胡玉霞， 陳 杰， 邵 慧， 顏 普， 徐 恒， 孫 龍， 肖 曉，修 磊， 馮 春， 甘婷婷， 趙南京*

1. 安徽建筑大學(xué)電子與信息工程學(xué)院， 安徽 合肥 230601 2. 中國(guó)科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所， 中國(guó)科學(xué)院環(huán)境光學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230031 3. 合肥學(xué)院先進(jìn)制造工程學(xué)院， 安徽 合肥 230601

引 言

水源性病原菌可分為細(xì)菌、 病毒、 原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)[1-2]。 人們攝取受病原菌污染的自來(lái)水或飲用水， 會(huì)引發(fā)各種傳染性疾病， 如肝炎、 流感、 SARS、 肺炎、 胃潰瘍和肺部疾病等[3-4]。 據(jù)報(bào)道， 水體大腸桿菌在美國(guó)每年造成約8 000萬(wàn)人患病和9 000人死亡[5]。 2008年， 瑞典小埃德市， 諾如病毒引起2 400人感染胃腸炎[6]。 2020年， 安徽壽縣自來(lái)水受污染， 導(dǎo)致493人感染志賀氏菌， 陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)熱嘔吐、 腹痛腹瀉等癥狀。 另外， 水源性病原菌污染也會(huì)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。 據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)， 澳大利亞悉尼的供水系統(tǒng)受到隱孢子蟲(chóng)污染， 疫情控制花費(fèi)近4 500萬(wàn)美元[7]。 可見(jiàn)， 水體中病原菌不僅對(duì)人類健康和生命財(cái)產(chǎn)安全有影響， 而且對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。 因此， 開(kāi)展對(duì)水體病原菌快速靈敏的檢測(cè)和識(shí)別方法的研究， 將有助于提前了解水污染程度、 及時(shí)采取措施保證水安全， 對(duì)維護(hù)人類健康和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。 常規(guī)的水體病原菌檢測(cè)技術(shù)， 如人工培養(yǎng)法、 形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物技術(shù)等具有測(cè)量準(zhǔn)確、 有效等優(yōu)點(diǎn)。 然而， 這些方法中大多數(shù)預(yù)處理復(fù)雜、 耗時(shí)長(zhǎng)、 專人操作、 成本高， 并不能滿足水體病原菌現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的需求。 因此， 需要開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確、 無(wú)需復(fù)雜的檢測(cè)步驟以及安全無(wú)污染的水體病原菌檢測(cè)技術(shù)。

隨著光學(xué)技術(shù)、 生物技術(shù)和分析化學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展， 光譜檢測(cè)技術(shù)成為水體病原微生物檢測(cè)的研究熱點(diǎn)之一。 特別是紫外可見(jiàn)光譜、 熒光光譜和拉曼光譜等， 具有響應(yīng)時(shí)間快速和可移植性高等優(yōu)點(diǎn)， 成為水源性病原菌檢測(cè)的有效技術(shù)手段。 本文首先闡述了水體病原菌現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀， 然后重點(diǎn)綜述了五種光譜檢測(cè)技術(shù)在水體病原菌檢測(cè)中的工作原理和研究進(jìn)展， 最后指出各光譜技術(shù)在水體病原菌檢測(cè)中的優(yōu)缺點(diǎn)和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

1 現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)

隨著水質(zhì)監(jiān)測(cè)技術(shù)的普及， 人們開(kāi)始意識(shí)到水源性病原微生物污染及其控制對(duì)人體健康保護(hù)和水安全保障極其重要。 國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了多種水源性病原菌檢測(cè)方法， 如傳統(tǒng)培養(yǎng)法， 該方法主要包括濾膜法、 多管發(fā)酵法和平板計(jì)數(shù)法等。 濾膜技術(shù)是被美國(guó)環(huán)保署和世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的檢測(cè)飲用水生物污染物方法， 其原理將一定量的稀釋菌液通過(guò)特殊無(wú)菌膜過(guò)濾器， 然后將帶菌濾膜放置合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 并計(jì)算待測(cè)細(xì)菌數(shù)量[8]。 多管發(fā)酵技術(shù)是一種檢測(cè)水樣中微生物活性的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法。 根據(jù)美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(Environmental Protection Agency, EPA)的標(biāo)準(zhǔn)EPA Method 9131， 利用多管發(fā)酵技術(shù)能夠?qū)偞竽c菌群進(jìn)行檢測(cè)[9]。 多管發(fā)酵技術(shù)測(cè)定水樣中的大腸桿菌， 其檢出率為100%[10]。 平板計(jì)數(shù)法常用于測(cè)定細(xì)菌數(shù)量， 即把菌液接到平板中進(jìn)行培養(yǎng)， 根據(jù)平板中生長(zhǎng)出的菌落數(shù)量計(jì)算出水體中細(xì)菌濃度[11-12]。

為了縮短水體病原菌檢測(cè)時(shí)間， 該技術(shù)正在從傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化到現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)， 如分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等。 分子生物學(xué)技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)技術(shù)和原位熒光雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH)技術(shù)。 PCR技術(shù)通過(guò)測(cè)定致病菌的特定核酸片段來(lái)鑒定病原體。 理論上， 利用PCR只需幾個(gè)小時(shí)擴(kuò)增DNA序列， 由于其較高檢測(cè)靈敏度和高水平的擴(kuò)增降低了增菌培養(yǎng)的依賴性。 盡管PCR方法檢測(cè)成功率很高， 但仍存在一些局限性， 如對(duì)某些污染物敏感性低， 以及在水樣中存在抑制劑時(shí)擴(kuò)增效率降低[13]。 FISH技術(shù)是一種能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)行檢測(cè)、 鑒定、 定位和計(jì)數(shù)的技術(shù)。 其原理是通過(guò)熒光標(biāo)記的探針， 與細(xì)胞內(nèi)特異性核酸序列結(jié)合， 通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)[14]。 由于FISH技術(shù)檢測(cè)的精確性和可靠性依賴于探針的特異性和熒光團(tuán)的選擇， 因此在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前， 需要考慮探頭設(shè)計(jì)和熒光團(tuán)的選擇等幾個(gè)重要因素。

免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)檢測(cè)微生物， 一般需要制備待檢病原菌的特異抗體。 近年來(lái)， 被廣泛用于微生物檢測(cè)技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附法[15]、 免疫磁分離(IMS)[16]和酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)[17]。 該技術(shù)具有快速、 特異性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)， 但抗體易受環(huán)境中其他物質(zhì)影響， 易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

表1總結(jié)了水體病原菌現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)各自的優(yōu)缺點(diǎn)。 可見(jiàn)， 傳統(tǒng)人工培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確， 但操作繁瑣、 周期長(zhǎng)。 分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法能夠有效、 靈敏檢測(cè)出病原菌， 并顯著縮短檢測(cè)時(shí)間， 但所需儀器復(fù)雜、 成本高且無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)。 因此， 迫切需要研發(fā)快速簡(jiǎn)便、 成本低、 靈敏度高的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。

表1 現(xiàn)有水體病原菌檢測(cè)技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)

2 水源性病原菌的光譜數(shù)據(jù)分析

水資源不同于其他資源， 分布廣泛且分散， 受病原菌污染的水體范圍易于擴(kuò)大， 降低了現(xiàn)有水體病原菌檢測(cè)方法的敏感性， 同時(shí)易于引起大面積的人群感染疾病。 盡管現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)仍是水體病原菌檢測(cè)的主要方法， 但已有一些學(xué)者開(kāi)始嘗試研發(fā)更加快速、 準(zhǔn)確和便于在線檢測(cè)的方法， 實(shí)現(xiàn)對(duì)水環(huán)境中病原菌實(shí)時(shí)檢測(cè)。 由于光與病原菌相互作用， 產(chǎn)生多種不同的效應(yīng)： 吸收、 發(fā)射和散射等， 這些效應(yīng)可以通過(guò)測(cè)量不同波長(zhǎng)范圍的光譜(紫外可見(jiàn)、 近紅外、 中紅外、 遠(yuǎn)紅外、 拉曼、 太赫茲、 微波、 無(wú)線電波和核磁共振)來(lái)表征[18]。 光譜檢測(cè)技術(shù)指利用光與待測(cè)病原菌產(chǎn)生的光譜來(lái)分析病原菌結(jié)構(gòu)、 含量或性質(zhì)的技術(shù)， 由于該技術(shù)能夠無(wú)時(shí)間延遲地提供病原菌信息， 能夠滿足水體病原菌實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)的需求。 目前， 用于水體病原菌檢測(cè)的不同光譜技術(shù)的波長(zhǎng)范圍總結(jié)于圖1， 可見(jiàn)， 病原菌檢測(cè)波長(zhǎng)范圍主要集中在紫外到遠(yuǎn)紅外波段， 該范圍內(nèi)所涉及光譜技術(shù)有紫外可見(jiàn)光譜、 紅外光譜、 熒光光譜、 拉曼光譜和太赫茲光譜。

圖1 病原菌測(cè)量的光譜范圍

不同波長(zhǎng)病原菌光譜(“指紋”圖譜)， 通常含有病原菌的結(jié)構(gòu)、 分子組成和含量等相關(guān)信息。 為了從光譜中獲取病原菌的重要信息， 需要對(duì)光譜進(jìn)行分析。 光譜數(shù)據(jù)分析流程如圖2所示， 考慮到光譜里除含有病原菌自身特征信息外， 還包含樣品背景、 雜散光以及其他噪聲信息。 為了減少測(cè)量光譜中的冗余信息或噪聲， 需要對(duì)采集的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理， 常用譜圖預(yù)處理方法有均值中心化、 歸一化、 平滑、 導(dǎo)數(shù)、 多元散射校正等[19]。 在數(shù)據(jù)預(yù)處理之后， 采用分類方法或回歸技術(shù)提取被測(cè)物質(zhì)的定性或定量信息。 定性分析指分析光譜特征或依據(jù)光譜進(jìn)行分類， 如主成分分析[20]和支持向量機(jī)[21]等方法。 定量分析指需要依據(jù)參考光譜進(jìn)行模型校準(zhǔn)， 并給出與病原菌變量的相關(guān)性， 如多元線性回歸、 主成分回歸、 偏最小二乘算法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等[22-23]。

圖2 光譜分析的流程

3 光譜檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

3.1 紫外可見(jiàn)光譜技術(shù)

紫外可見(jiàn)光譜是一種較敏感的分子光譜， 其選擇波長(zhǎng)范圍為200～900 nm。 紫外可見(jiàn)光的吸收主要來(lái)自于微生物內(nèi)某些分子官能團(tuán)的作用， 當(dāng)分子官能團(tuán)受光照射時(shí)， 引起了內(nèi)部電子能級(jí)躍遷， 從而獲得單個(gè)分子的特征吸收光譜。 大多數(shù)液體或氣體的紫外可見(jiàn)光測(cè)量依賴于朗伯比爾定律， 即樣品的吸光度、 光程長(zhǎng)度和樣品內(nèi)存在吸收分子濃度有關(guān)[24]。 因此根據(jù)吸收測(cè)量值， 可以確定待測(cè)物質(zhì)的濃度。

對(duì)于病原菌內(nèi)蛋白質(zhì)和其他大分子， 光被許多官能團(tuán)吸收， 產(chǎn)生非特異性紫外可見(jiàn)光譜。 通過(guò)紫外光譜識(shí)別不同蛋白質(zhì)難以實(shí)現(xiàn)， 但可以根據(jù)不同波長(zhǎng)點(diǎn)的紫外吸光度值計(jì)算出總蛋白質(zhì)含量[25]。 溶質(zhì)的紫外吸收光譜分析通常假定為均勻溶液， 當(dāng)溶液內(nèi)存在固體顆粒時(shí)， 顆粒的吸收和散射作用主要體現(xiàn)在溶質(zhì)吸收作用。 在微生物測(cè)量中， 這種現(xiàn)象用光密度值表示。 測(cè)量光密度值的不同模式如圖3所示， 基于透射和濁度測(cè)量模式， 透射率是由恒定路徑長(zhǎng)度上的光吸收值來(lái)確定的， 而濁度是根據(jù)90°散射或180°處散射值來(lái)計(jì)算的。

圖3 測(cè)量光密度值的不同模式

目前， 通過(guò)光密度值對(duì)水溶液中病原菌濃度進(jìn)行測(cè)定， 是快速、 常用的水體菌液濃度檢測(cè)方法。 如Loske等[26]利用光密度值確定大腸桿菌菌液的濃度。 董自艷[27]采用紫外可見(jiàn)光譜計(jì)算出銅綠假單胞菌、 金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌三種菌液濃度。 除了確定水體菌液的濃度， 紫外可見(jiàn)光譜技術(shù)也可以用于對(duì)微生物其他參數(shù)測(cè)量。 Edlich等[28]利用紫外可見(jiàn)光譜技術(shù), 得到了酵母菌細(xì)胞大小、 核酸(DNA/RNA)濃度等信息。

3.2 熒光光譜技術(shù)

熒光光譜是利用熒光化合物， 又稱熒光團(tuán)， 在可見(jiàn)光或近紫外光的激發(fā)下發(fā)射熒光。 熒光團(tuán)吸收某些波長(zhǎng)的紫外光或可見(jiàn)光， 分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)， 然后從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)釋放更低的能量， 其熒光原理如圖4所示。 關(guān)于熒光物質(zhì)分為兩類： 一類是病原菌體內(nèi)本身生物化學(xué)熒光團(tuán)， 如蛋白質(zhì)內(nèi)部分氨基酸、 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、 三磷酸腺苷、 丙酮酸及核黃素， 在可見(jiàn)光或近紫外光的激發(fā)下發(fā)出熒光， 其激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)如表2所示[29]。 另一種熒光團(tuán)指在樣品中添加一些試劑產(chǎn)生熒光， 如丹酰、 熒光素、 若丹明等。 因?yàn)樘囟úㄩL(zhǎng)激發(fā)下的發(fā)射光強(qiáng)度與熒光團(tuán)濃度成正比[30]， 使熒光光譜成為病原菌監(jiān)測(cè)的工具。

圖4 熒光的基本原理

目前， 熒光光譜技術(shù)可以對(duì)不同微生物進(jìn)行分類鑒定， 如Giana等[31]利用激發(fā)熒光光譜與主成分分析(PCA)相結(jié)合， 對(duì)大腸桿菌、 腸球桿菌以及金黃色葡萄球菌等細(xì)菌進(jìn)行分類鑒別， 正確率和靈敏度均大于90%。 Schreier等[32]利用免疫磁分離(IMS)的熒光顯微鏡檢測(cè)方法， 采用不同于熒光染料染色來(lái)檢測(cè)水樣中的細(xì)螺旋體病原菌， 其結(jié)果與PCR技術(shù)一樣靈敏。 Khan等[33]利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光探針對(duì)大腸桿菌O157∶H7、 假單胞菌和沙門氏菌等細(xì)菌進(jìn)行了測(cè)定， 同時(shí)區(qū)分不可培養(yǎng)的活性與非活性細(xì)菌。 熒光光譜技術(shù)也可以獲取細(xì)胞內(nèi)信息。 李素文等[34]用熒光染料DAPI、 PyroninY和FITC對(duì)單個(gè)細(xì)胞的DNA、 RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行染色， 利用顯微熒光光度法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA、 RNA和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定， 其結(jié)果與流式細(xì)胞儀計(jì)算結(jié)果一致。

表2 病原體內(nèi)主要熒光物質(zhì)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)

3.3 紅外光譜技術(shù)

紅外光譜是紅外吸收光譜的簡(jiǎn)稱， 當(dāng)紅外光子的能量等于物質(zhì)的特定鍵振動(dòng)所需的能量， 物質(zhì)吸收了這個(gè)光的光子。 當(dāng)連續(xù)波長(zhǎng)的紅光光束穿過(guò)樣品時(shí)， 就能得到與該樣品分子轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)能級(jí)信息有關(guān)的特異性吸收譜。 用于病原菌檢測(cè)紅外光譜包括近紅外(800～2 500 nm)和中紅外(2 500～25 000 nm)的光譜區(qū)域。 近紅外光譜用于未知樣品成分分析， 中紅外光譜用于官能團(tuán)歸屬分析。

目前， 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy， FTIR)技術(shù)， 作為一種主要病原菌檢測(cè)技術(shù)， 該光譜提供分子振動(dòng)吸收譜帶， 可以檢測(cè)分子基團(tuán)及其周圍環(huán)境變化。 通過(guò)FTIR光譜可以獲得微生物內(nèi)的核酸、 蛋白質(zhì)和脂類等其他生物大分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)信息， 實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的鑒定和測(cè)量。 傅里葉紅外光譜有三種測(cè)量模式， 即透射、 漫反射和衰減全反射(見(jiàn)圖5)[35]。 通常根據(jù)樣品的光學(xué)特性選擇合適的紅外光譜測(cè)量模式。 目前， 該技術(shù)已用于識(shí)別和區(qū)分不同水體病原菌。 Vargas等[36]開(kāi)發(fā)了一種水體病毒自動(dòng)連續(xù)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。 將病毒收集在衰減全反射晶體上， 利用紅外光譜特征可以區(qū)分脊髓灰質(zhì)炎病毒和MS2噬菌體， 對(duì)于自來(lái)水樣品檢測(cè)限可達(dá)到103pfu·mL-1。 Erukhimovitch等[37]利用傅里葉變換紅外顯微技術(shù)， 由光譜區(qū)分感染皰疹病毒、 細(xì)菌或真菌污染的Vero細(xì)胞。 李兆杰等[38]建立了4種志賀氏菌的FTIR光譜庫(kù)， 使用聚類方法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法， 實(shí)現(xiàn)了4種志賀氏菌快速分型。

圖5 三種傅里葉紅外光譜的測(cè)量模式

3.4 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)是一種基于單色光與樣品相互作用時(shí)的非彈性散射技術(shù)。 當(dāng)某一頻率的單色光與樣品相互作用時(shí)， 光被散射后波長(zhǎng)產(chǎn)生變化， 這一現(xiàn)象稱為拉曼散射效應(yīng)。 入射光和散射光之間的波長(zhǎng)變化取決于引起拉曼散射的化學(xué)鍵， 這使得拉曼光譜在分子結(jié)構(gòu)檢測(cè)上具有優(yōu)勢(shì)。 病原菌內(nèi)核酸、 蛋白質(zhì)、 脂類和糖類可生成特異性拉曼光譜， 微生物的拉曼光譜能夠提供蛋白質(zhì)、 核酸、 脂質(zhì)和碳水化合物的化學(xué)成分和生物分子結(jié)構(gòu)信息[39]。

近年來(lái)， 拉曼光譜已應(yīng)用于水體不同病原菌分類鑒定。 如Escoriza等[40]利用拉曼光譜和成像技術(shù)對(duì)水中細(xì)菌微生物進(jìn)行區(qū)分和定量。 Silge等[41]利用拉曼光譜對(duì)瓶裝天然礦泉水中銅綠假單胞菌進(jìn)行了鑒定， 并研究了不同水生環(huán)境條件， 如pH值、 礦物含量、 生長(zhǎng)期對(duì)水體假單胞菌的影響。 由于拉曼光譜信號(hào)非常微弱， 目前出現(xiàn)各種應(yīng)用于鑒定水體病原菌的是增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)， 如共振拉曼光譜、 紫外共振拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜等。 Grun等[42]利用二維共振拉曼光譜技術(shù)， 實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌種類的鑒定， 準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。 Jarvis等[43]利用紫外共振拉曼光譜獲得整個(gè)病原體的指紋圖譜， 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)聚類分析方法， 實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌樣本鑒定， 并提高檢測(cè)靈敏度。 Fan等[44]利用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)鑒別水源性病毒， 包括諾如病毒、 腺病毒和輪狀病毒， 其檢測(cè)限達(dá)到102滴度。 Grow等[45]利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)識(shí)別三種隱孢子蟲(chóng)(C. parvum, C. hominis and C. meleagridis)甚至達(dá)到亞種水平， 并發(fā)現(xiàn)新鮮卵囊(數(shù)月齡)和舊卵囊(12歲以上月)的拉曼光譜具有不同的指紋。

3.5 太赫茲光譜技術(shù)

太赫茲(THz=1012Hz)光譜， 也稱為遠(yuǎn)紅外光譜， 是一種利用微波和紅外波長(zhǎng)(0.1～1 mm)之間的電磁輻射技術(shù)， 其光譜是由分子結(jié)構(gòu)決定。 即該光譜高度依賴于分子間的相互作用， 如氫的扭轉(zhuǎn)和振動(dòng)， 以及整個(gè)分子的伸展[46]。 太赫茲光譜的解析與紅外光譜和拉曼光譜類似， 并補(bǔ)充了中紅外光譜提供了結(jié)構(gòu)信息。

與其他紅外技術(shù)相比， 太赫茲光譜發(fā)展較慢， 可歸因于難以產(chǎn)生和探測(cè)太赫茲輻射的儀器。 然而， 近15年來(lái)， 新半導(dǎo)體的太赫茲源和緊湊太赫茲探測(cè)器的開(kāi)發(fā)， 當(dāng)監(jiān)測(cè)微生物分子低頻集體振動(dòng)模式時(shí)， 太赫茲光譜有望成為一個(gè)非常有用的技術(shù)手段。

由于太赫茲輻射與細(xì)菌組分的低頻分子運(yùn)動(dòng)之間的相互作用， 產(chǎn)生細(xì)菌特定光譜特征， 使得太赫茲光譜能夠用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞。 THz光譜能夠表征細(xì)胞成分的差異， 成為一種快速、 無(wú)標(biāo)簽的細(xì)菌檢測(cè)方法。 余聞靜等[47]利用太赫茲光譜對(duì)不同致病菌進(jìn)行檢測(cè)， 表明不同致病菌具有不同的生物成分組成和結(jié)構(gòu)。 Mazhorova等[48]利用一種懸浮磁芯太赫茲光纖基模消逝場(chǎng)的大腸桿菌傳感器， 檢測(cè)濃度在104～109cfu·mL-1范圍內(nèi)的大腸桿菌， 檢測(cè)限達(dá)到104cfu·mL-1。 Yang等[49]利用THz光譜區(qū)分四種細(xì)菌， 同時(shí)快速評(píng)估被測(cè)細(xì)菌的生存狀態(tài)。

4 總結(jié)與展望

光譜檢測(cè)技術(shù)具有低能量、 無(wú)創(chuàng)、 無(wú)損、 響應(yīng)時(shí)間快和便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)， 有望成為一類快速、 簡(jiǎn)便的水源性病原菌檢測(cè)與鑒別的方法。 各自光譜檢測(cè)技術(shù)在病原菌檢測(cè)中取得良好的效果， 但也各有利弊。 (1)紫外可見(jiàn)光譜技術(shù)， 由于已商業(yè)化的紫外可見(jiàn)光譜儀器結(jié)構(gòu)緊湊， 價(jià)格便宜， 性能穩(wěn)定， 使得該技術(shù)在水環(huán)境微生物污染監(jiān)測(cè)應(yīng)用中很有吸引力。 但由于水體病原菌對(duì)光產(chǎn)生散射效應(yīng)， 光譜解析存在較大的困難。 (2)熒光光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)水體病原菌的檢測(cè)， 已有實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和商業(yè)化的檢測(cè)儀器， 如TECTA[50]和Shaw水系統(tǒng)[51]， 自動(dòng)化的檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)， 易于操作， 能夠節(jié)省技術(shù)人員時(shí)間。 但需要昂貴的熒光試劑， 并存在光漂白以及特異性問(wèn)題； (3)紅外光譜包含水體病原菌較全面的化學(xué)信息(核酸、 蛋白質(zhì)、 脂類和糖等)， 可以對(duì)病原菌進(jìn)行快速可靠分析， 同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌微生物損傷。 但由于水對(duì)紅外光吸收很強(qiáng)， 會(huì)掩蓋光譜中出現(xiàn)的微生物重要信息； (4)拉曼光譜技術(shù)只需要小面積和少量的樣品， 實(shí)現(xiàn)單個(gè)病原菌的測(cè)量， 同時(shí)由于光譜對(duì)水不敏感， 有望提供病原菌的組成、 結(jié)構(gòu)和含量等信息。 但光譜信號(hào)較弱， 微生物內(nèi)部分生物分子在拉曼散射區(qū)發(fā)出熒光， 造成明顯地光譜干擾。 (5)太赫茲光譜技術(shù)具有測(cè)量快速、 操作簡(jiǎn)單、 免試劑和攜帶方便等特點(diǎn)， 同時(shí)能夠監(jiān)測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的微小形態(tài)變化。 但由于太赫茲輻射波長(zhǎng)與細(xì)菌大小不匹配， 使得靈敏度受限， 同時(shí)太赫茲光譜強(qiáng)吸水性， 細(xì)胞外的水影響了病原菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性。 可見(jiàn)， 在選擇水源性病原菌監(jiān)測(cè)的光譜技術(shù)時(shí)， 必須考慮病原菌本身特性、 監(jiān)測(cè)目的(鑒定、 定量和控制)和成本等各種因素， 進(jìn)而選擇合適的光譜技術(shù)和相關(guān)的采集方式。

與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比， 光譜技術(shù)對(duì)水體病原菌檢測(cè)具有快速、 無(wú)損、 連續(xù)在線檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)， 但當(dāng)前用于水源性病原菌檢測(cè)的光譜技術(shù)的病原菌種類較少， 適用范圍較窄。 另外， 某些目標(biāo)病原菌的檢出限、 靈敏度無(wú)法滿足當(dāng)前水質(zhì)監(jiān)測(cè)要求。 而且大多數(shù)水源性病原菌光譜檢測(cè)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室取得了良好效果， 對(duì)于實(shí)際水環(huán)境的應(yīng)用還存在著一定的難度， 需要考慮其他各類污染物的影響。 因此， 基于光譜技術(shù)用于水體病原菌檢測(cè)需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步研究： (1)進(jìn)一步探究水體其他物質(zhì)(有機(jī)物、 藻類， 無(wú)機(jī)鹽等)對(duì)病原菌光譜的影響， 采取合適的實(shí)驗(yàn)方法或光譜分析手段去除其他物質(zhì)對(duì)目標(biāo)光譜的干擾。 (2)各種光譜技術(shù)具有各自獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)， 將多種光譜技術(shù)優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)開(kāi)發(fā)更先進(jìn)的檢測(cè)系統(tǒng)， 實(shí)現(xiàn)對(duì)水體病原菌快速準(zhǔn)確檢測(cè)。 (3)開(kāi)發(fā)便攜化、 小型化、 自動(dòng)化病原菌檢測(cè)儀器。 現(xiàn)有的光譜病原菌檢測(cè)技術(shù)大多依賴于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境， 復(fù)雜的水體環(huán)境要求檢測(cè)儀器能夠滿足樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)， 便攜式的儀器將有利于對(duì)某些突發(fā)狀況、 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)分析等。 (4)由于水體病原菌部分光譜檢測(cè)技術(shù)還處于研究初期， 研究進(jìn)一步提高光譜技術(shù)測(cè)量微生物的靈敏度和準(zhǔn)確度， 從而測(cè)量低濃度病原體的環(huán)境樣品， 有望實(shí)現(xiàn)對(duì)水體病原菌高靈敏檢測(cè)。