王劉清， 竇 非， 王友軍*

(1)北京師范大學生命科學學院遺傳與發(fā)育所，抗性基因資源與分子發(fā)育北京市重點實驗室， 北京 100875；2)認知神經(jīng)科學與學習國家重點實驗室，基因工程藥物及生物技術(shù)北京市重點實驗室， 北京 100875)

鈣離子(calcium ion, Ca2+)是自然界中一種普遍存在的二價陽離子。生物體內(nèi)的Ca2+在生命活動的維持、生長、發(fā)育、衰老和死亡等眾多生物學過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。這樣一種簡單的離子之所以能精確調(diào)控細胞內(nèi)各種不同甚至相反的生理活動，是由于胞內(nèi)自由Ca2+水平的變化(即鈣信號)具有高度的時空特異性。在時間尺度上，鈣信號不同的持續(xù)時間、發(fā)生頻率介導(dǎo)了不同的生理反應(yīng)[1]，例如微秒、毫秒范圍的胞吞胞吐和肌肉收縮，數(shù)分鐘乃至數(shù)小時的細胞代謝，甚至于數(shù)年累月的生長過程等。瞬時的鈣信號可能只影響某些酶促反應(yīng)或是膜通道的開關(guān)，而時間跨度更長的鈣信號則可能引起基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯等。在空間維度上，局部的鈣火花與傳導(dǎo)整個細胞的鈣波也會引發(fā)不同的反應(yīng)。例如質(zhì)膜區(qū)域附近的鈣信號既可以局部地激活下游信號分子，也可以傳遞至細胞深處發(fā)揮作用。但由于胞漿中存在大量的鈣螯合蛋白質(zhì)，Ca2+的擴散距離有限，需要借助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣通道以“鈣致鈣釋放”(Ca2+induced Ca2+release, CICR)來產(chǎn)生能長距離傳播的鈣波。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在該過程中發(fā)揮整合調(diào)節(jié)的作用，將低于CICR閾值的鈣信號中止，而將閾上刺激信號放大并產(chǎn)生鈣波，從而造成不同的結(jié)果。除了時空上的差異，鈣信號的幅度也影響著細胞產(chǎn)生不同的效應(yīng)。

胞內(nèi)的游離Ca2+濃度受到細胞精確的調(diào)控。在正常狀態(tài)下，細胞內(nèi)Ca2+水平處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡狀態(tài)，即鈣穩(wěn)態(tài)。靜息Ca2+水平的異常增高或降低(即鈣穩(wěn)態(tài)的失衡)會導(dǎo)致細胞功能的失調(diào)，甚至引起細胞的死亡。許多人類疾病都與之息息相關(guān)，例如心血管疾病、免疫缺陷疾病和癌癥等[2]。目前越來越多的證據(jù)表明，在神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默病中，神經(jīng)元的鈣穩(wěn)態(tài)也是失調(diào)的[3, 4]。阿爾茨海默病的發(fā)病率隨居民的年齡增加而升高。隨著我國老齡化進程的加深，該病癥給社會帶來了日益沉重的負擔。但由于阿爾茨海默病確切的致病機制仍不清楚，臨床上仍無特效藥。因此，研究神經(jīng)元Ca2+調(diào)控與阿爾茨海默病之間的關(guān)系，能促進對阿爾茨海默病致病機制的理解，為藥物研發(fā)提供思路。

1 神經(jīng)元鈣信號系統(tǒng)

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本單位，包含有樹突、胞體、軸突以及神經(jīng)元之間形成的突觸結(jié)構(gòu)等。神經(jīng)元是典型的可興奮性細胞，其諸多生理功能都受到鈣信號的調(diào)節(jié)，例如動作電位的產(chǎn)生與傳導(dǎo)、突觸小泡的釋放以及突觸可塑性等。因此，鈣信號系統(tǒng)是神經(jīng)元信號系統(tǒng)中非常重要的組成部分。神經(jīng)元鈣信號有多種產(chǎn)生方式，大致可分為：胞外Ca2+內(nèi)流、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放以及由Ca2+釋放引發(fā)的Ca2+內(nèi)流等。

1.1 胞外Ca2+內(nèi)流

神經(jīng)元質(zhì)膜上有許多可以介導(dǎo)鈣內(nèi)流的受體或通道。其中，由谷氨酸受體所介導(dǎo)的鈣內(nèi)流是神經(jīng)元所較為特有的。谷氨酸受體主要在神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞的質(zhì)膜上表達，是大腦中含量最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，包括代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)與離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)。其中iGluRs是配體門控的離子通道，包括N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR)、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptors, AMPAR)等[5]。iGluRs各種亞型以不同的方式介導(dǎo)鈣信號。接受谷氨酸的刺激后，其中的AMPAR介導(dǎo)的Na+及Ca2+內(nèi)流，引發(fā)細胞去極化。當細胞膜電位去極化達到一定閾值后，NMDAR釋放通道中的阻斷因子Mg2+，此時NMDAR便可與谷氨酸結(jié)合，引發(fā)鈣內(nèi)流(Fig.1A)。由于NMDAR與谷氨酸的親和性遠高于AMPAR，所以使細胞能夠產(chǎn)生更持續(xù)的信號。AMPAR產(chǎn)生的電流信號持續(xù)10 ms，NMDAR產(chǎn)生的信號可達500 ms[6]，而mGluRs介導(dǎo)的信號時間尺度會更長。這些不同的谷氨酸受體亞型在同一神經(jīng)元突觸部位表達，使鈣信號更具有時間上的特異性。

此外，神經(jīng)元質(zhì)膜上還具有興奮性細胞特有的鈣通道，例如電壓門控的鈣通道(voltage gated calcium channels，VGCC)等。這類通道能被神經(jīng)元膜電位的去極化激活而引發(fā)鈣內(nèi)流[7]。

神經(jīng)元質(zhì)膜上還有許多哺乳動物細胞中普遍存在的非選擇性離子通道。其中的瞬時受體電位(transient receptor potential, TRP)通道，能介導(dǎo)包括Ca2+在內(nèi)的陽離子內(nèi)流[8]。近年來發(fā)現(xiàn)的對神經(jīng)元興奮性有重要的調(diào)節(jié)作用的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)子(calcium homeostasis modulator, CALHM1)，則可以被質(zhì)膜去極化或胞外Ca2+濃度降低而激活，介導(dǎo)包括Ca2+與ATP等分子的內(nèi)流[9]。此外，新近發(fā)現(xiàn)的機械敏感性的Piezo通道及OSCA/TMEM63通道，也可在質(zhì)膜上介導(dǎo)鈣內(nèi)流[10, 11]。

1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放

胞內(nèi)鈣信號的另一來源是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放(Fig.1A)。從胞體、軸突到末端的神經(jīng)棘突，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)幾乎遍布整個神經(jīng)元。靜息狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)含有亞毫摩爾水平的游離Ca2+，所以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也被稱為細胞的鈣庫。一直以來，人們普遍認為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個均質(zhì)性的鈣庫，但也有研究認為可能存在鈣釋放通道特異性的獨立鈣池[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上主要有2種鈣釋放通道，分別是1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3R)和蘭尼堿受體(ryanodine receptors，RYR)。

神經(jīng)元在受到多種刺激后會間接的通過上述2種通道引發(fā)鈣釋放。例如，在神經(jīng)元中高表達的谷氨酸受體除了能介導(dǎo)鈣內(nèi)流外，還可以介導(dǎo)鈣釋放。谷氨酸受體中的mGluRs主要為G蛋白耦聯(lián)受體。這類受體在被谷氨酸激活后，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3)，后者結(jié)合并激活I(lǐng)P3R引發(fā)鈣釋放。另外，神經(jīng)元質(zhì)膜在受到刺激去極化后會激活VGCC引發(fā)鈣內(nèi)流，這一鈣信號在達到閾值后會直接激活I(lǐng)P3Rs或RYRs。這兩者進而介導(dǎo)鈣釋放，引發(fā)更大的鈣信號。但如果鈣內(nèi)流或以其他方式產(chǎn)生的胞漿鈣信號過高時，IP3Rs或RYRs的功能反而被抑制。這種胞漿鈣水平對IP3Rs或RYRs的雙重調(diào)控是細胞產(chǎn)生鈣波或者鈣振蕩的關(guān)鍵。除Ca2+外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣釋放通道還受到多種因素的調(diào)控，IP3、咖啡因可分別增加IP3R和RYR對Ca2+的敏感性，進而可以用更小的胞漿鈣信號來激活I(lǐng)P3R或RYR，產(chǎn)生鈣釋放。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放引發(fā)的Ca2+內(nèi)流

在神經(jīng)元中，上述去極化或谷氨酸等引發(fā)的鈣釋放會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平下降。為此，細胞進化出一種通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與質(zhì)膜的互作來介導(dǎo)的鈣信號通路(Fig.1B)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與質(zhì)膜之間部分區(qū)域的距離非常近，小于30 nm，被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與質(zhì)膜區(qū)域的膜接觸點(membrane contact sites, MCSs)，也稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-質(zhì)膜連接區(qū)。在這些膜接觸點區(qū)域，富集有多種蛋白質(zhì)，對局部鈣信號的形成非常關(guān)鍵，對神經(jīng)元的興奮性有重要的調(diào)節(jié)作用。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule, STIM)蛋白與質(zhì)膜上的Orai鈣通道蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平降低后，會組裝成有活性的鈣釋放激活的鈣(Ca2+release activated Ca2+, CRAC)通道，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與質(zhì)膜的互作并引發(fā)鈣內(nèi)流。這一現(xiàn)象稱為鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store operated calcium entry, SOCE)[13]。靜息時，STIM蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔側(cè)的EF-SAM區(qū)結(jié)合有Ca2+，而當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平下降時，Ca2+從該區(qū)解離出來，引發(fā)后者的構(gòu)象變化，并暴露出其中的疏水基團，進而使得STIM內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)發(fā)生二聚化。這一構(gòu)象變化通過STIM跨膜區(qū)的傳遞，使得STIM胞漿區(qū)域卷曲的構(gòu)象變得較為伸展。胞漿區(qū)中STIM激活Orai的最小片段(the STIM1 Orai activating region, SOAR)，因而從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜附近移動到更靠近質(zhì)膜的位置，結(jié)合并激活質(zhì)膜上的Orai，引發(fā)鈣內(nèi)流，即SOCE[14]。

SOCE曾經(jīng)被認為是非興奮性細胞所特有的生物學過程。而如今大量研究表明，SOCE通路在神經(jīng)元中普遍存在，并發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15-17]。經(jīng)典的鈣釋放激活的鈣信號由STIM與Orai介導(dǎo)。STIM蛋白的兩種亞型，STIM1和STIM2，在腦中均有表達。STIM1主要分布于小腦，特別是浦肯野神經(jīng)元中[15]，STIM2則主要表達在海馬區(qū)以及皮質(zhì)神經(jīng)元中[18]。STIM1與STIM2的一級結(jié)構(gòu)具有很高的同源性，但在功能上則略有差異。STIM2相比于STIM1，在靜息時，就已經(jīng)處于半激活的狀態(tài)，所以更容易感受到鈣水平的變化[19]。但STIM2激活Orai1的效率卻低于STIM1。過表達STIM2，會減小STIM1介導(dǎo)的SOCE[20]。Orai在哺乳動物中有3種不同的同源蛋白質(zhì)：Orai1、Orai2以及Orai3，均以六聚體的形式發(fā)揮功能。大腦中，3種Orai蛋白質(zhì)的分布有所區(qū)別，Orai1在小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中表達較多，與STIM2有較強的相互作用[21]，Orai2則在海馬以及小腦中顯著表達[22]。目前有研究認為，3種Orai蛋白質(zhì)介導(dǎo)的鈣內(nèi)流大小不同，從而引發(fā)不同的下游事件[23]。

神經(jīng)元在產(chǎn)生鈣信號的同時，也會激活一系列的Ca2+清除機制：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵(sarco/endoplasmic reticulum calcium transport ATPase, SERCA)將胞漿中的Ca2+泵回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，質(zhì)膜鈣泵(plasma membrane Ca2+-ATPase, PMCA)、鈉/鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger，NCX)等將Ca2+排出胞外，從而使得胞內(nèi)各部位的Ca2+濃度很快回到靜息水平。這種精確的調(diào)控使神經(jīng)元的鈣水平處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡中，即為鈣穩(wěn)態(tài)。鈣穩(wěn)態(tài)是神經(jīng)元正常生理功能的基礎(chǔ)。無論是鈣信號的產(chǎn)生還是清除，一旦發(fā)生失調(diào)都會打破這種穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致神經(jīng)元的生理功能的異常，甚至引發(fā)細胞凋亡。

2 神經(jīng)元鈣信號的功能

Ca2+對神經(jīng)元的興奮性發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。首先，胞內(nèi)Ca2+能激活多種鈣依賴性離子通道來改變細胞膜電位，進而影響神經(jīng)元的興奮性。當神經(jīng)元受到外界刺激而發(fā)生去極化時，Ca2+通過質(zhì)膜上VGCC進入細胞，激活鉀通道gKCa1，能夠促進膜的復(fù)極化。而當電位降至靜息狀態(tài)時，gKCa1還未關(guān)閉，細胞進一步發(fā)生超極化。這種超極化會在100 ～ 200 ms內(nèi)恢復(fù)至靜息電位，而被稱為快速的后超極化(fast after-hyperpolarizations, fAHPs)。不僅如此，鈣內(nèi)流還會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放。這一鈣信號會激活gKCa2的開放，而產(chǎn)生緩慢的后超極化(slow after-hyperpolarizations, sAHPs)。此外，Ca2+還可以通過影響鈣依賴性Cl-通道，調(diào)控神經(jīng)元興奮性[24]。其次，鈣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放對于神經(jīng)元之間興奮性的傳遞是至關(guān)重要的。其中，Ca2+部分來源于VGCC介導(dǎo)的鈣內(nèi)流，部分來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣釋放。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)的維持對于神經(jīng)遞質(zhì)的釋放調(diào)節(jié)十分必要[25]。

神經(jīng)元突觸區(qū)域鈣水平的變化不僅影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，還對突觸的可塑性有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。1973年，Bliss等[26]發(fā)現(xiàn)，當給予海馬內(nèi)嗅皮層到齒狀回的神經(jīng)通路一連串強直刺激，會導(dǎo)致齒狀回神經(jīng)元興奮性突觸電位(excitatory postsynaptic potential, EPSP)幅度增加，可以持續(xù)數(shù)小時甚至數(shù)天。這現(xiàn)象被稱為長時程增強(long term potentiation, LTP)。當用低頻刺激通路，則引起場電位幅度減小，稱為長時程抑制(long term depression, LTD)[27]。LTP和LTD都依賴局部升高的鈣信號。但所依賴的鈣信號幅度不同，長時程增強依賴高幅度的鈣信號，而稍小的信號，例如突觸區(qū)域300 ～ 500 nmol/L鈣信號，則引發(fā)長時程抑制。長時程增強通常對應(yīng)著突觸形態(tài)上的改變，例如樹突棘的生長、AMPA受體的磷酸化等，長時程抑制則與之相反。這些由外界重復(fù)刺激造成的突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變，被稱為突觸可塑性。突觸可塑性是學習與記憶的基礎(chǔ)。其中，長時程增強可以分為早期(early-LTP, E-LTP)和晚期(late-LTP, L-LTP)。E-LTP需要1 s 100 Hz的刺激，而L-LTP需要的10 min 間隔的3次以上的重復(fù)刺激。有研究認為，E-LTP過程中，胞外Ca2+進入細胞后，被泵進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平增加，影響了IP3R和RYR對Ca2+的敏感性，因而下一次相同幅度的刺激會引發(fā)更大幅度的鈣信號反應(yīng)，從而形成一種類似“記憶”的信息。E-LTP持續(xù)時間在1 h以內(nèi)，L-LTP持續(xù)的時間更長，則涉及到基因的轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的合成等。

Ca2+還可以通過多種鈣依賴通路所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄來長時程的調(diào)控神經(jīng)元的活動(Fig.1C)。其中，Ca2+從胞外進入細胞的方式不同，激活的信號通路則不同。由VGCC介導(dǎo)的鈣信號一方面可以激活腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生環(huán)腺苷酸(cyclic AMP, cAMP)。cAMP本身既可以入核，也會引發(fā)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)入核。另一方面，Ca2+還能激活鈣調(diào)蛋白，使其入核后激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinases, CaMKs)。進入細胞核內(nèi)的cAMP、PKA以及CaMKs會磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，例如環(huán)腺苷酸效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)，引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄[28]。而由TRP通道介導(dǎo)的鈣信號，則通常促進轉(zhuǎn)錄因子NF-κB入核[29]。由Orai通道進入細胞的鈣信號，則通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶作用于活化的T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)，使其去磷酸化，進入細胞核啟動基因表達。此外，L型鈣通道、NMDAR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流也可激活NFAT的入核。這些基因的表達和蛋白質(zhì)的合成，對樹突棘、神經(jīng)軸突的生長、神經(jīng)元的發(fā)育以及突觸可塑性等方面有重要的影響[30, 31]。使用SOCE抑制劑，例如2-APB或SKF96365等，能使神經(jīng)元長時程增強減弱，對突觸可塑性造成損傷[32]。除了上述方式，Ca2+本身也能以鈣波的方式入核激活CREB等轉(zhuǎn)錄因子。

Fig.1 Diagram showing neural Ca2+ signaling system (A) Synaptic Ca2+ signals: Ca2+ influxes from extracellular space through VGCC, NMDAR, AMPARs or mGluRs and Ca2+ releases from ER mediated by IP3Rs or RYRs. (B) SOCE at ER-PM junctions: SOCE is triggered by lowering of ER Ca2+ level, mediated by CRAC channels that are composed by ER Ca2+-sensors STIM, and the pore-forming unit Orai. (C) Ca2+-dependent gene expression: Cytosolic Ca2+ signals may activate different transcription factors like calcineurin-NFAT, NF-κB, and cAMP-CREB, leading to changes in gene expression. VGCC, voltage gated calcium channels; NMDAR, N-methyl-D-aspartate receptor; AMPAR, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor; IP3R, Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor; RYR, Ryanodine receptor; SOCE, store-operated Ca2+ entry; STIM, stromal interaction molecule; NFAT, nuclear factor of activated T cells; cAMP, cyclic AMP; CREB, cAMP response element binding protein; gray solid lines, direction of movements; gray dashed lines, effects on targets

3 神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)失衡與阿爾茨海默病

神經(jīng)元正常生理功能的維持、記憶與遺忘都與神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)。神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)失衡與包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)在內(nèi)的多種疾病高度相關(guān)。AD是一種為人所熟知的神經(jīng)退行性疾病。2015年，世界范圍內(nèi)AD患者已達4 600萬。據(jù)預(yù)測，在未來20年內(nèi)，患者人數(shù)將達1億人次[33]。從1906年AD被報道至今，相關(guān)研究持續(xù)百余年。AD患者臨床表現(xiàn)為記憶的喪失與認知功能的障礙，病理上表現(xiàn)為腦內(nèi)出現(xiàn)β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積為核心形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神經(jīng)元丟失等。根據(jù)百年來的研究，對AD的病因提出了多種假說，包括Aβ毒性假說、Tau蛋白假說、遺傳變異假說等。其中，Aβ毒性假說主要認為，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)經(jīng)分泌酶異常切割后，產(chǎn)生的含42個氨基酸的肽段Aβ42，易聚集形成具有神經(jīng)毒性的斑塊狀沉淀，可造成神經(jīng)元損傷，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。而Tau蛋白假說則認為，神經(jīng)元中Tau蛋白的過度磷酸化是導(dǎo)致AD產(chǎn)生的重要因素。Tau蛋白是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性的一種微管相關(guān)蛋白質(zhì)。其過度磷酸化，一方面會促使微管解聚，破壞細胞骨架，另一方面易聚集成雙螺旋絲，形成NFTs，對神經(jīng)元造成損傷。遺傳變異假說則認為，AD的產(chǎn)生主要與APP、早老素1(presenilin1，PSEN1)和早老素2(presenilin2，PSEN2)等基因的突變有關(guān)。這3種基因編碼的蛋白質(zhì)都參與Aβ的形成，若發(fā)生突變，易導(dǎo)致Aβ的異常增多或者易聚集的Aβ42生成，從而過度累積形成斑塊[34]。這些假說為AD藥物的研發(fā)提供了思路。但可惜的是，基于這些假說研發(fā)的AD的治療藥物，在臨床實驗階段均以失敗告終。因而目前仍未找到AD確切的發(fā)病機制。對于Aβ的積累、Tau蛋白的過度磷酸化等現(xiàn)象究竟是原因還是結(jié)果仍無定論。所以近年來提出一些新的假說，希望能更好地解釋AD的病理過程。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，鈣穩(wěn)態(tài)的失衡與AD的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，即AD的“鈣假說(calcium hypothesis)”。鈣假說起源于1970 s年代末對大腦衰老的研究，于1984年由Khachaturian 正式提出[35]。該假說認為，神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的持續(xù)性改變對神經(jīng)元功能失常，大腦慢性疾病的發(fā)生發(fā)揮重要作用。三十多年來，鈣假說獲得了越來越多的實驗及病理證據(jù)的支持[36-38]。

3.1 胞漿鈣穩(wěn)態(tài)失衡與AD

研究者首先發(fā)現(xiàn)，AD患者神經(jīng)元胞漿靜息鈣水平相對于正常水平而言顯著增高，這一現(xiàn)象可能由多種因素造成。按Ca2+的來源不同，可分為4類：胞外鈣內(nèi)流增加、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放增加、胞漿鈣鰲合蛋白的減少和鈣外排減少(Fig.2)。

當前，對AD中胞外鈣內(nèi)流是否增加仍存在一定的爭議。部分研究者認為，鈣內(nèi)流減少，例如Thibault等[39]在2xTg AD小鼠中發(fā)現(xiàn)，CA1區(qū)域神經(jīng)元的L型鈣通道電流相比于野生型減小，以及Eric Snyder等認為，Aβ增加了NMDAR內(nèi)吞作用，使質(zhì)膜上NMDAR的含量減少。Dreses-Werringloer等[40]發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)型AD型病人中，CALHM1 位點多態(tài)性(P86 L)，減弱了Ca2+的滲透率，對APP的代謝造成影響。但以上結(jié)果并不受到大部分研究的支持。如有些研究認為，CALHM1多態(tài)性(P86 L)與晚發(fā)型AD并不存在必然聯(lián)系。全細胞膜片鉗研究顯示，在12～16個月大老年3xTg-AD小鼠(過表達Tau (P301 L)，APP (SWE) 和 PSEN 1 (M146V)3種突變基因)的海馬CA1神經(jīng)元中，L型鈣通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流增加，使得CA1神經(jīng)元更易受損[41]。除此之外，另有一些研究認為，NMDAR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流增加[42]。目前，市場上緩解AD癥狀的藥物美金剛(Memantine)就是一種 NMDAR拮抗劑，可以抑制NMDAR的過度激活[43]。另有報道認為，Aβ本身也可在膜上形成鈣滲透通道[44]，或是作用于質(zhì)膜上的受體，引發(fā)鈣內(nèi)流。而在HEK293細胞中，過表達PSEN2突變(D263A)，會增加通過TRPC6進入細胞的鈣內(nèi)流大小。因此，眾多研究結(jié)果更支持胞外鈣內(nèi)流增加的理論。

當前，對AD模型中鈣內(nèi)流變化雖有爭議，但對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放增加的觀點則接受度較高。Aβ可通過作用膜上的mGluR5，產(chǎn)生更多的IP3[45]，進而使IP3R受體介導(dǎo)鈣釋放增加。家族型阿爾茲海默癥(familial Alzheimer’s Disease; FAD)相關(guān)PSEN突變中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道表達增加[46]，活性增強[47]，對配體更敏感[48]，使得鈣釋放增加。RYR拮抗劑Dantrolene在3xTg AD小鼠中也展示出神經(jīng)保護性[49]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，AD模型中，神經(jīng)元胞漿中的Ca2+結(jié)合蛋白(calcium binding protein, CaBP)表達量下調(diào)。Ca2+結(jié)合蛋白對神經(jīng)元有保護作用，大腦中不同區(qū)域Ca2+結(jié)合蛋白的表達變化會導(dǎo)致神經(jīng)元更易受損[50]。AD病人基底前腦膽堿能神經(jīng)元中，CaBP表達顯著下降與膽堿能神經(jīng)元的丟失有關(guān)[51]。

除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可直接作用于在質(zhì)膜上的PMCA[52]，影響Ca2+的外排途徑。在AD動物模型的海馬CA1區(qū)，鈉/鈣交換體的表達量也顯著下降[53]。

綜上，在多種因素影響下，AD患者神經(jīng)元胞漿靜息鈣水平顯著上升。胞漿靜息鈣水平上升會激活多種鈣相關(guān)的酶類，例如鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2 (calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase Ⅱ, CAMKKⅡ)，CAMKKⅡ會激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，活化的AMPK作用于Tau蛋白的S262/S356位點，促進Tau蛋白的磷酸化。另外，有些研究認為，Ca2+能通過激活CaMKII磷酸化APP，從而促進Aβ的形成[54]，造成神經(jīng)毒性[55]。另外，CaMKII還可磷酸化AMPAR[56]，或與NMDAR結(jié)合。CaMKII與NMDAR結(jié)合形成的復(fù)合物對長時程增強的形成有重要的作用。CaMKII活性的異常，影響了神經(jīng)元突觸的生理功能以及記憶的形成與鞏固[57]。此外，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin, CaN)能作用于磷酸化的NFAT或CREB，使其去磷酸化，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄；或是去磷酸化糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)，造成Tau的過度磷酸化[58]。鈣調(diào)蛋白以及鈣依賴性蛋白酶類作為Ca2+的下游靶點，承擔著執(zhí)行者的功能。總之，胞漿鈣穩(wěn)態(tài)的改變會導(dǎo)致其靶蛋白質(zhì)活性的異常，進而造成了細胞功能上的失調(diào)[59]。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡與AD

目前，對于AD病程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)是否發(fā)生改變等問題仍存在一定的爭議。支持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平上升假說主要有以下的間接證據(jù)：PSEN1可與SERCA發(fā)生互作，增強SERCA往內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中泵鈣的能力[60]。另外，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的PSEN被認為是一種可通透陽離子的低電導(dǎo)率通道，允許Ca2+被動漏出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當PSEN發(fā)生突變，鈣漏通道受阻。因此，Ca2+被留滯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，進而增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靜息鈣水平[61]。但最近的一些直接檢測結(jié)果則支持相反的結(jié)論。研究者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD相關(guān)的PSEN突變不改變或者降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣水平[62-64]。Brunello等[65]用定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣指示劑ER-Aequorin檢測PSEN2突變的細胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平減小，SERCA被抑制，鈣釋放增加。McCombs 等[66]用D1ER檢測PSEN敲除細胞以及PSEN突變細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平，發(fā)現(xiàn)不同PSEN1突變會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平發(fā)生不同變化，PSEN1(V94 M)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平升高，PSEN1(M233V、A409T)使鈣水平下降。

當前，之所以存在對AD細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平變化的爭議，主要是有下述幾種原因。首先，可能不同的PSEN亞型，或同一種PSEN不同的突變位點本身對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平造成了不一樣的影響。其次，可能是研究方法不同造成的假象。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣指示劑相較于胞漿鈣指示劑而言，發(fā)展更晚，所以早期研究主要使用定位于胞漿的鈣指示劑，通過檢測藥物清空內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫引發(fā)的鈣釋放的大小，來間接指示鈣庫的大小。但這種間接測量的結(jié)果易受多種因素的干擾，例如鈣指示劑的靈敏度，鈣庫清空的程度，以及質(zhì)膜上PMCA或NCX的影響等。而利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的鈣指示劑進行直接檢測的方法也存在一定的缺陷。首先，單色的鈣指示劑，例如ER-aequorin信號受指示劑表達量的影響，無法直接指示靜息鈣水平。為了能抵消掉指示劑濃度不同所造成的熒光信號的差異，需要雙色的比值型鈣指示劑，例如D1ER，GEM-CEPIA1er等。其次，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靜息鈣濃度較高，需要低鈣親和性的指示劑，但多數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣指示劑的親和力都不夠低，因而對較小的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平變化不夠敏感。另外，多數(shù)指示劑本身的動態(tài)變化范圍不夠大，難以指示較小的鈣水平變化。除此之外，還有一些實際使用問題，例如Mag-Fura-2，測量時需要通透細胞，而這個操作本身可能會改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平。GEM-CEPIA1er等用紫外激發(fā)的鈣指示劑在使用時，具有光毒性，無法對鈣穩(wěn)態(tài)進行長期檢測。因此，近年來用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣指示劑，例如D1ER、D4ER等直接檢測PSEN突變細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平，獲得了不同的結(jié)果。目前，仍不清楚造成這些爭議的原因是方法工具本身的局限，還是機制本身。為解決這些爭議問題，亟需開發(fā)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣指示工具。最近，我們對高靈敏、高動態(tài)范圍的單色CEPIA1er進行了改造，獲得了可見光激發(fā)的比值型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣指示劑miGer[67]。如能將該指示劑應(yīng)用于AD相關(guān)研究，則有望能解決上述爭議問題。

STIM和Orai介導(dǎo)的SOCE通路是一種重要的鈣信號產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)維持機制[68]。近年來，許多研究證明，SOCE對神經(jīng)元突觸的功能有重要作用[69, 70]。在浦肯野神經(jīng)元中敲除STIM1后，能通過影響mGluR1介導(dǎo)的鈣信號，進而影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞以及下游基因的轉(zhuǎn)錄[71]。在AD相關(guān)模型中也發(fā)現(xiàn)存在SOCE減弱的現(xiàn)象[72, 73]。在FAD病人的外周血B淋巴細胞、散發(fā)型AD病人皮質(zhì)神經(jīng)元以及PSEN1突變(M146V)的小鼠海馬神經(jīng)元中，均發(fā)現(xiàn)SOCE下調(diào)，STIM2的表達量下降，突觸區(qū)域的棘突減少等現(xiàn)象[30, 74]。在表達APP的小鼠中，也存在同樣的情況。神經(jīng)元SOCE的下調(diào)，通過降低CaMKII酶的活性，抑制了突觸的生長與突觸可塑性，從而影響長時程增強的產(chǎn)生[75]。通過超表達STIM2[76, 77]，或添加一種增強SOCE的新型調(diào)節(jié)因子NSN21778[78]，均能緩解FAD模型中海馬神經(jīng)元突觸棘突損失的現(xiàn)象，降低Aβ對神經(jīng)元造成的毒害作用。Kyung等[79]利用光遺傳學工具OptoSTIM1介導(dǎo)的鈣信號，增強了小鼠形成背景記憶的能力，暗示光激活的CRAC信號在AD干預(yù)中的應(yīng)用潛力。而我們與合作者等通過單元件的光激活CRAC通道LOCa3，緩解了AD模型果蠅爬行能力的衰退[80]。上述結(jié)果均表明，SOCE相關(guān)通路可以作為AD的一種潛在治療靶點。

3.3 線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡與AD

線粒體作為細胞產(chǎn)生能量的重要細胞器，在Ca2+調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著類似于鈣螯合劑的作用。當胞漿中的鈣水平上升時，線粒體通過線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運體(mitochondrial calcium uniporter, MCU)攝取到線粒體基質(zhì)的Ca2+也增多。線粒體攝取的Ca2+除來源于胞漿外，更多地來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，AD模型神經(jīng)元中或AD病人的成纖維細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的聯(lián)系加強。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated ER membrane, MAM)的形成增加[81]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上PSEN的分布并不是均勻的，而是富集于MAM區(qū)[82]。過表達PSEN2或是Aβ，能增加鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的傳遞[83, 84]。生理條件下，線粒體正常功能的維持，例如氧化磷酸化等能量產(chǎn)生反應(yīng)，需要合適濃度的Ca2+。但在AD模型中，線粒體攝取過多的Ca2+，反而抑制了氧化磷酸化反應(yīng)，影響ATP的產(chǎn)生，同時產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)。ROS上具有不成對的電子，被釋放到胞漿后對細胞有很強的攻擊作用，可引發(fā)鏈式反應(yīng)，造成膜結(jié)構(gòu)的崩解，或者進入細胞核破壞DNA結(jié)構(gòu)，引起細胞的凋亡。另外，鈣過載會導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的開放。mPTP是一種非選擇性通道，其異常開放會過多地釋放Ca2+、ROS、NAD+和細胞色素c等近百種物質(zhì)。細胞色素c也是引發(fā)凋亡的另一關(guān)鍵因子。同時，細胞色素c還能作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的IP3R上，進一步促進Ca2+釋放，使細胞的鈣超載程度進一步加深(Fig.2)。神經(jīng)元突觸部分的線粒體含量較多，為突觸小泡的運輸和釋放提供能量。當線粒體Ca2+超載，線粒體的功能失調(diào)，則突觸的功能也隨之受損，進而影響神經(jīng)元之間的交流[85]。

Fig.2 Ca2+ hypothesis of AD Major known pathways that lead to loss of Ca2+ homeostasis occurring in AD models. 1) Reduced STIM expression and impaired SOCE. 2) Mutations in PSEN or APP and accumulation of Aβ oligomers that may enhance Ca2+ entry, facilitate ER Ca2+ release, or inhibit Ca2+ clearance. These changes increase resting cytosolic Ca2+ levels, promoting aggregation of Aβ and phosphorylation of Tau. 3) Mitochondria Ca2+ overload caused by upregulated ER-mitochondria Ca2+ cross talk. This overload may lead to enhanced generation of ROS, opening of the mPTP, and releases of Cytochrome C, prompting apoptosis. AD, Alzheimer’s disease; PSEN, presenilin; APP, amyloid precursor protein; Aβ, amyloid β; ROS, reactive oxygen species; mPTP, mitochondrial permeability transition pore. Orange solid lines, increased calcium flow; orange dashed lines, decreased calcium flow; gray solid lines, direct effects; gray dashed lines, indirect effects

4 問題與展望

鈣信號對于神經(jīng)元生理功能的維持發(fā)揮關(guān)鍵的作用，因而受到極為精確的調(diào)控。神經(jīng)元鈣信號的異常以及鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，會造成神經(jīng)元功能的失調(diào)，甚至引起神經(jīng)元的凋亡。多項研究表明，神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默病與神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，特別是胞漿鈣水平增高密切相關(guān)，由此產(chǎn)生了AD的鈣假說。盡管目前該假說的內(nèi)容仍不夠完善，還存在著如“神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平是否變化以及鈣穩(wěn)態(tài)失衡究竟是導(dǎo)致AD發(fā)生的原因，還是AD造成的結(jié)果”等懸而未決的問題。但這一系列問題有望隨著新興技術(shù)的發(fā)展而得到解析。利用更靈敏的鈣指示劑可獲得關(guān)于AD神經(jīng)元細胞器鈣穩(wěn)態(tài)更精準的信息。另外，通過引入光遺傳學工具等時空特異性更高的手段來操控細胞內(nèi)的鈣信號，則有望解析鈣穩(wěn)態(tài)及鈣信號在AD中的作用機制。在對AD與神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的聯(lián)系有了更準確的認識后，神經(jīng)元的鈣水平有望成為AD新的檢測指標，鈣信號通路及相關(guān)蛋白質(zhì)也可能成為潛在的AD藥物靶標。

對鈣假說的完善，除了需要理清爭議性內(nèi)容并進一步解析未知的機制之外，還需要不斷探尋鈣假說與其他AD假說之間的聯(lián)系。因為鈣假說不是孤立存在的，它與其他AD假說之間存在著千絲萬縷的聯(lián)系。例如，Aβ在質(zhì)膜上形成可通透Ca2+的通道，造成胞漿鈣水平異常增高，而過高的鈣水平既會進一步促進Aβ的產(chǎn)生，還會促進Tau蛋白的過度磷酸化等。這些工作將進一步完善鈣假說，有助于更系統(tǒng)更全面地認識AD的病理機制，并為找到AD的有效治療手段提供理論基礎(chǔ)。