賈光輝，丁一冰，趙永強(qiáng)，高增潤(rùn)

（內(nèi)蒙古烏蘭察布市中心醫(yī)院普通外科，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC） 是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，也是我國(guó)腫瘤發(fā)病率上升最快的腫瘤之一[1]。雖然不斷有新的方法應(yīng)用于臨床，但是結(jié)直腸癌患者的5年生存率仍不足30%，分析結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制對(duì)于臨床診斷和治療具有重要意義[2]。TGF-β 通路是促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要通路，SMAD4 蛋白是該通路的下游終點(diǎn)蛋白，其可通過(guò)促進(jìn)促癌因子的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[3]，若SMAD4 蛋白的表達(dá)水平被抑制，則TGF-β 通路就會(huì)被阻斷[4]。Runt 相關(guān)轉(zhuǎn) 錄因子3 （Runt-related transcription factor 3，RUNX3） 是一種參與上皮細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，其參與調(diào)節(jié)了多種促癌或者抑癌基因的轉(zhuǎn)錄[5]。臨床研究顯示結(jié)直腸癌組織中RUNX3 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，提示其抑癌作用[6]，但是抑制結(jié)直腸癌的機(jī)制是否與TGF-β/SMAD4 通路有關(guān)仍不清楚。綜上，本文主要分析RUNX3 和SMAD4 參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2019年6月—2021年6月間內(nèi)蒙古烏蘭察布市中心醫(yī)院普通外科收治的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者臨床及病理資料、患者腫瘤組織或者癌旁正常組織（距離腫瘤外緣>3 cm），在-80 ℃下保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡在40~65 歲之間；⑵經(jīng)過(guò)組織學(xué)檢驗(yàn)確診為結(jié)直腸癌；⑶知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴組織收集前3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)抗腫瘤相關(guān)治療；⑵合并其他惡性腫瘤、血液學(xué)疾病、感染或其他炎癥；⑶合并其他消化道疾病。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古烏蘭察布市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[2020-11]。最終納入患者98例，其中男52例，女46例；年齡41~65 歲，平均（49.42±3.71）歲。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480 （ATCC 公司，美國(guó)）。DMEM 培養(yǎng)基血清和抗體（Invitrogen 公司，美國(guó)）。TRIzol 和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，美國(guó)）。One-Step qRT-PCR Kit 試劑盒（北京CWBIO 公司，美國(guó)）。RUNX3 和SMAD4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，以及陰性對(duì)照（NC） 質(zhì)粒（GenePharma 公司，中國(guó)）。LipofectamineTM2000 （Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)）。RUNX3 抗體（Abcam 公司，美國(guó)）。PVDF 膜（Bio-Rad 公司，美國(guó)）。

1.3 細(xì)胞處理

SW480 細(xì)胞均培養(yǎng)在DMEM 完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL 的鏈霉素和100 U/mL 的青霉素。將細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃和95%濕度下培養(yǎng)。

將細(xì)胞分為對(duì)照組、RUNX3 組、SMAD4 組和RUNX3+SMAD4 組。通過(guò)轉(zhuǎn)染，過(guò)表達(dá)RUNX3 和（或）SMAD4。細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%匯合后，添加Opti （100 μL） 和LipofectamineTM2000（5 μL）并孵育5 min 作為試劑A。加 入Opti （100 μL） 和RUNX3 和/或SMAD4 質(zhì)粒（20 ng/μL）并孵育5 min 作為試劑B。將A 和B混合在一起并孵育20 min。16 h 后，更換培養(yǎng)基并收獲細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)染等量的陰性對(duì)照質(zhì)粒作為對(duì)照。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 Western blot 組織樣本或者細(xì)胞研磨后裂解，通過(guò)離心（4 ℃，12 000 r/min，5 min） 收集總蛋白。通過(guò)8%的SDS-PAGE 分離每個(gè)樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。利用脫脂牛奶（5%，2 h）進(jìn)行封閉。隨后，將膜與1∶800 稀釋的RUNX3 或 者SMAD4 抗體 在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后將膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One 軟件分析灰度計(jì)算RUNX3 和SMAD4 蛋白相對(duì)于GAPDH 的表達(dá)量。

1.4.2 qRT-PCR TRIzol 被用于提取組織或者細(xì)胞中總RNA，使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 合成互補(bǔ)DNA，然后通過(guò)One-Step qRT-PCR Kit 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95 ℃30 s、95 ℃5 s和60 ℃30 s。內(nèi)參為GAPDH，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算SMAD4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將100 μL 的細(xì)胞懸浮液添加到96 孔板的孔中，孵育48 h 和72 h 后，將體積為10 μL 的CCK-8 溶液添加到每個(gè)孔中并孵育2 h。在450 nm 波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的光密度（OD）值。

1.4.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲 在37 ℃下將細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清DMEM 中將細(xì)胞（5×104細(xì)胞/mL）進(jìn)行血清饑餓處理24 h。然后將細(xì)胞接種到24 孔Transwell 裝置的上部腔室中，將含有15%胎牛血清的DMEM 充滿下部腔室。24 h 后，清洗掉未侵入的細(xì)胞，并將滲透到下腔室中的細(xì)胞用95%乙醇固定，并在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

設(shè)立3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。使用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組間比較使用方差檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。Pearson 檢驗(yàn)用于分析RUNX3 與SMAD4 的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RUNX3 與SMAD4 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)

結(jié)直腸癌組織中的RUNX3 蛋白表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（P<0.05），而SMAD4 mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織（均P<0.05）。結(jié)直腸癌組織中RUNX3 蛋白分別與SMAD4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=0.511，P=0.004；r=0.487，P=0.009）（圖1）（表1）。

圖1 Western blot檢測(cè)結(jié)直腸癌組織與癌旁組織RUNX3和SMAD4蛋白表達(dá)Figure 1 Western blot detection of RUNX3 and SMAD4 protein expressions in colorectal cancer and adjacent tissues

表1 RUNX3 蛋白與SMAD4 mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)量（± s）Table 1 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein(± s)

表1 RUNX3 蛋白與SMAD4 mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)量（± s）Table 1 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein(± s)

注：1）與癌旁正常組織比較，P<0.05Notes：1)P<0.05 vs.normal tissue adjacent to cancer

images/BZ_87_213_3050_470_3107.pngimages/BZ_87_470_3050_703_3107.pngimages/BZ_87_703_3050_936_3107.png組別癌旁正常組織結(jié)直腸癌組織RUNX3 1.00±0.18 0.31±0.051）SMAD4 mRNA 1.00±0.15 4.12±0.671）SMAD4蛋白1.00±0.15 3.34±0.521）

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中RUNX3、SMAD4 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，RUNX3 組的RUNX3 蛋白水平均明顯升高，但SMAD4 mRNA 和蛋白水平明顯降低（均P<0.05）；SMAD4 組的SMAD4 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平明顯升高（均P<0.05），但RUNX3 蛋白水平無(wú)明顯變化（P>0.05）；RUNX3+SMAD4 組的RUNX3蛋白水平均明顯升高（P<0.05），SMAD4 mRNA 和蛋白水平變化不明顯（均P>0.05）（圖2）（表2）。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中RUNX3 與SMAD4 蛋白的表達(dá)Figure 2 Western blot detection of the RUNX3 and SMAD4 protein expressions in each group of cells

表2 各組細(xì)胞中RUNX3蛋白、SMAD4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量（± s）Table 2 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein in each group of cells(± s)

表2 各組細(xì)胞中RUNX3蛋白、SMAD4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量（± s）Table 2 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein in each group of cells(± s)

注：1）與對(duì)照組比較，P<0.05；2）與SMAD4 組比較，P<0.05；3）與RUNX3組比較，P<0.05Notes：1) P<0.05 vs. control group; 2) P<0.05 vs. SMAD4 group;3)P<0.05 vs.RUNX3 group

images/BZ_87_1288_2168_1593_2225.pngimages/BZ_87_1288_2282_1593_2339.pngimages/BZ_87_1593_2168_1807_2225.pngimages/BZ_87_1593_2282_1807_2339.pngimages/BZ_87_1807_2168_2052_2225.pngimages/BZ_87_1807_2282_2052_2339.png組別對(duì)照組RUNX3組SMAD4組RUNX3+SMAD4組RUNX3蛋白1.00±0.08 3.92±0.361）1.03±0.07 3.98±0.351），2）SMAD4 mRNA 1.00±0.07 0.21±0.021）3.56±0.311）1.03±0.092），3）SMAD4蛋白1.00±0.06 0.24±0.021）3.24±0.281）0.96±0.082），3）

2.3 RUNX3 和SMAD4 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞增殖能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RUNX3 組細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組（P<0.05），SMAD4 組的細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組（P<0.05），RUNX3+SMAD4 組的細(xì)胞增殖能力明顯高于RUNX3 組，但明顯低于SMAD4 組（P<0.05），與對(duì)照組間無(wú)明顯差異（P>0.05）（表3）。

表3 RUNX3和SMAD4對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響（± s）Table 3 Effects of RUNX3 and SMAD4 on the proliferation of colorectal cancer cells(± s)

表3 RUNX3和SMAD4對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響（± s）Table 3 Effects of RUNX3 and SMAD4 on the proliferation of colorectal cancer cells(± s)

注：1）與對(duì)照組比較，P<0.05；2）與RUNX3 組比較，P<0.05；3）與SMAD4組比較，P<0.05Notes：1) P<0.05 vs. control group; 2) P<0.05 vs. RUNX3 group;3) P<0.05 vs.SMAD4 group

images/BZ_88_213_572_599_629.pngimages/BZ_88_213_686_599_743.pngimages/BZ_88_599_572_896_629.pngimages/BZ_88_599_686_896_743.png組別對(duì)照組RUNX3組SMAD4組RUNX3+SMAD4組48 h 0.67±0.05 0.55±0.061）0.79±0.081）0.69±0.082），3）72 h 1.20±0.10 0.97±0.111）1.39±0.121）1.25±0.112），3）

2.4 RUNX3 和SMAD4 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響

各組細(xì)胞侵襲能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RUNX3 組細(xì)胞侵襲能力明顯低于對(duì)照組（P<0.05），SMAD4 組的細(xì)胞侵襲能力明顯高于對(duì)照組（P<0.05），RUNX3+SMAD4 組的細(xì)胞侵襲能力明顯高于RUNX3 組，但明顯低于SMAD4 組（均P<0.05），與對(duì)照組間無(wú)明顯差異（P>0.05）（表4）（圖3）。

表4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的影響（± s）Table 4 Number of the invaded cells of each group(± s)

表4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的影響（± s）Table 4 Number of the invaded cells of each group(± s)

注：1）與對(duì)照組比較，P<0.05；2）與RUNX3 組比較，P<0.05；3）與SMAD4組比較，P<0.05Notes：1) P<0.05 vs. control group; 2) P<0.05 vs. RUNX3 group;3) P<0.05 vs.SMAD4 group

images/BZ_88_1288_892_1742_949.pngimages/BZ_88_1288_1006_1742_1063.png組別對(duì)照組RUNX3組SMAD4組RUNX3+SMAD4組侵襲細(xì)胞數(shù)目（個(gè)）58.34±2.06 24.15±1.421）127.36±3.851）55.37±2.572），3）

圖3 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 A：對(duì)照組；B：RUNX3組；C:SMAD4組；D：RUNX3+SMAD4組Figure 3 Invasion ability of each group of cells detected by Transwell assay A: Control group; B: RUNX3 group;C:SMAD4group;D:RUNX3+SMAD4 group

3 討 論

結(jié)直腸癌以40~50 歲年齡段發(fā)病率最高[7-8]。盡管近年來(lái)檢測(cè)方法、放療、化療和內(nèi)鏡技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，但結(jié)直腸癌的5年生存率仍然較差[9-10]。研究結(jié)直腸癌相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制具有重大現(xiàn)實(shí)意義。本研究旨在討論RUNX3 與TGF-β/SMAD4 信號(hào)通路的關(guān)系，以及RUNX3 在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用機(jī)制。

RUNX3 蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，研究[11-12]表明其可與許多增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的核心位點(diǎn)5'-PYG PYG GT-3'結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄水平。RUNX3 在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，如胰腺癌[13-14]、食道癌[15-16]、腎癌等[17-18]。最近研究也顯示RUNX3 也與結(jié)直腸癌有關(guān)，如Li 等[19]的研究顯示RUNX3 基因結(jié)直腸癌組織中顯著下調(diào)，并且與結(jié)直腸癌的分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，也有研究[20]顯示RUNX3 通過(guò)上調(diào)結(jié)直腸癌中的DR5 增強(qiáng)TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究收集了98例結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織，通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RUNX3 蛋白在結(jié)直腸癌組織低表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了RUNX3 過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)RUNX3 蛋白升高會(huì)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，RUNX3 的降低與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，提高RUNX3 則會(huì)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

為進(jìn)一步分析RUNX3 抑制結(jié)直腸癌的機(jī)制，本研究也檢測(cè)了TGF-β 信號(hào)通路中SMAD4 的水平。SMAD4 是TGF-β 信號(hào)的終點(diǎn)蛋白，TGF-β 信號(hào)通路的激活會(huì)最終引起SMAD4 蛋白的功能激活，而直接抑制SMAD4 蛋白的表達(dá)水平則可從根本上阻斷TGF-β 信號(hào)通路[21-23]。SMAD4 是一種促癌蛋白，研究顯[24-25]示在結(jié)直腸癌中，SMAD4 顯著高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌患者的惡性病理特點(diǎn)和不良預(yù)后有關(guān)。體外研究[26]也證實(shí)了提高SMAD4 的表達(dá)會(huì)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中的SMAD4 mRNA 和蛋白水平顯著高于癌旁正常組織，且SMAD4 mRNA 和蛋白水平均與RUNX3 蛋白負(fù)相關(guān)，這提示RUNX3 可能負(fù)調(diào)控SMAD4 的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究利用結(jié)直腸癌細(xì)胞構(gòu)建了RUNX3 和（或）SMAD4 過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)RUNX3 會(huì)抑制SMAD4 mRNA 和蛋白的水平；而過(guò)表達(dá)SMAD4 不僅顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，還會(huì)顯著的削弱RUNX3 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用。在另一種消化系統(tǒng)腫瘤—胰腺癌相關(guān)研究[27-29]中也顯示，RUNX3 與SMAD4 的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，且與不良預(yù)后有關(guān)。腎癌相關(guān)研究[30]亦顯示，可通過(guò)微小RNA-93 抑制RUNX3 蛋白的表達(dá)，從而抑制SMAD4 的表達(dá)，提高細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。結(jié)合既往文獻(xiàn)與本研究結(jié)果，推測(cè)結(jié)直腸癌中RUNX3 蛋白的降低會(huì)導(dǎo)致SMAD4 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的升高，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

然而，本研究也有一定的局限性，關(guān)于RUNX3 和SMAD4 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系仍需要擴(kuò)大樣本，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)行分析；RUNX3 通過(guò)調(diào)控SMAD4 抑制結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制仍需行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，RUNX3 可通過(guò)抑制SMAD4 抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，提示RUNX3 可能成為診斷和治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。