趙曉娟，王珊珊，周佳燕，何越，周雅婷，楊秋茜

(鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224007)

肝腎綜合征常發(fā)生在嚴(yán)重肝病后期，是一組繼發(fā)于有效血容量下降、內(nèi)源性血管活性物質(zhì)失衡、腎血流量下降、以腎功能損傷為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。肝腎綜合征具有病情復(fù)雜、病死率高和預(yù)后差的特點(diǎn)[2]。目前臨床治療肝腎綜合征以藥物治療、腎臟替代治療、分子吸附再循環(huán)等作為肝移植前過(guò)渡手段，而肝移植作為唯一的最終治療方案[1]。但是器官來(lái)源不足嚴(yán)重制約肝移植的臨床應(yīng)用。因此，積極尋找安全有效的替代方案對(duì)防治肝腎綜合征具有重要的臨床意義。

由于毗鄰黃海，鹽城有著得天獨(dú)厚的黃海和灘涂資料，為探尋防治肝腎綜合征新型藥物提供了豐富的來(lái)源。天然海藻中含有豐富的硫酸多糖，由于其生物活性廣泛且安全性高，已然成為當(dāng)今海洋多糖類藥物研究的熱點(diǎn)[3]。滸苔(Enteromorphaprolifera)為大型綠藻，屬于石莼科滸苔屬?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，滸苔多糖的抗氧化、抗炎、抗脂質(zhì)蓄積的作用可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥性肝損傷[4]或非酒精性脂肪肝[4-5]，減輕環(huán)境污染誘發(fā)的肝毒性[6]；滸苔水提取物能明顯減輕糖尿病模型小鼠腎臟組織損傷[7]?？梢?jiàn)，滸苔多糖具有良好的肝腎保護(hù)活性。但是，滸苔多糖能否有效改善肝腎綜合征發(fā)病時(shí)的嚴(yán)重肝損傷及腎功能不全尚待研究。因此，本研究建立四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝腎綜合征模型[8]，研究滸苔多糖對(duì)小鼠肝腎綜合征的保護(hù)作用，為其在緩解肝腎綜合征的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 滸苔干粉購(gòu)自青島海大生物集團(tuán)有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)、總抗氧化能力(T-AOC)、羥脯氨酸、肌酐(Cr)、尿素(UA)和尿素氮(UN)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上?？菩艃x器有限公司，型號(hào)：ZFY-2L)；酶標(biāo)儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號(hào)：BIOBASE-EL10A)；真空冷凍干燥機(jī)(上海舜制儀器制造有限公司，型號(hào)：FD-2B-80)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，型號(hào)：KH-250B)；分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司，型號(hào)：1800)；臺(tái)式離心機(jī)(Sigma公司，型號(hào)：3K15)。

1.3 方法

1.3.1 滸苔多糖提取 稱取10 g滸苔干粉，加入800 mL超純水，90 ℃超聲1 h后再經(jīng)90 ℃恒溫水浴4 h。抽濾，取上清液濃縮至80 mL。加入240 mL無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜。5 000 rpm離心15 min，收集沉淀溶解于50 mL超純水，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入50.0 mL Sevage去蛋白質(zhì)試劑，劇烈振搖15 min，靜置30 min，棄去有機(jī)溶劑層和蛋白質(zhì)層，再加入50.0 mL Sevage試劑。重復(fù)以上操作，直至沒(méi)有白色的蛋白質(zhì)層為止。在去蛋白后的溶液中加入150 mL無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，流水透析24 h，真空干燥得滸苔多糖。

1.3.2 滸苔多糖中糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定提取的滸苔多糖中糖含量。配制0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和5%苯酚溶液備用。取6支試管依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水補(bǔ)齊到1 mL。然后向所有試管中加入5%苯酚溶液0.5 mL，再緩慢加入濃硫酸2.5 mL，混勻。靜置20 min后，在485 nm處測(cè)定OD485。以O(shè)D485為縱坐標(biāo)，葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確配制0.1 mg·mL-1的滸苔多糖溶液，準(zhǔn)確吸取0.3 mL于試管中，超純水補(bǔ)齊到1 mL。按上述苯酚-硫酸法測(cè)定滸苔多糖溶液OD485，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得溶液中糖含量。

1.3.3 肝腎綜合征模型建立及藥物干預(yù) 雌性昆明小鼠(20～22 g)，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2019-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院動(dòng)物房，使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2018-0008，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，每天12 h/12 h明暗交替(9∶00至21∶00開(kāi)燈)。動(dòng)物自由攝取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料與飲用水，適應(yīng)1周后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組(10只)和模型組(40只)。所有動(dòng)物在試驗(yàn)期間均自由攝取飼料和飲用水?？瞻讓?duì)照組動(dòng)物腹腔注射生理鹽水，模型組動(dòng)物腹腔注射四氯化碳(V四氯化碳∶V橄欖油= 1∶10)，1周2次，連給8周。造模4周后，將模型組動(dòng)物再隨機(jī)分為模型對(duì)照組、滸苔多糖低(150 mg·kg-1)、中(300 mg·kg-1)和高(450 mg·kg-1)劑量組。每組10只小鼠。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組動(dòng)物每天腹腔注射生理鹽水，滸苔多糖低、中和高劑量組每天腹腔注射滸苔多糖溶液；從第5周至第8周，每天下午2∶30～3∶30給藥。

1.3.4 生物樣本收集 最后一次給藥后1 h，以60 mg·kg-1劑量腹腔注射水合氯醛溶液，待小鼠麻醉后實(shí)施心臟采血，然后打開(kāi)小鼠腹腔，取出肝臟和腎臟并稱重。切取1 cm3左右組織固定于4%多聚甲醛，用于病理學(xué)檢測(cè)；其余組織在液氮中速凍。收集的血液在4 ℃中靜置過(guò)夜，經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，收集血清。血清、肝臟及腎臟組織保存于-80 ℃超低溫冰箱以備用。

1.3.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 取出保存于-80 ℃的血清樣品，待解凍后，分別采用AST、ALT、TG、TC、LDL-c、T-AOC、Cr、UA和UN標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒，檢測(cè)血清中AST與ALT活性，測(cè)定血清TG、TC、LDL-c、T-AOC、Cr、UA和UN水平。

1.3.6 肝臟組織羥脯氨酸含量檢測(cè) 取出保存于-80 ℃的肝臟組織樣品，冰浴解凍后，每個(gè)樣品稱取100 mg左右，記錄組織濕重。將肝臟組織置于10 mL離心管，加入水解液徹底水解組織后，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)組織中羥脯氨酸含量，用組織濕重校正結(jié)果。

1.3.7 病理學(xué)檢測(cè) 肝臟和腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，以梯度濃度酒精依次脫水，石蠟包埋，切成5 μm薄蠟片，用蘇木素-伊紅和天狼星紅染色，在20倍光鏡下觀察肝臟和腎臟組織病理變化并拍照分析。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果用Mean±sem表示。數(shù)據(jù)選用One-way ANOVA結(jié)合Dunnett′s posthoc test進(jìn)行組間差異分析。以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 滸苔多糖中糖含量測(cè)定 如圖1所示，曲線在0～0.1 mg·mL-1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于滸苔多糖中糖含量的測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，0.03 mg·mL-1滸苔多糖溶液OD485為0.475，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得滸苔多糖溶液中糖濃度為0.029 007 mg·mL-1，因此滸苔多糖中糖含量為96.69%。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清脂質(zhì)水平的影響 如表1所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清TG水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)，而TC(P<0.01)和LDL-c(P<0.05)水平顯著增加。與模型對(duì)照組相比，滸苔多糖低、中(150和300 mg·kg-1，P<0.001)和高劑量(450 mg·kg-1，P<0.01)組血清TC水平明顯降低；同時(shí)滸苔多糖3個(gè)劑量組血清LDL-c均顯著降低(150、300和450 mg·kg-1，P<0.05)；但是滸苔多糖對(duì)小鼠血清TG水平?jīng)]有明顯影響。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能逆轉(zhuǎn)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血脂紊亂。

表1 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清TG、TC和LDL-c水平的影響(n=6～7)

2.3 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠總抗氧化能力的影響 如表2所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清T-AOC水平顯著降低(P<0.001)；與模型對(duì)照組相比，滸苔多糖高劑量組(450 mg·kg-1，P<0.05)血清T-AOC水平明顯升高。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能提高被四氯化碳抑制的小鼠抗氧化能力。

表2 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清T-AOC水平的影響(n=6～7)

2.4 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝功能影響 如表3所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清ALT(P<0.001)和AST(P<0.001)活性均顯著升高。與模型對(duì)照組比較，滸苔多糖低、中、高劑量組小鼠血清ALT(150、300和450 mg·kg-1，P<0.001)和AST(150、300 和450 mg·kg-1，P<0.001)活性均顯著降低。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝功能失調(diào)。

表3 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清ALT和AST活性影響(n=6～7)組別

2.5 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝臟羥脯氨酸水平的影響 如表4所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織內(nèi)羥脯氨酸含量顯著升高(P<0.001)。與模型對(duì)照組比較，滸苔多糖中劑量組小鼠肝臟羥脯氨酸水平顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化。

表4 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝臟羥脯氨酸水平影響(n=6～7)

2.6 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎功能的影響 如表5所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清Cr(P<0.05)、UA(P<0.001)和UN(P<0.01)水平均顯著升高。與模型對(duì)照組比較，滸苔多糖組小鼠血清Cr(150和450 mg·kg-1，P<0.05；300 mg·kg-1，P<0.01)、UA(150 mg·kg-1，P<0.01；300 mg·kg-1，P<0.05；450 mg·kg-1，P<0.001)和UN(150、300和450 mg·kg-1，P<0.001)水平均顯著降低。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎功能失調(diào)。

表5 滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清Cr、UA和UN水平的影響(n=6～7)

2.7 滸苔多糖對(duì)模型小鼠肝臟和腎臟組織病理變化的影響 如圖2所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞淡染水腫，細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪空泡，結(jié)構(gòu)排列紊亂，匯管區(qū)及點(diǎn)狀細(xì)胞壞死區(qū)域周圍可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈管腔明顯擴(kuò)大，有大量膠原蛋白沉積，局部形成假小葉結(jié)構(gòu)；腎小管上皮細(xì)胞淡染水腫，部分腎小管管腔擴(kuò)張，局部出現(xiàn)小管萎縮。與模型對(duì)照組相比，滸苔多糖組小鼠肝細(xì)胞脂肪空泡逐漸減少，水腫減輕，排列漸趨規(guī)則，壞死細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，中央靜脈管腔逐漸縮小，沉積膠原蛋白逐漸減少；腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，腎小管擴(kuò)張及萎縮病變明顯緩解。

圖2 小鼠肝臟和腎臟組織H&E和Sirius Red染色病理圖片(×200)

3 討論

肝腎綜合征是失代償期肝硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害公眾健康。隨著對(duì)肝腎綜合征病理機(jī)制的研究深入，臨床診治策略不斷發(fā)展，但是肝移植仍是目前唯一有效的最終治療手段。因此，積極尋找安全有效的治療肝腎綜合征藥物具有重要的臨床意義。

肝腎綜合征起因于嚴(yán)重的肝纖維化/硬化，如受試藥物具有良好的肝纖維化/硬化改善作用，則該藥物對(duì)肝腎綜合征可能具有良好的防治效果。本研究發(fā)現(xiàn)滸苔多糖能減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝功能失調(diào)，這與莊鑫赟報(bào)道的滸苔多糖可調(diào)節(jié)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝功能失調(diào)類似[9]；進(jìn)一步的肝臟羥脯氨酸、組織H&E及Sirius red病理評(píng)價(jià)均顯示，滸苔多糖明顯減輕四氯化碳導(dǎo)致的小鼠肝臟纖維化，這就為其改善肝腎綜合征奠定了基礎(chǔ)。

肝腎綜合征是發(fā)生在嚴(yán)重肝病后期，以腎功能損傷為主要特征的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。臨床上主要表現(xiàn)為腎血流量和腎小球?yàn)V過(guò)率下降，而腎組織往往無(wú)顯著變化[10]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，四氯化碳在誘導(dǎo)肝纖維化基礎(chǔ)上，能導(dǎo)致小鼠血清Cr、UA和UN水平顯著升高，表明小鼠腎功能失調(diào)；H&E染色結(jié)果顯示，小鼠腎小管上皮細(xì)胞有輕微水腫，局部腎小管出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，這些病變可能與腎功能失調(diào)密切相關(guān)。重要的是，滸苔多糖幾乎恢復(fù)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎功能失調(diào)，并減輕腎上皮細(xì)胞水腫及小管萎縮。這些結(jié)果表明，滸苔多糖在改善四氯化碳誘導(dǎo)的嚴(yán)重肝臟病變后，可有效恢復(fù)腎功能失調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)滸苔多糖具有良好的肝腎綜合征防治效果。

本研究局限之處在于未深入探究滸苔多糖改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝腎綜合征作用機(jī)制。但初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，四氯化碳顯著降低小鼠機(jī)體的抗氧化能力，這與前期文獻(xiàn)報(bào)道的肝腎綜合征發(fā)生時(shí)肝腎組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)相一致[11]；而滸苔多糖能提高由四氯化碳抑制的抗氧化能力，這可能與其減輕肝腎綜合征有一定關(guān)系，但具體分子機(jī)制需后續(xù)深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，滸苔多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝腎綜合征具有良好的保護(hù)作用，為將滸苔多糖開(kāi)發(fā)成防治肝腎綜合征新型藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。