高叢，竇明金，隋繼英

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院<山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院>，山東 濟(jì)南 250031)

化療所致周圍神經(jīng)毒性(chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity，CIPN) 是目前臨床廣泛使用的鉑類、紫杉烷類、長春堿類等化療藥物常見不良反應(yīng)，其主要癥狀表現(xiàn)為針刺樣疼痛、燒灼感、手足麻木及觸覺減弱等。據(jù)報道20%～40%癌癥患者使用具有神經(jīng)毒性的化療藥物后會出現(xiàn)不同程度的CIPN[1]。CIPN可在化療期間急性發(fā)生，患者無法耐受時會減少化療藥物劑量或停止化療，干擾正常治療；同時對少部分患者可能造成永久性損害。CIPN發(fā)生機(jī)制錯綜復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一結(jié)論。目前有研究報道[2]其可能與膠質(zhì)細(xì)胞活化、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、離子通道改變、脫髓鞘、細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)改變、DNA損傷、炎癥因子、下行抑制系統(tǒng)功能降低和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化等多種機(jī)制有關(guān)[3]。目前對于CIPN患者的治療選擇十分有限，一般通過減少劑量或停止化療來進(jìn)行急性管理，尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療手段[4]。目前臨床常用預(yù)防和緩解CIPN的主要藥物有：神經(jīng)生長因子及細(xì)胞保護(hù)劑類、抗氧化劑類、維生素類、核苷酸類、鈣鎂合劑等[5]。

目前大量臨床研究轉(zhuǎn)向關(guān)注傳統(tǒng)中醫(yī)藥在降低神經(jīng)毒性方面產(chǎn)生的作用，以期改善患者生活質(zhì)量、提高患者對化療的耐受性和依從性。參麥注射液是參麥方的一種臨床應(yīng)用形式，源于古方“生脈散”的衍變，由傳統(tǒng)中藥紅參與麥冬兩味藥組成，主要活性成分為人參皂苷、麥冬皂苷和少量的麥冬多糖等。中醫(yī)理論認(rèn)為參麥方有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效[6]。參麥注射液臨床應(yīng)用于多種疾病，包括病毒性心肌炎、冠心病和粒細(xì)胞減少癥等，也常與化療藥物同用，提高機(jī)體免疫力，起到增效減毒的作用。近年來對中藥注射劑成分作用的研究愈加深入，其中人參皂苷已被多項臨床研究證實具有調(diào)節(jié)血管生成、保護(hù)心血管、興奮腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)以及增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，從而可實現(xiàn)改善全身臟器的供血、毛細(xì)血管微循環(huán)及抗凝作用。這是近年來解釋參麥注射液用于緩解CIPN的作用機(jī)制之一[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過融合系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、分子藥理學(xué)等多學(xué)科技術(shù)構(gòu)建整合“疾病-表型-基因-藥物”網(wǎng)絡(luò)，用于分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點的相互作用關(guān)系，進(jìn)而從系統(tǒng)、整體角度探索藥物與機(jī)體相互作用的一門新學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可用于揭示中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵、發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)、指導(dǎo)中藥新藥研發(fā)[8]。因此，本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析參麥注射液緩解CIPN的作用機(jī)制，在現(xiàn)有臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上提供細(xì)胞分子層面的參考。

1 方法

1.1 參麥方成分收集及靶點預(yù)測 以“紅參”“麥冬”為關(guān)鍵詞，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/index.php)以及中醫(yī)藥百科全書(ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索參麥注射液主要組分中的化學(xué)成分，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]報道進(jìn)行補(bǔ)充。

類藥性(druglikeness weight，DL值)是指化合物與已知藥物的相似性。由于常見中藥成分繁多復(fù)雜，因此利用類藥性數(shù)值，可篩選出成藥可能性較高的目標(biāo)成分[10]。借助 TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)平臺，篩選出紅參與麥冬中符合DL值≥0.18的化學(xué)成分作為目標(biāo)成分，并收集其潛在的靶點信息。

1.2 CIPN靶點收集篩選 以“chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity”“neurotoxicity of chemotherapy”為關(guān)鍵詞，在Disgenet(https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)以及GeneCards(https://www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫中檢索與CIPN相關(guān)的基因。

1.3 參麥成分與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 將“1.1”與“1.2”項下得到的參麥成分與CIPN的共同靶點，利用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，并對得到的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)的篩選 將“1.3”項下的共同靶點上傳至STRING 11.5(https://string-db.org)，設(shè)定物種智人(Homo sapiens)，置信度設(shè)為“medium confidence=0.4”，獲取蛋白相互作用的關(guān)系并保存PPI網(wǎng)絡(luò)文件。將網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中利用Network Analyzer功能進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，獲取度中心性(degree centrality)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)和緊密度(closeness centrality)的數(shù)據(jù)，利用以上3個參數(shù)的平均數(shù)值篩選PPI中的核心靶蛋白[11]，進(jìn)而得到蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction core network，PPICN)。

1.5 核心靶點的GO富集分析與KEGG通路分析 將“1.4”項下的核心靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)，輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，設(shè)定檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P<0.01，進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選 通過TCMSP、ETCM檢索以及文獻(xiàn)查找，搜集到紅參、麥冬中化合物組分共86個，其中紅參成分34個，麥冬成分52個，如表1所示。

表1 紅參-麥冬有效成分匯總

2.2 參麥注射液-CIPN靶點數(shù)據(jù)集構(gòu)建 通過Disgenet、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫搜集到紅參與麥冬活性化合物共334個作用靶點，CIPN相關(guān)基因共1 460個。通過在線韋恩圖得出參麥注射液與CIPN共有基因135個(見圖1)。

圖1 參麥-CIPN共同靶點

2.3 化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.9.1軟件，得到參麥成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。共有143個節(jié)點(即38個化合物節(jié)點與105個靶點節(jié)點)和234條邊。如圖2所示，紅色代表紅參成分，紫色代表麥冬成分，綠色代表靶點，每條邊表示紅參、麥冬成分與靶點之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選度值(degree)較大的節(jié)點進(jìn)行分析，這些度值較大節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵活性成分。經(jīng)統(tǒng)計，有26%的化合物的作用靶點≥10個。麥冬有效成分6個，占比60%。度值排名前10位的化合物見表2。

圖2 參麥成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 度值排名前10位的成分化合物

2.4 參麥-CIPN蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)(PPICN)的構(gòu)建 將參麥-CIPN靶點數(shù)據(jù)集中的靶點信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape軟件構(gòu)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析后，以“degree”“betweenness”和“closeness”的平均值作為篩選值。上述網(wǎng)絡(luò)中degree平均值為19.970 370 370 370 4，betweenness平均值為0.008 340 918 631 570 61，closeness平均值為0.485 526 621 226 082，選取同時滿足三個卡值的節(jié)點作為參麥-CIPN-靶點網(wǎng)絡(luò)的核心作用蛋白，共23個：GAPDH、IL-1β、PPARG、MMP9、AKT1、IL-6、TNF、PPARA、ABCB1、NR3C1、MAPK3、TP53、CASP3、CYP3A4、JUN、GSTP1、ESR1、HSPA8、DPP4、FOS、CREB1、AR、TRPV1。

將23個核心蛋白導(dǎo)入STRING得到PPICN(圖3)，共包含23個節(jié)點，188條邊，平均節(jié)點度值為16.3。

圖3 參麥注射液-CIPN蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點通路分析 將23個核心靶點輸入到Metascape工具中進(jìn)行GO富集分析(檢驗水準(zhǔn)P<0.01，靶點富集數(shù)目≥3，富集因子>1.5)。結(jié)果顯示GO條目34個，其中細(xì)胞組成(CC)相關(guān)的條目5個，生物過程(BP)條目相關(guān)的20個，分子功能(MF)相關(guān)的條目9個。

對GO-CC進(jìn)行聚類分析(見圖4)，主要涉及有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膜筏、富含ficolin-1的顆粒管腔、膜側(cè)、細(xì)胞前緣等。

圖4 GO富集分析-細(xì)胞成分

對GO-BP進(jìn)行聚類分析(見圖5)，主要涉及有細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、對異種刺激的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、磷酸鹽代謝過程的負(fù)調(diào)控、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、miRNA介導(dǎo)的基因沉默的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)、激素水平的調(diào)節(jié)、對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞活化、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、對酮的反應(yīng)、對輻射的反應(yīng)、破骨細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)、Ⅰ-κB激酶/NF-κB信號的調(diào)節(jié)、對含嘌呤化合物的反應(yīng)等。

圖5 GO富集分析-生物過程

對GO-MF進(jìn)行聚類分析(見圖6)，主要涉及：RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、R-SMAD結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、磷脂結(jié)合等。

圖6 GO富集分析-分子功能

KEGG通路富集分析得到9條信號通路(見圖7)，主要涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥途徑、非酒精性脂肪肝、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、前列腺癌、胰島素抵抗、長壽調(diào)節(jié)通路、甲狀腺癌、抗原加工和呈遞等。

圖7 KEGG信號通路分析

3 討論

CIPN屬于劑量限制性毒性反應(yīng)，隨著化療療程的推進(jìn)，藥物劑量持續(xù)累積，CIPN的癥狀表現(xiàn)也會隨之進(jìn)行性加重，甚至造成永久性神經(jīng)損傷。為保障患者化療后的生活質(zhì)量以及腫瘤治療的順利進(jìn)行，急需解決CIPN的防治難題。目前實際臨床用于治療CIPN的方法和藥物較多，但作用效果仍有待研究[12]。參麥注射液以紅參、麥冬為主要原料，經(jīng)現(xiàn)代制劑加工而成，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效，能加強(qiáng)機(jī)體器官抗應(yīng)激能力。參麥注射液與化療藥物合用時，有一定的減毒作用。姜超等[13]研究90例接受含奧沙利鉑方案化療的結(jié)直腸癌患者，在化療開始同時分別給予參麥注射液靜脈或口服甲鈷胺片比較兩組神經(jīng)毒性反應(yīng)發(fā)生情況及神經(jīng)傳導(dǎo)速度。結(jié)果顯示與口服甲鈷胺片比較，對于接受含奧沙利鉑輔助化療方案的結(jié)直腸癌患者，靜脈注射參麥注射液更能有效減少周圍神經(jīng)毒性反應(yīng)。張潔等[14]將125例應(yīng)用含紫杉醇化療方案化療的癌癥患者隨機(jī)分為2組，其中試驗組(64例)化療前1 d開始加用參麥注射液。結(jié)果試驗組神經(jīng)毒性發(fā)生率為26.6%(17/64)，對照組為57.4%(35/61)；周圍神經(jīng)功能測定，試驗組腓神經(jīng)運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)及感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)均優(yōu)于對照組，表明參麥注射液對含紫杉醇化療方案所致的周圍神經(jīng)毒性具有明顯的防治作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，得到參麥注射液對于改善CIPN癥狀相關(guān)的有效成分，包括腺苷、β-谷固醇、齊墩果酸、豆甾醇、花生酸、麥冬素A、刺五加苷A、麥冬素C、正二十四烷、人參皂苷Rh2等?；趶臄?shù)據(jù)庫獲得的作用靶點和疾病靶點，對兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行映射，得到“參麥-CIPN”數(shù)據(jù)集，對PPICN中的23個核心靶點用Metascape進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路分析，結(jié)果表明參麥注射液改善CIPN的生物過程主要涉及有細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、對異種刺激的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、磷酸鹽代謝過程的負(fù)調(diào)控、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、miRNA介導(dǎo)的基因沉默的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)、激素水平的調(diào)節(jié)、對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞活化、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、對酮的反應(yīng)、對輻射的反應(yīng)、破骨細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)、Ⅰ-κB激酶/NF-κB信號的調(diào)節(jié)、對含嘌呤化合物的反應(yīng)等。所作用的信號通路主要有脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、長壽調(diào)節(jié)通路抗原加工和呈遞等。

綜上，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念與方法，應(yīng)用多種生物信息數(shù)據(jù)庫和分析工具對參麥注射液的有效組分、作用靶點以及對CIPN作用機(jī)制進(jìn)行了探討。參麥注射液中對CIPN關(guān)鍵活性成分源自麥冬的組分占比60%，相比紅參，麥冬可能起到更重要的作用；GO富集分析與KEGG通路分析共獲得34個相關(guān)條目及9條相關(guān)信號通路，即參麥注射液通過多靶點與多通路的協(xié)同作用緩解CIPN。目前對于參麥注射液在CIPN領(lǐng)域應(yīng)用的研究較多，但通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其作用機(jī)制并不多見。同時由于本研究的結(jié)論仍需要進(jìn)一步分子對接等相關(guān)驗證，因此本文可為后續(xù)研究提供信息和依據(jù)。