金小虎，蘇 潔，陳思敏，鐘玉瀅，周意情，洪亞男，葉 威，陳 煒，陳素紅，呂圭源*

無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠勃起功能障礙的作用及機(jī)制研究

金小虎1，蘇 潔1，陳思敏1，鐘玉瀅1，周意情1，洪亞男3，葉 威3，陳 煒3，陳素紅2*，呂圭源1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2. 浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014 3. 杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310016

研究無比山藥丸對“房事不節(jié)＋勞倦過度”導(dǎo)致的腎陽虛模型小鼠勃起功能障礙的作用及作用機(jī)制。選取性功能良好的雄性ICR小鼠60只，隨機(jī)分為對照組、模型組、金匱腎氣丸（1.7 g/kg）組和無比山藥丸低、中、高劑量（0.75、1.50、3.00 g/kg）組。采用強(qiáng)迫小鼠游泳致力竭的方法造成勞倦過度，并以Colldege效應(yīng)誘導(dǎo)雄性小鼠房事不節(jié)，建立腎陽虛勃起功能障礙模型小鼠。造模同時(shí)ig相應(yīng)藥物，連續(xù)8周。測定小鼠肛溫、抓力、自主活動次數(shù)、尾部微循環(huán)血流量及性行為等腎陽虛證候指標(biāo)；檢測血清中尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，CR）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；檢測腎臟組織中丙二醛（malonaldehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-PX）活性；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理變化；采用TUNEL染色觀察腎組織細(xì)胞凋亡情況；采用試劑盒檢測陰莖組織中鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase，GC）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性和一氧化氮（nitric oxide，NO）、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平；采用Western blotting檢測陰莖組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和GC蛋白表達(dá)。無比山藥丸顯著增加腎陽虛模型小鼠的肛溫、抓力、自主活動次數(shù)、尾部微循環(huán)血流量及捕捉、騎跨次數(shù)（＜0.05、0.01），顯著縮短捕捉、騎跨潛伏期（＜0.01）；降低血清中UA、CR、BUN水平（＜0.05、0.01）；降低腎臟組織MDA水平（＜0.01），升高SOD和GSH-PX活性（＜0.05、0.01）；改善腎臟病變及細(xì)胞凋亡情況；增加陰莖組織NO、cGMP水平和NOS及GC活性（＜0.01）；上調(diào)陰莖組織eNOS、GC蛋白表達(dá)（＜0.01）。無比山藥丸能夠改善“房事不節(jié)＋勞倦過度”致腎陽虛證候，調(diào)節(jié)勃起功能障礙，其作用機(jī)制可能與UA介導(dǎo)的NO-cGMP途徑有關(guān)。

無比山藥丸；腎陽虛；房事不節(jié)；勞倦過度；勃起功能障礙；一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷途徑

腎陽虛是由于素體陽虛、年高腎虧、房勞過度、久病傷腎等，使腎陽虧虛，機(jī)體失卻溫煦所表現(xiàn)的證候[1]?，F(xiàn)階段我國經(jīng)濟(jì)處于高速發(fā)展階段，人們生活節(jié)奏快，經(jīng)濟(jì)、家庭、工作壓力大，造成精神及身體長期處于過度疲勞（勞倦過度）狀態(tài)，這些不良因素的長期存在，使越來越多的青年男性（工作單位主力、家庭經(jīng)濟(jì)主力）也出現(xiàn)了腎陽虛現(xiàn)象，發(fā)病年齡趨于年輕化。與此同時(shí)，青年男性性欲強(qiáng)烈，保持著高頻率的性交行為（房事不節(jié)），也易導(dǎo)致腎陽虛。而腎陽虛衰，命門之火不足，精失所藏易致“性欲冷淡”，為腎陽虛主證之一，臨床上男性主要表現(xiàn)為勃起功能障礙。

無比山藥丸由山藥、熟地、杜仲、巴戟天、肉蓯蓉等12味中藥組成，各味藥補(bǔ)腎功效顯著。據(jù)古書記載，無比山藥丸古時(shí)常用于治療“丈夫虛勞百損，陽氣衰絕，體無光澤，頭暈?zāi)垦?，腰髖不遂等”。臨床上無比山藥丸對腎臟疾病具有一定的治療作用[2-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，無比山藥丸對藥物造成的腎陽虛動物模型的性功能具有良好的改善作用[8-9]，但藥物制備的腎陽虛動物模型不能完整地表現(xiàn)該癥狀的臨床特點(diǎn)，因此，本研究采用“房事不節(jié)＋勞倦過度”的造模方法，建立符合中醫(yī)病因和現(xiàn)代人群腎陽虛的模型小鼠，深入探討無比山藥丸對擬人化腎陽虛模型小鼠勃起功能的改善作用，為無比山藥丸拓展臨床應(yīng)用范圍。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性ICR小鼠65只，6～8周齡，體質(zhì)量25～30 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號20170005054902，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。清潔級雌性ICR小鼠300只，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號20170005053699，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。動物于溫度20～26 ℃、濕度45%～60%、12 h照明/12 h黑暗的環(huán)境中飼養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理與倫理委員會決議批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號ZSLL-2017-023）。

1.2 藥品與試劑

無比山藥丸（批號2013914）購自杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司；金匱腎氣丸（批號19032610）購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；苯甲酸雌二醇注射液（批號20210119）購自吉林省華牧動物保健品有限公司；尿酸（uric acid，UA）檢測試劑盒（批號210913201）購自美康生物科技有限公司；肌酐（creatinine，CR）、檢測試劑盒（批號20210918）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒（批號20210922）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號20211201）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒（批號20211201）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒（批號202111129）、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（批號20211211）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）檢測試劑盒（批號20211130）購自南京建成生物工程研究所；環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）檢測試劑盒（批號20211208-20356B）、鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase，GC）檢測試劑盒（批號20211208-24742B）購自泉州市睿信生物科技有限公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號122321220104）、BCA蛋白定量試劑盒（批號070721211202）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠快速配制試劑盒（批號041221210804）、電泳液（批號121120210422）、轉(zhuǎn)膜液（批號022021210719）購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔源內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體（批號GR3422361-4）購自英國Abcam公司；兔源GC抗體（批號LL0422）購自成都正能生物技術(shù)有限公司；兔源β-actin抗體（批號B9901）購自美國ImmunoWay公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號HP0119）購自杭州華安生物科技有限公司。

1.3 儀器

YLS-13A型大小鼠抓力測定儀、YLS-1A型多功能小鼠自動活動記錄儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；TBA-40FR型全自動生化分析儀（東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會社）；MicroCL17型微量離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PowerWave340型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；AXIOSCOPE.A1型蔡司正置熒光顯微鏡（德國CarlZeissAG公司）；SCIENTZ-48型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技有限公司）；EPS300型電泳電壓儀（上海天能科技有限公司）；QuickChemi 5200型化學(xué)發(fā)光成像儀（杭州莫納生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 動情期雌鼠的準(zhǔn)備及雄鼠的篩選

2.1.1 動情期雌鼠準(zhǔn)備 將雌鼠進(jìn)行輸卵管結(jié)扎手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)2周，連續(xù)2 d ig苯甲酸雌二醇（0.02 mg/g），第3天通過陰道涂片檢查角化細(xì)胞，篩選發(fā)情狀況良好的雌鼠。

2.1.2 雄鼠的篩選 前1 d晚上將每只雄鼠與2只動情期雌鼠共籠，次日早晨，檢查籠內(nèi)雌鼠陰部，發(fā)現(xiàn)有陰道栓說明有過交配行為，將籠內(nèi)雄鼠取出作為實(shí)驗(yàn)用。

2.2 分組、造模及給藥

將篩選出具有良好性能力的雄鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成對照組、模型組、金匱腎氣丸（1.7 g/kg，溶于蒸餾水配制成0.170 g/mL的溶液）組和無比山藥丸低、中、高劑量（0.75、1.50、3.00 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的2.5、5、10倍，溶于蒸餾水分別配制成0.075、0.150、0.300 g/mL的溶液）組。除對照組外，其余各組每日8: 00時(shí)強(qiáng)迫小鼠游泳至無力而下沉至水面以下5 s不上浮時(shí)撈出，以誘導(dǎo)勞倦過度，同時(shí)根據(jù)Colldege效應(yīng)（雄鼠與1只發(fā)情期雌鼠交配完后又會和新的發(fā)情雌鼠交配），每只雄鼠與5只動情期雌鼠同籠，并且每日更換動情期雌鼠以誘導(dǎo)房事不節(jié)[10]。連續(xù)造模8周。造模期間每日ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg）。

腎陽虛證模型建立成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》中腎陽虛證的判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)小鼠出現(xiàn)腰膝酸軟（抓力減?。?、畏寒肢冷（抱團(tuán)少動、肛溫降低、尾部微循環(huán)血流量減少）及性欲減退（捕捉、騎跨行為減弱）等腎陽虛主證，精神萎靡（自主活動降低）、發(fā)槁齒搖（皮毛無光澤）等腎陽虛次證，認(rèn)定造模成功。實(shí)驗(yàn)中模型組及無比山藥丸高劑量組各死亡1只，2組納入統(tǒng)計(jì)為9只，其余各組納入統(tǒng)計(jì)為10只。

2.3 檢測腎陽虛證候指標(biāo)

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 造模給藥期間觀察小鼠的活動情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤等，觀察模型組小鼠是否出現(xiàn)畏寒喜暖、抱團(tuán)少動、精神萎靡、形體消瘦、體毛疏松、雜亂無光澤等一系列類似腎陽虛的表現(xiàn)。

2.3.2 肛溫 造模給藥第4周，在安靜環(huán)境下，將溫度計(jì)插入小鼠肛門處，當(dāng)溫度計(jì)穩(wěn)定后記錄所測數(shù)據(jù)，測定3次，取平均值。

2.3.3 自主活動次數(shù) 造模給藥第4周，在下午安靜昏暗環(huán)境下，將小鼠放入自主活動箱內(nèi)，適應(yīng)5 min后，記錄接下來5 min內(nèi)小鼠的活動次數(shù)。

2.3.4 抓力 造模給藥第4周，應(yīng)用抓力測定儀測定小鼠抓力，每只小鼠測定3次，取平均值。

2.4 檢測尾部微循環(huán)血流量

造模給藥第5周，用異氟烷呼吸麻醉機(jī)對小鼠進(jìn)行呼吸麻醉，使用MoorFLPI散斑全幀實(shí)時(shí)掃描成像系統(tǒng)測定小鼠尾部微循環(huán)血流量。測量起點(diǎn)靠近小鼠尾根部，每只小鼠盡量保持測量位置一致。在檢測區(qū)域長度范圍內(nèi)，固定分布3個(gè)測量點(diǎn)，測量時(shí)間為30 s，掃描速度為25 Hz/s。檢測期間保持環(huán)境相對安靜，避免對測定產(chǎn)生影響，使用MoorFLPI ReviewV 3.0軟件對所記錄的3個(gè)測量點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，取平均值。

2.5 檢測雄鼠性行為指標(biāo)

造模給藥第8周，通過對雌鼠制備陰道涂片，選取發(fā)情狀態(tài)良好的雌鼠用于交配實(shí)驗(yàn)，來檢測雄鼠性行為（捕捉、騎跨的次數(shù)及潛伏期）。于19: 00時(shí)開始，在昏暗且能觀察的安靜環(huán)境下，按文獻(xiàn)方法[5]觀察記錄20 min內(nèi)雄鼠的性行為情況。

2.6 觀察腎臟組織病理變化

末次給藥后，小鼠眼眶取血致死，剝離腎組織，置于4%中性福爾馬林固定液中，固定、脫水、包埋、切片，制得4 μm石蠟切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

2.7 檢測腎臟組織細(xì)胞凋亡情況

取腎臟組織石蠟切片，按TUNEL試劑盒說明書操作，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察，觀察到的熒光細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

2.8 檢測腎功能指標(biāo)

小鼠眼眶取血致死后，離心取上層血清，用全自動生化分析儀檢測血清中UA、CR和BUN水平。

2.9 檢測腎臟氧化指標(biāo)

小鼠處死后，取腎臟，按1∶9比例加入生理鹽水，利用組織研磨器研磨制備勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD、GSH-PX活性和MDA水平。

2.10 檢測陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性

末次給藥后，解剖取小鼠陰莖組織，用生理鹽水沖洗，稱取陰莖組織，剪碎后加入蛋白裂解液，以組織研磨器制備為勻漿液，冰中裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書測定陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性。

2.11 檢測陰莖組織中eNOS和GC蛋白表達(dá)

取“2.10”項(xiàng)中的上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，分別加入β-actin、eNOS、GC抗體，4 ℃孵育過夜，PBST溶液漂洗3次；加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，PBST溶液漂洗3次，采用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行蛋白條帶曝光檢測，并用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2.12 調(diào)節(jié)腎功能與勃起功能相關(guān)性分析

應(yīng)用SPSS軟件Pearson相關(guān)性分析法，計(jì)算出腎功能指標(biāo)數(shù)據(jù)UA、CR、BUN（）與勃起功能相關(guān)指標(biāo)NO、NOS（）之間的相關(guān)系數(shù)（）。的絕對值越大（即越接近于1或?1），則相關(guān)度和相關(guān)性越強(qiáng)；若為正值則表示2個(gè)變量的關(guān)系呈正相關(guān)；若為負(fù)值則呈負(fù)相關(guān)。

2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 無比山藥丸對小鼠腎陽虛證候的影響

與對照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)抱團(tuán)少動、行動遲緩、毛發(fā)無光澤、小便清長等類似腎陽虛證候表現(xiàn)；與模型組比較，各給藥組小鼠狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠自主活動次數(shù)、抓力值和肛溫均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠自主活動次數(shù)和抓力值均顯著升高（＜0.01）；金匱腎氣丸組和無比山藥丸低、中劑量組小鼠肛溫顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.2 無比山藥丸對小鼠尾部微循環(huán)血流量的影響

如圖1和表2所示，與對照組比較，模型組小鼠尾部微循環(huán)血流量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，無比山藥丸各劑量組小鼠尾部微循環(huán)血流量均顯著升高（＜0.05、0.01）。

表1 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠抓力、自主活動和肛溫的影響()

Table 1 Effect of Wubi Shanyao Pills on grip, autonomic activity and rectal temperature in kidney-yang deficiency model mice ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只抓力/N自主活動/次肛溫/℃ 對照—10318.79±45.7296.20±21.4237.50±0.44 模型—9171.68±32.21**46.25±20.75**36.47±0.51** 金匱腎氣丸1.7010290.34±69.36##100.60±18.24##37.30±0.67## 無比山藥丸0.7510270.18±36.00##90.40±16.28##37.14±0.37## 1.5010261.42±34.24##117.90±12.64##36.99±0.72# 3.009356.99±81.54##99.90±20.49##36.91±0.53

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下同

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group, same as belows

圖1 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠尾部微循環(huán)血流量的影響

表2 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠尾部微循環(huán)血流量的影響()

Table 2 Effect of Wubi Shanyao Pills on tail microcirculation blood flow of kidney-yang deficiency model mice ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只尾部微循環(huán)血流量/PU 對照—10108.40±13.89 模型—971.21±15.20** 金匱腎氣丸1.701083.78±15.25 無比山藥丸0.751093.68±23.46## 1.501088.44±20.70# 3.00991.44±17.20#

3.3 無比山藥丸對小鼠性行為的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠捕捉潛伏期顯著延長（＜0.01），捕捉次數(shù)顯著減少（＜0.01），并且未觀察到騎跨行為；與模型組比較，各給藥組小鼠捕捉潛伏期顯著縮短（＜0.01），捕捉次數(shù)顯著增加（＜0.01），騎跨行為明顯改善（＜0.05、0.01）。

3.4 無比山藥丸對小鼠腎組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)無異常改變。與對照組相比，模型組小鼠腎體積增大，腎小球萎縮、硬化，腎小管擴(kuò)張成囊狀。與模型組相比，各給藥組小鼠腎體積減小，腎小球萎縮硬化癥狀減輕，腎小管擴(kuò)張情況減少。

表3 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠性行為的影響()

Table 3 Effect of Wubi Shanyao Pills on sexual behaviors of kidney-yang deficiency model mice ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只捕捉騎跨 潛伏期/s次數(shù)/次潛伏期/s次數(shù)/次 對照—108.80±3.0114.60±2.76392.89±147.019.67±4.47 模型—923.22±6.06**4.67±2.40**1 200.00±0.00**0.00±0.00** 金匱腎氣丸1.70109.90±3.78##10.30±2.50##633.00±130.64##4.33±2.92# 無比山藥丸0.751014.80±5.41##9.40±4.48##863.50±123.11##3.50±2.37# 1.501011.20±3.39##13.30±2.54##703.10±196.51##4.90±2.85## 3.00913.22±2.59##11.56±3.50##510.78±134.38##7.11±3.33##

黑色箭頭表示腎小球萎縮硬化，白色箭頭表示腎小管擴(kuò)張成囊狀

3.5 無比山藥丸對小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，主要見于腎小球和腎錐體中的腎小管中，嚴(yán)重影響腎小球的濾過作用和腎小管的重吸收作用，故觀察到模型小鼠小便清長的現(xiàn)象。與模型組相比，各給藥組腎臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)量均減少。

3.6 無比山藥丸對小鼠腎功能指標(biāo)的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中CR、UA和BUN水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中CR、UA和BUN水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響(×200)

表4 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠腎功能指標(biāo)的影響()

Table 4 Effect of Wubi Shanyao Pills on renal function indexes in kidney-yang deficiency model mice ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只CR/(μmol·L?1)UA/(μmol·L?1)BUN/(mmol·mL?1) 對照—1016.77±2.42130.12±6.438.70±0.85 模型—921.80±2.56**217.74±38.92**11.18±0.56** 金匱腎氣丸1.701016.82±2.94#112.76±19.90##7.44±0.57## 無比山藥丸0.751014.53±3.87##116.31±25.76##7.91±1.17## 1.501015.67±4.72#114.50±31.94##8.91±0.91## 3.00914.78±4.33#123.19±12.53##9.96±1.76#

3.7 無比山藥丸對小鼠腎臟氧化指標(biāo)的影響

如表5所示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟組織中MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD和GSH-Px活性均顯著下降（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎臟組織中MDA水平顯著下降（＜0.01），金匱腎氣丸組和無比山藥丸中、高劑量組小鼠腎臟組織中SOD和GSH-Px活性均顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.8 無比山藥丸對小鼠陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性的影響

如表6所示，與對照組比較，模型組小鼠陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠陰莖組織中NO和cGMP水平均顯著升高（＜0.05、0.01），無比山藥丸各劑量組小鼠陰莖組織中NOS活性顯著升高（＜0.01），金匱腎氣丸組和無比山藥丸中、高劑量組小鼠陰莖組織中GC活性顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.9 無比山藥丸對小鼠陰莖組織中eNOS和GC蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠陰莖組織中eNOS和GC蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，無比山藥丸各劑量組小鼠陰莖組織中eNOS和GC蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），金匱腎氣丸組小鼠陰莖組織中eNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

表5 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠腎臟氧化指標(biāo)的影響()

Table 5 Effect of Wubi Shanyao Pills on renal oxidation indexes in kidney-yang deficiency model mice ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只MDA/(nmol·mg?1)SOD/(U·mg?1)GSH-Px/(U·mg?1) 對照—105.18±1.1849.38±2.70127.27±10.80 模型—97.59±1.09**45.83±4.91*114.76±14.95* 金匱腎氣丸1.70104.78±1.20##50.96±5.19##135.65±21.39## 無比山藥丸0.75105.47±0.90##48.31±2.24121.89±5.51 1.50102.95±0.59##50.60±3.25##130.09±9.91# 3.0095.24±1.19##49.87±2.18#126.13±6.98#

表6 無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性的影響()

Table 6 Effect of Wubi Shanyao Pills on NO, cGMP levels and NOS, GC activities in penile tissues of kidney-yang deficiency model mice ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只NO/(μmol·L?1)cGMP/(nmol·L?1)NOS/(U·mg?1)GC/(U·L?1) 對照—1010.80±1.661.39±0.040.25±0.1015.55±4.52 模型—96.79±1.87**1.20±0.04**0.12±0.06**5.16±2.31** 金匱腎氣丸1.701011.88±4.98##1.24±0.04#0.17±0.049.77±4.14# 無比山藥丸0.751013.56±3.03##1.36±0.05##0.29±0.08##8.23±4.81 1.501014.40±1.71##1.40±0.04##0.26±0.07##12.27±3.86## 3.00911.31±4.98##1.32±0.02##0.30±0.11##11.24±3.88##

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01

3.10 腎功能與勃起功能相關(guān)性分析

如圖5和表7所示，經(jīng)SPSS軟件分析可知腎功能指標(biāo)與勃起功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，其中UA與NO、NOS存在顯著性差異（＜0.05、0.01）。

4 討論

腎陽虛證為中醫(yī)常見證候，由腎陽虧虛、機(jī)失溫煦所致。腎陽，又稱命門之火，為人體陽氣之根本。腎陽足，全身之陽亦足，則生命力強(qiáng)壯。若房勞過度，耗傷腎精，可致腎陽虛。無比山藥丸出自《太平惠民和劑局方》，由山藥、熟地黃、杜仲、肉蓯蓉等12味中藥組成。各味藥物配伍可奏健脾補(bǔ)腎之功，用于脾腎兩虛、食少肌瘦、腰膝酸軟、目眩耳鳴。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)無比山藥丸補(bǔ)腎功效顯著，對于腎陽虛證具有良好的療效。腎陽虛主癥有腰膝酸軟、畏寒肢冷、性欲減退[11]，次癥有精神萎靡、夜尿頻多、下肢浮腫等。本研究中采用抓力量化腎陽虛證之“腰膝酸軟”；肛溫、尾部微循環(huán)血流量量化腎陽虛證之“畏寒肢冷”；捕捉、騎跨（潛伏期、次數(shù)）行為量化腎陽虛證之“性欲減退”；自主活動次數(shù)量化腎陽虛證之“精神萎靡”。結(jié)果顯示，無比山藥丸可增加模型小鼠抓力，升高肛溫，增加尾部微循環(huán)血流量，縮短捕捉、騎跨潛伏期，增加捕捉、騎跨次數(shù)，增加模型小鼠自主活動次數(shù)。通過上述證候指標(biāo)結(jié)果提示，無比山藥丸可改善“房事不節(jié)＋勞倦過度”致腎陽虛模型小鼠腰膝酸軟、畏寒肢冷、性欲減退、精神萎靡等癥狀。

圖5 腎功能指標(biāo)與勃起功能指標(biāo)NO、NOS的相關(guān)性分析

表7 腎功能與勃起功能的Pearson相關(guān)性分析

Table 7 Pearson correlation analysis between renal function and erectile function

勃起功能指標(biāo)UACRBUN r值P值r值P值r值P值 NO?0.3340.014#?0.1540.256?0.2110.118 NOS?0.3980.003##?0.1130.408?0.0910.503

#在0.05水平上顯著相關(guān)，##在0.01水平上顯著相關(guān)

#is significant correlation at 0.05 level,##is significant correlation at 0.01 level

房勞是中醫(yī)理論上一個(gè)特有的發(fā)病因素。由于房事過多、勞累過度導(dǎo)致機(jī)體過度損耗從而會引起疾病的發(fā)生[12]。《靈樞·邪氣臟腑病形》明確指出：“有所用力舉重，若入房過度，汗出浴水，則傷腎。”強(qiáng)調(diào)勞力過度和房事不節(jié)最耗體內(nèi)腎陽，先傷腎，腎臟不榮，體內(nèi)陽氣耗竭，精失溫煦，則不行其職，易致腎陽虛。因此，“房事不節(jié)＋勞倦過度”能夠引起腎功能的低下。臨床上，血清CR、UA、BUN水平可反映腎小球的濾過作用，是檢測腎功能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，無比山藥丸可降低模型小鼠血清CR、UA和BUN水平。腎臟發(fā)揮正常的生理功能與其組織結(jié)構(gòu)的完整性密不可分。HE染色結(jié)果顯示，無比山藥丸能改善模型小鼠腎小球萎縮、腎小管擴(kuò)張等；TUNEL染色結(jié)果顯示，無比山藥丸能減少模型小鼠腎小球和腎小管中細(xì)胞凋亡。其可能與無比山藥丸改善模型小鼠腎臟氧化損傷有關(guān)，結(jié)果顯示，無比山藥丸能降低模型小鼠腎臟中MDA水平，升高SOD和GSH-PX活性。

《素問·痿論篇》提及“入房太甚，宗筋弛縱”指房事過多會導(dǎo)致男子前陰痿弱不舉。清代韓善微《陽痿論》曰：“陽者，男子之外腎，痿者，弱也；弱而不用，欲舉而不能之謂?！倍I陽，又稱命門之火，為人體陽氣之根本，能夠增強(qiáng)臟腑組織器官的功能活動。腎陽溫煦、推動陰莖勃起，因此陽痿乃“腎虛不能榮于陰器，故萎弱也?！彼浴胺渴虏还?jié)＋勞累過度”最終會導(dǎo)致男子性功能低下。

勃起功能障礙是男性性功能低下的主要表現(xiàn)之一[13]，其中勃起功能障礙是指陰莖持續(xù)不能達(dá)到或維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活，病程在3個(gè)月以上[14]。研究證明，NO-cGMP途徑對于維持陰莖勃起起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，NO作為一種內(nèi)源性信號分子，由NOS催化產(chǎn)生，可通過激活GC，將三磷酸鳥苷轉(zhuǎn)化為cGMP，作用于鈣離子通道，松弛平滑肌，促使血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙，引起陰莖勃起[15-16]。因此，任何引起陰莖海綿體中NO減少的因素都可能導(dǎo)致勃起功能障礙的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，無比山藥丸能縮短模型小鼠捕捉、騎跨行為潛伏期，增加捕捉、騎跨次數(shù)，故能改善模型小鼠陰莖勃起能力，并且能增加陰莖組織中NO、cGMP水平，增強(qiáng)陰莖組織中NOS、GC活性，上調(diào)NO-cGMP途徑中eNOS和GC蛋白表達(dá)。

中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖，男性陽痿與腎臟不榮密切相關(guān)。本研究中將腎功能指標(biāo)與勃起功能指標(biāo)利用SPSS軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)UA與NO、NOS之間呈顯著負(fù)相關(guān)。研究表明，高UA水平對機(jī)體NO的表達(dá)有著重要的影響[17]。高尿酸血癥時(shí)體內(nèi)氧自由基增多，促進(jìn)氧自由基與NO反應(yīng)增強(qiáng)，從而消耗了大量NO，導(dǎo)致NO含量下降[18]。故推測“房事不節(jié)＋勞倦過度”導(dǎo)致的勃起功能障礙可能與UA介導(dǎo)的NO-cGMP途徑有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，無比山藥丸能夠改善“房事不節(jié)＋勞倦過度”導(dǎo)致的模型小鼠腎陽虛之腰膝酸軟、畏寒肢冷、性欲減退、精神萎靡等癥狀；改善模型小鼠腎功能損傷和勃起功能障礙。其作用機(jī)制可能與尿酸介導(dǎo)的NO-cGMP途徑有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Wubi Shanyao Pills on erectile dysfunction of kidney-yang deficiency model mice

JIN Xiao-hu1, SU Jie1, CHEN Si-min1, ZHONG Yu-ying1, ZHOU Yi-qing1, HONG Ya-nan3, YE Wei3, CHEN Wei3, CHEN Su-hong2, LYU Gui-yuan1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China 3. Hangzhou Huqingyutang Parmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310016, China

To observe the effect and mechanism of Wubi Shanyao Pills (無比山藥丸) on erectile function of kidney-yang deficiency model mice caused by sexual overstrain and over-exertion.Sixty male ICR mice with good sexual function were randomly divided into control group, model group, Jinkui Shenqi Pills (1.7 g/kg) group and Wubi Shanyao Pills low-, medium- and high-dose (0.75, 1.50, 3.00 g/kg) groups. The over-exertion model was caused by forcing mice to swim to exhaustion, and model of erectile dysfunction due to kidney-yang deficiency was established by sexual overstrain in male mice with College effect. Mice were ig corresponding drugs for 8 consecutive weeks at the same time as modeling. The anal temperature, grasping power, number of autonomous activity, blood flow in tail microcirculation and sexual behavior of mice with kidney-yang deficiency symptoms were measured; Uric acid (UA), creatinine (CR) and blood urea nitrogen (BUN) levels in serum were detected; Malondialdehyde (MDA) level and superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX) activities in kidney tissue were detected; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of renal tissue; TUNEL staining was used to observe the apoptosis of renal tissue; Kits were used to detect guanylate cyclase (GC), nitric oxide synthase (NOS) activities and nitric oxide (NO), cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels in penile tissue. Western blotting was used to detect protein expressions of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and GC in penis tissue.Wubi Shanyao Pills significantly increased the anal temperature, grasping power, number of autonomous activities, microcirculation blood flow in tail, capture and straddle times (< 0.05, 0.01), and reduced capture and straddle latency (< 0.01), decreased UA, CR, and BUN levels in serum (< 0.05, 0.01), decreased MDA level in kidney tissue (< 0.01), increased SOD and GSH-PX activities in kidney tissue (< 0.05, 0.01), improved kidney lesions and cell apoptosis, increased NO, cGMP levels and NOS, GC activities in penile tissue (< 0.01), and up-regulated eNOS and GC protein expressions in penile tissue (< 0.01).Wubi Shanyao Pills can improve the syndrome of kidney-yang deficiency caused by sexual overstrain and over-exertion, regulate erectile dysfunction, and its mechanism may be related to UA-mediated NO-cGMP pathway.

Wubi Shanyao Pills; kidney-yang deficiency; sexual overstrain; over-exertion; erectile function; nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5400 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.016

2022-04-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873036）；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017C03052）；浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2012E10002）

金小虎（1997—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Tel: 15868130993 E-mail: jxh976116@163.com

呂圭源，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: lv.gy@ 263.net

陳素紅，博士，研究員，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: chensuhong@zjut.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]