和病理情況下，上皮細胞失去極性轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢ǖ倪w移能力間質(zhì)細胞。在此過程中細胞表型相關(guān)的標志物也發(fā)生了改變，其主要表現(xiàn)為上皮標志物E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)和角蛋白(cytokeratin)表達下調(diào)，而間充質(zhì)表型標志物波形蛋白(vimentin)和N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)表達增加，與此同時細胞的形態(tài)由圓形變?yōu)樗笮停毎g的連接松散，細胞的運動和遷移能力得到顯著的增加。EMT在人體生理或病理條件下表現(xiàn)出重要的意義。根據(jù)EMT所發(fā)生的特定生物學環(huán)境，可將EMT分為3種亞型[8]。1型EMT與胚胎植入、發(fā)育和器官形成相關(guān)。通過這種轉(zhuǎn)化，上皮細胞獲得了能夠在細胞外基質(zhì)中遷移的表型，并遷移到特定的部位參與組織的形成；2型EMT與組織再生、損傷修復和器官纖維化相關(guān)。通過產(chǎn)生纖維細胞，從而修復由創(chuàng)傷和炎癥反應造成的組織損傷。3型EMT是指惡性腫瘤發(fā)生時，上皮樣細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)樣細胞的過程，與腫瘤相關(guān)的表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。這些細胞通常位于腫瘤周邊，通過EMT獲得局部和全身的侵襲能力，最終導致腫瘤的轉(zhuǎn)移。

EMT與腫瘤的起始、腫瘤干性、腫瘤遷移和轉(zhuǎn)移，以及耐藥等多種惡性行為密切相關(guān)[9-11]。EMT作為腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件，絕大部分腫瘤的轉(zhuǎn)移都伴隨著EMT的發(fā)生。EMT過程涉及細胞極性的喪失，細胞間的黏附被破壞以及遷移能力的獲得，這使得腫瘤細胞的侵襲能力增強，為細胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件，從而促進細胞穿過基底膜進入全身循環(huán)系統(tǒng)[12]。上皮細胞間通過各種細胞黏附因子進行連接，形成具有極性的細胞層，并通過基底膜將細胞錨定在基質(zhì)表面，使得細胞被固定[13]。在發(fā)生EMT時，細胞通常會高表達參與細胞外基質(zhì)和基底膜降解的相關(guān)蛋白質(zhì)，使得原有的組織學屏障被破壞，便于腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落導致侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。EMT在維持腫瘤的干性中發(fā)揮重要的作用，是導致腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞間的差異的重要原因[14,15]。在許多的腫瘤中，富含腫瘤干細胞的亞群常表現(xiàn)出更高的EMT活性，具有很強的成瘤能力，可以隨著腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移而定植于其他的器官形成新的腫瘤灶[16]。EMT與腫瘤的耐藥以及復發(fā)密切相關(guān)，這也是導致患者預后不良的一個重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌和胰腺癌等多種癌癥，EMT能夠明顯降低藥物的治療功效，其主要原因是EMT與腫瘤耐藥間的信號通路存在著相互間的串擾[17]。大部分的化療藥物都是通過誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，而EMT能夠驅(qū)動腫瘤細胞抵抗凋亡，使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性[18]。

3 去泛素化酶與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

EMT是一個動態(tài)的細胞生物學過程，在該過程中涉及到EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Snail，Twist和ZEB等)和細胞表面的分子標志物以及相關(guān)信號通路中的多種蛋白質(zhì)表達水平的變化，而在上皮細胞中這些蛋白質(zhì)具有不穩(wěn)定性，易被降解。要保證該生物過程的正常進行，去泛素化酶在調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用(Table 1)。

3.1 去泛素化酶與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標志物

在細胞發(fā)生EMT過程中，細胞表面多種蛋白質(zhì)表達水平會出現(xiàn)顯著變化，這些蛋白質(zhì)被稱為EMT分子標志物，主要的分子標志物有E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)等。E-鈣黏著蛋白是一種Ca2+依賴，與細胞間黏附密切相關(guān)的跨膜蛋白質(zhì)，是典型上皮細胞標志物。作為腫瘤抑制者，E-鈣黏著蛋白的表達缺失會導致細胞的去分化和增加腫瘤的侵襲性[19,20]。在上皮細胞中，Kruppel-like factor 3(KLF3)能夠招募USP47到細胞連接處，通過抑制E-鈣黏著蛋白的泛素化，增加其穩(wěn)定性，使得細胞間連接得以加強[21]。E3泛素連接酶MARCH7能夠調(diào)控E-鈣黏著蛋白和β-聯(lián)蛋白(β-catenin)的表達。在卵巢癌中，USP7通過逆轉(zhuǎn)MARCH7自身的泛素化，并穩(wěn)定MARCH7，從而介導E-鈣黏著蛋白和β-聯(lián)蛋白的表達[22]。波形蛋白是中間絲家族的主要組成部分，在正常的間質(zhì)充細胞中廣泛表達，而被認為是間質(zhì)型細胞的主要分子標志物。波形蛋白在多種腫瘤中過度表達并與腫瘤生長，侵襲和預后不良相關(guān)。波形蛋白表達的增加已成為EMT發(fā)生的一個重要標志[23]。USP14能夠去泛素化波形蛋白并使其穩(wěn)定，進而促進胃癌細胞發(fā)生EMT[24]。在非小細胞肺癌中，Beclin 1(BECN1)能夠與波形蛋白和USP14相互作用，從而介導USP14對波形蛋白的去泛素化作用[25]。

3.2 去泛素化酶與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控因子

EMT分子標志物的表達受到不同轉(zhuǎn)錄因子的嚴格調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)稱為調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子(EMT-TFs)，其主要包括Snail、Slug、Twist1、Zinc finger E-box-binding homeobox 1 and 2(ZEB1/2)[26]。EMT-TFs是極不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)水平上受到泛素蛋白酶體系統(tǒng)的嚴格控制。Snail和Slug都是Snail家族的主要成員，他們能夠識別并通過鋅指結(jié)構(gòu)與E-鈣黏著蛋白的啟動子的E-box區(qū)結(jié)合，并招募組蛋白去乙?；负虳NA甲基轉(zhuǎn)移酶等，從而抑制E-鈣黏著蛋白的表達[27,13]。在IL-6條件下，DUB3能夠?qū)nail和Slug去泛素化，并使二者穩(wěn)定進而誘導乳腺癌EMT以及腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[28,29]。除DUB3外，USP5和USP10、USP20也可以作為Slug的去泛素化酶，參與調(diào)節(jié)Slug穩(wěn)定[30,31]。在不同的條件下，Snail的穩(wěn)定性也受到PSMD14、OTUB1、USP47、USP27X[32]、USP11[33]、USP26[34]、USP37[35]、USP29[36]、USP3[37]和USP1[38]等多種去泛素化酶的調(diào)節(jié)。Twist1是Twist家族成員，具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，它能夠與E-鈣黏著蛋白的啟動子區(qū)結(jié)合，并通過招募染色質(zhì)修飾物來抑制其表達，進而促進EMT。DUB3除了作為Snail和Slug的去泛素化酶，DUB3也能夠參與調(diào)節(jié)Twsit1的穩(wěn)定，表明DUB3可能是EMT的關(guān)鍵調(diào)控者[29]。此外在三陰性乳腺癌中USP2也能夠調(diào)節(jié)Twist的穩(wěn)定進而促進乳腺癌EMT的發(fā)生與增加腫瘤干性[39]。ZEB1和ZEB2隸屬于ZEB蛋白質(zhì)家族，可通過其鋅指結(jié)構(gòu)與E-鈣黏著蛋白、ZO-1等基因啟動子元件近端的E-box區(qū)結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，促進EMT的發(fā)生。此外，ZEB1和ZEB2還能夠活化N-鈣黏著蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)間質(zhì)基因的表達[13]。研究發(fā)現(xiàn)，USP51與COPS5通過穩(wěn)定ZEB1的表達促進EMT的發(fā)生，導致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加[40]。在DNA損傷時，ATM激酶可磷酸化ZEB1，促進ZEB1直接與USP7相互作用，增強其去泛素化和穩(wěn)定CHK1的能力，調(diào)控DNA修復和抗輻射性,表明ZEB1可能是EMT和DNA損傷修復趨同調(diào)節(jié)者[41]。

3.3 去泛素化酶與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號通路

EMT是一個極其復雜的過程，例如TGF-β、Wnt/β-catenin等眾多細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑參與EMT過程。大量研究顯示，一些去泛素化酶通過靶向于這些信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，間接調(diào)控腫瘤細胞EMT發(fā)生。TGF-β是誘導EMT發(fā)生主要刺激因子之一，它能夠通過SMAD或非SMAD依賴的信號通路，誘導Snail、ZEB1、Twist等E-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達，進而誘導EMT的發(fā)生。當細胞受到TGF-β刺激后，會活化Smad2/3與Smad4形成三聚體復合物并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，啟動下游Snail和其去泛素化酶USP27X等靶基因的轉(zhuǎn)錄[33]。在正常細胞中TGF-β信號也受到反饋機制調(diào)節(jié)，其靶基因Smad7是主要反饋調(diào)節(jié)者，其主要作用機制是干擾Smad2/3與TGF-βR1受體的結(jié)合，以及招募泛素化酶對受體進行泛素化降解，抑制通路的活化[42]。在腫瘤細胞中，USP11[43]、OTUD4[44]、USP15[45]、USP4[46]和UCH37[47]、能夠逆轉(zhuǎn)TGF-βR1受體的泛素化，促進EMT的發(fā)生和癌細胞的轉(zhuǎn)移。此外，OTUD1和CYLD分別通過穩(wěn)定TGF-β負向調(diào)控者Smad7或調(diào)節(jié)其活性，進而抑制TGF-β通路的活化，阻止乳腺癌的轉(zhuǎn)移[48-50]。TGF-β通路主要功能行使者Smad2/3與Smad4三聚體復合物，也受到各種去泛素化酶的調(diào)控。OTUB1、USP15、USP9X和Proteasome 26 S Subunit, Non-ATPase 14(PSMD14)通過分別穩(wěn)定Smad2/3、Smad4來調(diào)節(jié)該三聚體的表達水平，影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[51-53]。

Wnt/β-catenin信號通路不僅在胚胎發(fā)育中發(fā)揮了一定的作用，而且與許多人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有密切聯(lián)系。在存在Wnt配體情況下，卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)rz)和low-density lipoprotein-related receptors 5 and 6(LRP5/6低密度脂蛋白質(zhì)受體相關(guān)蛋白質(zhì))受體的共激活作用會阻止破壞復合物的形成，抑制GSK-3β的活性，從而穩(wěn)定細胞內(nèi)β-聯(lián)蛋白并最終導致其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，核內(nèi)的β-聯(lián)蛋白作為共轉(zhuǎn)錄激活因子介導C-myc等下游靶基因的廣泛表達，調(diào)節(jié)細胞干性、增殖以及EMT的發(fā)生等[54]。此外，GSK-3β的活性受到抑制時，其對轉(zhuǎn)錄因子Snail的磷酸化作用減弱，導致Snail的降解途徑被阻斷，在細胞核內(nèi)的蓄積增加，進而抑制E-鈣黏著蛋白的表達，促進EMT的發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移[55]。研究發(fā)現(xiàn)，UCHL1能夠依賴其去泛素化酶活性來抑制β-聯(lián)蛋白的降解，誘導EMT，促進結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[56,57]。除UCHL1外，UCH37也能夠抑制β-聯(lián)蛋白的降解增加細胞的運動能力，促進細胞的遷移[58]。在脊椎動物發(fā)育早期，UCH37通過介導Tcf7去泛素化作用，使得β-聯(lián)蛋白能夠與Tcf7結(jié)合，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，使Wnt信號得到激活[59]。

Table 1 DUBs and EMT

在USP家族中，USP4、USP20也能夠通過穩(wěn)定β-聯(lián)蛋白，從而參與Wnt/β-catenin通路誘導EMT，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[60,61]。此外在肝癌中β-聯(lián)蛋白的表達也受到USP9X的調(diào)控[62]。Axis inhibition protein (Axin)是β-聯(lián)蛋白的降解復合體主要成分，其自身的降解也受到USP34的調(diào)控，表明USP34可以參與Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)，誘導EMT的發(fā)生[63]。此外在結(jié)腸癌中，USP44通過穩(wěn)定Axin進而抑制Wnt/β-catenin通路的活化而發(fā)揮抑制抑癌的作用[64]。Axin也受到USP25的間接調(diào)控，USP25與鞣酸酶(tankyrases)存在直接的相互作用，促進其去泛素化和穩(wěn)定,而鞣酸酶能夠促進Axin的降解使得β-聯(lián)蛋白免于泛素化的降解。因此USP25能夠控制鞣酸酶穩(wěn)定性來調(diào)控Wnt信號通路[65]。此外，USP7與Ring Finger Protein 220(RNF220)相互作用進而控制β-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定，活化Wnt信號通路[66]。有趣的是，近期叢楓等人研究發(fā)現(xiàn)，USP7通過去泛素化并穩(wěn)定Axin，從而抑制Wnt/β-catenin信號，形成這樣悖論的潛在原因可能是由于敲低USP7的表達使得細胞內(nèi)的Mouse double minute 2 homolog(MDM2)蛋白迅速降解，導致p53所誘導的細胞凋亡增加，大量基因異常表達，而產(chǎn)生USP7能夠促進Wnt/β-catenin信號的活化假陽性結(jié)果；也可能是由于先前研究所利用的USP7的抑制劑缺乏精準的靶向性，造成早期的USP7小分子抑制劑可能存在脫靶風險，這種脫靶現(xiàn)象在利用相同濃度的USP7早期抑制劑不僅能夠降低Wnt通路活性，而且也使得細胞增殖受到抑制的實驗中得到了驗證；表明早期的USP7的小分子抑制劑的脫靶也是一個潛在的因素[67]。

Fig.1 The role of deubiquitinating enzymes in TGF-β and Wnt signaling pathways The activation of TGFβ and Wnt pathways promotes EMT by promoting Smad2/3/4 and β-catenin to enter the nucleus to regulate the transcription of EMT-related genes. DUBs affect the activation of this pathway by regulating related molecules and EMT

4 問題與展望

去泛素化酶通過各種方式廣泛參與EMT過程，介導腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。大部分的DUBs都存在多底物的情況，因此研發(fā)靶向于特定DUBs的藥物，能夠達到類似于多靶點治療的效果，這或許為腫瘤的治療提供一個新的策略。目前通過靶向于DUBs來抑制EMT和腫瘤的遷移與轉(zhuǎn)移的小分子抑制劑已經(jīng)取得部分進展。例如芒柄花黃素(formononetin)能夠與USP5結(jié)合，并抑制其對Slug去泛素化的活性，從而阻礙了EMT和肝細胞癌的惡性進展[30]。DUB3可能作為EMT的關(guān)鍵調(diào)控者之一，WPI130、Patrin-2、PD033299等多個抑制劑直接或間接作用于DUB3活性與表達，進而抑制EMT的發(fā)生[29,68,69]。除DUB3外，WPI130還可以作為USP5、USP9X、USP14、UCH37、UCHL1等多個去泛素化酶的靶向抑制劑[70]。USP14在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮重要的作用，因此也已研發(fā)Tricyclics、Azepan-4-ones、IU-1和IU1-147等多個針對USP14的小分子抑制劑[71]。此外Mitoxantrone能夠有效抑制USP11的活性，從而阻礙TGF-β誘導下EMT的發(fā)生[72]。由于DUBs存在著多底物的特征，因此對于靶向于DUBs小分子藥物的研發(fā)，這意味著我們需要對于相應的DUBs作用機制以及作用的底物有足夠認識。目前對于DUBs作用底物的篩選通常依賴于質(zhì)譜技術(shù)，這可能存在一定程度的假陽性，增加篩選過程的復雜性，因此，提高質(zhì)譜技術(shù)的精密度，能夠有效的獲取到相應的DUB作用的底物，或者對開發(fā)更為高效的底物篩選策略具有重要意義。雖然眾多的DUBs的底物被發(fā)現(xiàn)，但是對于不同的DUB識別和作用底物是否依賴于特定的基序的機制或規(guī)律，并未像部分泛素連接酶或激酶那樣得到系統(tǒng)性的解決。盡管對于DUBs的分子結(jié)構(gòu)有較為清晰的認識，但DUBs在不同的條件下或者作用于不同底物通常存在著變構(gòu)現(xiàn)象，這也為開發(fā)相應的靶向小分子藥物提出了更大的挑戰(zhàn)。此外，DUBs廣泛參與腫瘤細胞的侵襲和遷移等各項生命活動，然而目前僅有一小部分的DUBs在其中得到較為廣泛的研究，因此對于更多的DUBs進行更為廣泛的研究顯得十分有必要。泛素化修飾作為蛋白質(zhì)一種重要的翻譯后修飾，與其他的翻譯后修飾存在著相互的串擾，而DUBs在不同的翻譯后修飾之間的功能作用還依舊不清楚，其他的翻譯后修飾對于DUBs活性的調(diào)節(jié)，以及底物的識別機制也認識不足。蛋白質(zhì)的泛素化修飾、在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)非穩(wěn)定性方面也具有重要的作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而DUBs在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)非穩(wěn)定性方面的研究仍相對較少，因此增加該方面的研究，這將有利于全面認識DUBs的生物學功能。DUBs在腫瘤EMT過程發(fā)揮著重要的作用，靶向于DUBs抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移將更為腫瘤治療提供新的治療手段和方案，從而有效的推動腫瘤的治療。