李博，趙強(qiáng)子，黎建軍

（武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院/武漢市普仁醫(yī)院普通外科，湖北武漢430081）

膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的癌癥，根據(jù)解剖位置可分為肝內(nèi)、肝外和肝門部膽管癌[1]。盡管膽管癌是一種少見(jiàn)的癌癥，但近幾十年來(lái)，其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)迅速增加[2]。膽管癌惡性程度高，手術(shù)是唯一有效的治療方法，但只有15%的膽管癌患者接受手術(shù)治療[3]。膽管癌患者確診后的總生存時(shí)間僅6~24個(gè)月，膽管癌患者術(shù)后中位生存時(shí)間為27~36個(gè)月[4]。鑒于此，探討膽管癌發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)明確診斷及改善預(yù)后尤為重要[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其是癌癥細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬和耐藥性等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[6-7]。lncRNA MCM3AP-AS1 （MCM3 AP-AS1）是最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。在原發(fā)性肝細(xì)胞癌[8]、乳腺癌[9]中上調(diào)表達(dá)，并調(diào)控癌細(xì)胞增殖和侵襲等過(guò)程。盡管如此，MCM3AP-AS1 在膽管癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制尚知之甚少。本研究旨在膽管癌細(xì)胞系中研究MCM3AP-AS1 的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討其余Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 信號(hào)通路以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

膽管癌細(xì)胞株（CCLP、 RBE、 9810、HuCCT1）及人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞株HIBEC（普諾賽公司，中國(guó)武漢）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)）、TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific 公司）、Nano Drop ND-1000 紫外/可見(jiàn)光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific 公司）、蛋白印跡試劑盒（上海碧云天生物公司）、MTT 細(xì)胞增殖試劑盒（日本Dojindo公司）、Transwell 試劑盒（中國(guó)Corning 公司）、E-cadherin 一抗（美國(guó)Santa Cruz 公司）、vimentin 一抗（美國(guó)cell signaling 公司）、STAT3 及p-STAT3 一抗（美國(guó)BD 公司）、JAK1/2 及p-JAK1/2 一抗（美國(guó)abcam 公司）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公 司、GAPDH 一 抗（武漢博士德生物公司）、羊抗兔二抗（武漢博士德生物公司）、Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司、qRT-PCR SuperMix 試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司。MCM3AP-AS1 引物序列由上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，針對(duì)MCM3AP-AS1 設(shè)計(jì)的短干擾RNA（siRNA） 和其陰性對(duì)照序列（MCM3AP-AS1 無(wú)義序列）均由上海生物工程技術(shù)有限公司提供，序列正向：5'-CCC TCA GGT GAC TAC AGA T-3'，反向：5'-GCA ACA TGC TTC ACT GTCT-3'。MCM3AP-AS1 對(duì)照無(wú)義序列為5'-GAG CAG ATA GCT GAA GAG AGA-3'。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

膽管癌細(xì)胞株 （CCLP、 RBE、 9810、HuCCT1）及HIBEC 均培養(yǎng)于含胎牛血清的培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。對(duì)CCLP 細(xì)胞系添加5 μL Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染MCM3AP-AS1 短干擾RNA（siRNA）和陰性對(duì)照序列（MCM3AP-AS1 無(wú)義序列），并分成MCM3APAS1 沉默組和陰性對(duì)照組，培養(yǎng)6 h 后，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。后期功能拯救實(shí)驗(yàn)中，在MCM3AP-AS1 沉默組中加入JAK/STAT3 通路激動(dòng)劑LIF，CCLP 細(xì)胞依此分為3 組：陰性對(duì)照組、MCM3AP-AS1 沉默組和MCM3AP-AS1 沉 默+LIF 組。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

采用TRIzol 試劑盒分別從各組細(xì)胞中提取總RNA。Nano Drop ND-1000 紫外/可見(jiàn)光度計(jì)用于評(píng)估RNA 純度。 使用實(shí)時(shí)PCR 儀器測(cè)定各組MCM3AP-AS1 相對(duì)表達(dá)量。MCM3AP-AS1 qRT-PCR引物序列正向：5'-CAC ACG CAT GGA AAA CCC AG-3'，反向：5'-GAG GAC CTG AGC TGT AAG CC-3'，內(nèi)參GAPDH 引物序列正向：5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3'，反向：5'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3'。2-ΔΔCT法用于計(jì)算MCM3AP-AS1 相對(duì)表達(dá)量，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT 實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估細(xì)胞增殖能力，先將MCM3AP-AS1 沉默組和陰性對(duì)照組培養(yǎng)于96 孔板中（3×103/孔），然后在0、24、48、72 h 后加入100 μL MTT 試劑，在DYNEX MUM 酶標(biāo)儀下測(cè)定每組在490 nm 處的吸光度值（A490 nm）。后期拯救實(shí)驗(yàn)中，在MCM3AP-AS1 沉默組、陰性對(duì)照組及MCM3AP-AS1 沉默+LIF 組中分別加入100 μL MTT 試劑，并測(cè)定A490 nm 值。繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲能力

細(xì)胞侵襲能力評(píng)估采用Transwell 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前將20 μL 混合液（1∶8 matrigel 膠:培養(yǎng)基）添加至上室，在37 ℃下保持30 min，然后將200 μL 無(wú)FBS 培養(yǎng)基的4×104個(gè)細(xì)胞填于上室，700 μL 10%FBS 培養(yǎng)基填于下室，然后按每組1×105個(gè)細(xì)胞加入上室，37 ℃孵育48 h 后，結(jié)晶紫染色并在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取均值。

1.6 Western blot測(cè)定蛋白表達(dá)量

將MCM3AP-AS1 沉默組和陰性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，裂解細(xì)胞并加入蛋白酶抑制劑，將蛋白沸水中高溫變性，測(cè)定蛋白濃度，并按60 μg/孔蛋白樣品上樣電泳，恒壓80 V 30 min，100 V 2 h，溴酚藍(lán)跑到底即可。隨后，切膠并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，在4 ℃下分別與E-cadherin 一抗（1∶300）、vimentin 一抗（1∶200）、STAT3 及p-STAT3 一抗（1∶400）、JAK1/2 及p-JAK1/2 一抗（1∶300）、GAPDH 一抗（1∶400）在4 ℃下孵育過(guò)夜，用TBST 緩沖液漂洗10 min，漂洗3 次。加入羊抗鼠二抗（1∶900）在室溫下孵育1 h，隨后用TBST 緩沖液漂洗10 min，漂洗3 次。加ECL 液至PVDF 膜上，在暗室下曝光，用Image J軟件計(jì)算目標(biāo)條帶的灰度值，目的蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Prism Graphpad 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上，兩組間的比較采用LSD-T檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCM3AP-AS1在膽管癌細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果示，膽管癌細(xì)胞系CCLP、RBE、9810 及HuCCT1 中MCM3AP-AS1 表達(dá)量分別為7.1±0.4、 6.8±0.4、 6.6±0.2 及 6.4±0.3， HIBEC 中MCM3AP-AS1 表達(dá)量為1.5±0.2，膽管癌細(xì)胞系CCLP、RBE、9810 及HuCCT1 中MCM3AP-AS1 表 達(dá)量高于HIBEC（均P<0.05）（圖1），本研究采用膽管癌細(xì)胞系CCLP 行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

圖1 MCM3AP-AS1 在膽管癌細(xì)胞系和正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)比較Figure 1 Comparison of the expressions of MCM3AP-AS1 in cholangiocarcinoma cell lines and normal intrahepatic bile duct epithelial cell line

2.2 下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，CCLP 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNAMCM3AP-AS1 后，MCM3AP-AS1 沉默組的MCM3APAS1 表達(dá)量低于陰性對(duì)照組（1.8±0.1vs.7.1±0.3，P<0.05），提示轉(zhuǎn)染成功，可行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2A）。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)后，MCM3AP-AS1沉默組在轉(zhuǎn)染后24、 48、 72 h，A490 nm值低于陰性對(duì)照組（均P<0.05）（圖2B）。

圖2 下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響 A：MCM3AP-AS1 沉默效率測(cè)定；B：陰性對(duì)照組與MCM3APAS1沉默組增殖曲線比較Figure 2 The effect of down-regulation of MCM3AP-AS1 expression on the proliferation of cholangiocarcinoma cells A: MCM3AP-AS1 silencing efficiency assay; B: Comparison of the proliferation curves between negative control group and MCM3AP-AS1 silencing group

2.3 下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCM3AP-AS1 沉默組的侵襲細(xì)胞數(shù)為140.3±10.2，陰性對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為270.3±11.4，MCM3AP-AS1 沉默組的侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組（P<0.05）（圖3）。

圖3 下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲的影響 A：MCM3AP-AS1 沉默組與陰性對(duì)照組的Transwell 實(shí)驗(yàn)比較；B：MCM3AP-AS1沉默組與陰性對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)比較Figure 3 The effect of down-regulation of MCM3AP-AS1 expression on the invasion of cholangiocarcinoma cells A:Comparison of Transwell assay between MCM3AP-AS1 silencing group and negative control group;B:Comparison of the number of invasive cells between MCM3AP-AS1 silencing group and negative control group

2.4 下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路及EMT蛋白的影響

Western blot 結(jié)果顯示，MCM3AP-AS1 沉默組STAT3 表達(dá)量與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.32±0.11vs. 1.32±0.12，P>0.05），MCM3AP-AS1沉默組p-STAT3 表達(dá)量低于陰性對(duì)照組（0.51±0.07vs. 1.80±0.12，P<0.05）。MCM3AP-AS1沉默組JAK1/2 表達(dá)量與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.27±0.16vs. 1.22±0.13，P>0.05），MCM3AP-AS1沉默組p-JAK1/2 表達(dá)量低于陰性對(duì)照組（0.64±0.08vs. 1.91±0.19，P<0.05）。MCM3AP-AS1 沉默組E-cadherin 表達(dá)量高于陰性對(duì)照組（1.81±0.04vs.0.42±0.03，P<0.05），MCM3AP-AS1 沉默組vimentin表達(dá)量低于陰性對(duì)照組（0.61±0.07vs. 1.41±0.17，P<0.05）（圖4）。

圖4 下調(diào)MCM3AP-AS1表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)JAK/STAT信號(hào)通路及EMT相關(guān)蛋白的影響 A：Western blot結(jié)果；B：蛋白表達(dá)量比較Figure 4 The effect of down-regulation of MCM3AP-AS1 on expressions of proteins associated with the JAK/STAT3 signaling pathway and EMT process in cholangiocarcinoma cells A: Western blot results; B: Comparison of the protein expression levels

2.5 JAK/STAT3通路激動(dòng)劑LIF拯救實(shí)驗(yàn)對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)示，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，陰性對(duì)照組和MCM3AP-AS1 沉默+LIF 組A490 nm 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），MCM3AP-AS1 沉默組A490 nm 值低于陰性對(duì)照組（均P<0.05）（圖5）。

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)增殖能力的比較Figure 5 Comparison of proliferation abilities of three groups at different time points

2.6 JAK/STAT3通路激動(dòng)劑LIF拯救實(shí)驗(yàn)對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)示，陰性對(duì)照組和MCM3AP-AS1沉默+LIF 組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（270.4±10.8）個(gè)vs.（265.4±11.6）個(gè)，P>0.05]，MCM3APAS1 沉默組侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組[（141.5±12.5）個(gè)vs.（270.4±10.8）個(gè)，P<0.05]（圖6）。

圖6 各組侵襲能力的比較 A：各組Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較；B：各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較Figure 6 Comparison of the invasion abilities among the three groups A:Comparison of the results of Transwell assay among the three groups;B:Comparison of the numbers of invasive cells among the three groups

3 討 論

膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有癥狀隱匿、惡性程度高的特點(diǎn)，確診時(shí)常處于中晚期，除手術(shù)治療外，其他治療方式療效有限，預(yù)后差[10-12]?，F(xiàn)代腫瘤學(xué)發(fā)現(xiàn)，腫癌的發(fā)生及進(jìn)展涉及一系列關(guān)鍵分子的異常表達(dá)，包括lncRNA CBR3-AS1[13]、 lncRNA MCM3AP-AS1、lncRNA RP1-85F18.6[14]等。

MCM3AP-AS1 基因定位于人染色體6p22.3 位點(diǎn)上。文獻(xiàn)報(bào)道MCM3AP-AS1 在多種腫瘤中起促癌基因的作用，在原發(fā)性肝細(xì)胞癌[8]中MCM3AP-AS1 表達(dá)水平上調(diào)，且可通過(guò)調(diào)控miR-194-5p/FOXA1 軸而促進(jìn)癌癥發(fā)生和進(jìn)展；MCM3AP-AS1 在乳腺癌[9]中上調(diào)表達(dá)，并通過(guò)調(diào)節(jié)miR-28-5p/CENPF 軸促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[15]中發(fā)現(xiàn)癌組織和體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞系中MCM3AP-AS1 表達(dá)水平上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)膽管癌細(xì)胞系中MCM3AP-AS1中表達(dá)水平顯著高于HIBEC，這與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道結(jié)果類似。進(jìn)一步通過(guò)RNA 干擾技術(shù)沉默膽管癌細(xì)胞系中MCM3AP-AS1 表達(dá)水平，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1 表達(dá)下調(diào)后，膽管癌細(xì)胞增殖和侵襲能力受到顯著抑制，上述結(jié)果顯示下調(diào)MCM3APAS1 表達(dá)水平可顯著抑制膽管癌細(xì)胞的惡性行為。在甲狀腺乳頭狀癌[16]中采用RNA 干擾技術(shù)沉默MCM3AP-AS1 表達(dá)水平后，體外培養(yǎng)的甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，癌細(xì)胞凋亡比例增加。在胰腺癌[17]中，癌組織和癌細(xì)胞系中MCM3AP-AS1 表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)沉默MCM3APAS1 表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力下降，且凋亡水平增加，其機(jī)制是MCM3AP-AS1 通過(guò)調(diào)控miR-138-5p 降低FOXK1 基因表達(dá)水平。在卵巢上皮細(xì)胞癌[18]中MCM3AP-AS1 表達(dá)水平上調(diào)后可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-143-3p/TAK1 軸而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。綜合文獻(xiàn)報(bào)道和本研究結(jié)果，提示MCM3AP-AS1 在多種不同類型癌癥中發(fā)揮癌基因功能，下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲。

膽管癌細(xì)胞增殖和侵襲與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活密切相關(guān)[19]，目前已知JAK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)與膽管癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)，特別是STAT3 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、細(xì)胞間黏附分子1 和基質(zhì)金屬蛋白酶9 表達(dá)，加速癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移[20-21]。JAK/STAT3 信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的下游通路，調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖、凋亡及侵襲，是包括膽管癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路[22-23]。文獻(xiàn)[24]報(bào)道在膽管癌中膜聯(lián)蛋白10 可促進(jìn)EMT 和激活STAT3，進(jìn)而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。在膽管癌中miR-490-3p 也可通過(guò)抑制STAT3/VEGFA 信號(hào)通路活性而抑制細(xì)胞增殖和血管生成[25]。事實(shí)上，lncRNA 和JAK/STAT3 關(guān)系密切，在結(jié)直腸癌[26]中下調(diào)lncRNA ITIH4-AS1 可抑制JAK/STAT3 信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞增殖和侵襲，且可被JAK/STAT3 激動(dòng)劑LIF 所拯救。在宮頸癌[27]中敲低lncRNA LINC00518可抑制JAK/STAT3 信號(hào)通路，從而抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究探討了膽管癌細(xì)胞系中MCM3APAS1 表達(dá)與JAK/STAT3 信號(hào)通路間的關(guān)系，結(jié)果顯示下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)后磷酸化JAK1/2 和磷酸化-STAT3 蛋白表達(dá)水平顯著降低，當(dāng)加入LIF 后，可部分恢復(fù)下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)對(duì)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，這與結(jié)直腸癌及宮頸癌中的結(jié)果類似。

JAK/STAT3 與EMT 過(guò)程有著密切的調(diào)控關(guān)系。在TGF-β、IL-6 等細(xì)胞因子的刺激下，JAK-STAT3級(jí)聯(lián)激活，STAT3 磷酸化及二聚體化，并進(jìn)入到細(xì)胞核，激活EMT 過(guò)程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail、Zeb1及Twist-1，并最終導(dǎo)致EMT 的發(fā)生[28]。目前公認(rèn)EMT 過(guò)程在膽管癌發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用，EMT 過(guò)程賦予細(xì)胞遷移和侵襲能力，其中EMT 過(guò)程中間質(zhì)相關(guān)蛋白過(guò)度表達(dá)是促進(jìn)膽管癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要驅(qū)動(dòng)因素，也是反映膽管癌不良預(yù)后的重要因素[29]。文獻(xiàn)[30]報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌中，通過(guò)上調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)可顯著促進(jìn)EMT 過(guò)程，加速癌細(xì)胞增殖和侵襲，抑制凋亡，且這種作用可通過(guò)上調(diào)miR-195-5p 表達(dá)而逆轉(zhuǎn)，即下調(diào)MCM3APAS1 表達(dá)后，體外培養(yǎng)的A549 細(xì)胞EMT 過(guò)程受到抑制，癌細(xì)胞凋亡比例增加。上述結(jié)果提示MCM3AP-AS1 可調(diào)控EMT 過(guò)程而參與癌細(xì)胞惡性行為。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)下調(diào)MCM3AP-AS1 后可抑制膽管癌EMT 過(guò)程，即上皮相關(guān)蛋白E-cadherin 表達(dá)水平增加，而間質(zhì)相關(guān)蛋白vimentin 表達(dá)水平下降，沉默MCM3AP-AS1 表達(dá)進(jìn)而抑制膽管癌侵襲過(guò)程可能與EMT 過(guò)程受抑制有關(guān)。

由于本研究只是體外研究，不可避免存在一定的不足，首先，MCM3AP-AS1 在膽管癌組織中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值值得進(jìn)一步研究； 其次，MCM3AP-AS1 在模式動(dòng)物中的功能也值得深入研究；最后，本研究只在功能上研究了加入LIF 后細(xì)胞增殖和侵襲功能的改變，未在通路蛋白水平上進(jìn)一步研究，這仍需進(jìn)一步深入。

綜上所述，MCM3AP-AS1 在膽管癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮致癌基因功能，下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)可通過(guò)抑制EMT 和JAK/STAT3 信號(hào)通路活性而抑制細(xì)胞增殖和侵襲，下調(diào)MCM3AP-AS1 表達(dá)可能有望成為膽管癌治療的新策略。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。