劉 青

氧化應激在心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、心力衰竭、糖尿病性心肌病等多種心血管疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[1]。氧化應激導致活性氧過量產(chǎn)生，過量的活性氧破壞機體氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，對心肌細胞造成損傷；氧化應激增強導致線粒體功能障礙，激活心臟凋亡信號通路，進一步加重心肌損傷[2]。因此，減輕心肌細胞氧化應激和/或直接抑制凋亡可能是一種有效的心臟保護策略。草蓯蓉多糖是我國傳統(tǒng)中藥草蓯蓉的活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫增強、保肝等作用[3]。相關研究證實，草蓯蓉多糖通過抗凋亡、抗氧化應激作用可緩解四氯化碳所致肝損傷和過氧化氫所致內(nèi)皮細胞損傷[4-5]。關于草蓯蓉多糖對心肌細胞保護作用的研究報道較少。微小RNA(miRNA)定義為長度約20 nt的非編碼RNA，通過直接結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)抑制翻譯或降解mRNA，參與調(diào)控細胞存活、細胞凋亡等生物過程。有研究顯示，miR-138-5p在不穩(wěn)定型心絞痛中下調(diào)，過表達miR-138-5p可提高缺氧復氧心肌細胞活力，抑制細胞凋亡[6]。然而，miR-138-5p在心肌細胞氧化損傷中的作用尚未完全明確。本研究以H2O2誘導H9c2心肌細胞建立氧化損傷模型[7]，探討草蓯蓉多糖對H2O2所致心肌細胞凋亡、氧化應激損傷的影響，并以miR-138-5p為切入點探討其保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠H9c2心肌細胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)；DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胎牛血清(武漢普諾賽生物公司)；細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒(北京百奧萊博生物公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、化學發(fā)光試劑(上海碧云天生物公司)；兔源白細胞淋巴瘤(Bcl)-2、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、Bcl相關X蛋白(Bax)抗體，羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)。

1.2 方法 每組設置3個復孔，實驗重復3次，

1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 H9c2心肌細胞復蘇后，接種到含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。胰酶消化90%融合H9c2心肌細胞，按照1∶4比例傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期H9c2心肌細胞以1×105個/孔接種到6孔板，利用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-138-5p mimics、anti-miR-138-5p至60%融合H9c2心肌細胞，轉(zhuǎn)染6 h后，將無血清培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液。收集轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)實驗。

實驗分組，con組：正常培養(yǎng)的H9c2心肌細胞；H2O2組：使用含50μmol/L H2O2的培養(yǎng)液孵育細胞2 h[7]；H2O2+草蓯蓉多糖-低劑量(L)組、H2O2+草蓯蓉多糖-中劑量(M)組、H2O2+草蓯蓉多糖-高劑量(H)組：使用含0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.50 mg/mL草蓯蓉多糖[8]培養(yǎng)24 h后，50 μmol/L H2O2孵育2 h；H2O2+miR-NC組、H2O2+miR-138-5p組、H2O2+anti-miR-138-5p組：使用含50 μmol/L H2O2培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics、轉(zhuǎn)染anti-miR-138-5p的細胞2 h；H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組：使用含0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL草蓯蓉多糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染anti-miR-138-5p細胞24 h后，50 μmol/L H2O2孵育2 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力 取2×103個轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞或未轉(zhuǎn)染細胞接種在96孔板中，按照1.2.1分組進行給藥和/或H2O2處理。將10 μL的CCK-8溶液添加到每個孔中，之后在37 ℃條件下孵育2 h，酶標儀讀取450 nm處的光密度(OD)表示細胞活力。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用1×結(jié)合緩沖液重懸各組H9c2心肌細胞使細胞濃度約為1×106個/mL。向500 μL細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，黑暗環(huán)境中染色20 min。流式細胞儀收集熒光信號，F(xiàn)lowJo 8.7.1軟件分析細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達 全蛋白提取試劑盒分離H9c2心肌細胞總蛋白。按照4∶1體積將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液(5×)混合，100 ℃加熱5 min，充分變性蛋白。取30 μg冷卻蛋白加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠加樣孔內(nèi)，設置電壓100 V，時間90 min。利用標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置進行轉(zhuǎn)膜，設定轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，時間60 min。向洗膜盒中預先加入漂洗液，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后立即將膜漂洗1～2 min，滴管吸盡漂洗液。使用5%牛血清蛋白4 ℃封閉過夜。滴管吸盡封閉液，立即用稀釋的一抗溶液室溫封閉2 h。洗滌液洗滌5～10 min。共洗滌3次。滴管吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光試劑顯色，GAPDH作為內(nèi)參，化學發(fā)光成像儀檢測目的蛋白表達量。

1.2.5 試劑盒檢測MDA水平、SOD活性及LDH釋放量 分別收集各組H9c2心肌細胞培養(yǎng)液上清、細胞沉淀至新的離心管中。按照LDH檢測試劑盒說明測定細胞培養(yǎng)液上清液LDH釋放量。向細胞沉淀中加入提取液，超聲破碎細胞，收集上清液，按照商品試劑盒說明書檢測MDA水平及SOD活性。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測miR-138-5p表達 Trizol試劑分離各組H9c2心肌細胞總RNA，采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用miRNA熒光定量檢測試劑盒進行RT-qPCR。2-△△Ct法分析miR-138-5p表達量。miR-138-5p正向引物為5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′，反向引物為5′-TGGTGTCGCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 結(jié) 果

2.1 草蓯蓉多糖對H2O2誘導H9c2損傷的影響 與con組比較，H2O2組H9c2細胞活力、Bcl-2蛋白表達、miR-138-5p表達降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組H9c2細胞活力、Bcl-2蛋白表達、miR-138-5p表達升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達降低(P<0.05)；H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組細胞活力、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達、miR-138-5p表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 草蓯蓉多糖對H2O2誘導H9c2心肌細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(A為各組細胞凋亡率；B為Bax、Bcl-2蛋白條帶圖。1為con組；2為H2O2組；3為H2O2+草蓯蓉多糖-L組；4為H2O2+草蓯蓉多糖-M組；5為H2O2+草蓯蓉多糖-H組)

2.2 草蓯蓉多糖對H2O2誘導H9c2氧化應激的影響 與con組比較，H2O2組H9c2心肌細胞SOD活力降低(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組H9c2心肌細胞SOD活力升高(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平降低(P<0.05)；H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組細胞SOD活力、LDH釋放量、MDA水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 miR-138-5p對H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷氧化應激的影響 與H2O2組、H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-138-5p組H9c2心肌細胞miR-138-5p表達、細胞活力、SOD活性、Bcl-2蛋白升高，凋亡率、Bax蛋白表達、LDH釋放量、MDA水平降低(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 miR-138-5p對H2O2誘導H9c2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(A為各組H9c2心肌細胞凋亡率；B為Bax、Bcl-2蛋白條帶圖。1為H2O2組；2為H2O2+miR-NC組；3為H2O2+miR-138-5p組)

2.4 抑制miR-138-5p對草蓯蓉多糖處理的H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷的影響 與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖組H9c2心肌細胞miR-138-5p表達，細胞活力、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細胞miR-138-5p表達、細胞活力、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與H2O2+草蓯蓉多糖組比較，H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細胞miR-138-5p表達、細胞活力、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達升高(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 抑制miR-138-5p逆轉(zhuǎn)草蓯蓉多糖對H2O2誘導H9c2心肌細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(A為各組細胞凋亡率；B為Bax、Bcl-2蛋白表達條帶圖。1為H2O2組；2為H2O2+草蓯蓉多糖組；3為H2O2+anti-miR-138-5p組；4為H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組)

2.5 抑制miR-138-5p對草蓯蓉多糖處理的H2O2誘導H9c2心肌細胞氧化應激的影響 與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖組H9c2心肌細胞SOD活性升高(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細胞SOD活性降低(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平升高(P<0.05)；與H2O2+草蓯蓉多糖組比較，H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細胞SOD活性降低(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平升高(P<0.05)。詳見表5。

組別LDH(U/L)MDA(nmol/L)SOD(U/mL)H2O2組8 722.29±270.2768.05±6.1826.02±1.50H2O2+草蓯蓉多糖組3 132.12±158.85①17.57±1.59①99.02±8.30①H2O2+anti-miR-138-5p組12 512.84±345.82①98.33±6.49①9.53±0.66①H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組7 186.32±215.22②51.20±3.43②36.90±3.70②F值2 052.881432.007645.129P<0.001<0.001<0.001

3 討 論

正常生理條件下，心肌細胞活性氧的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，缺血、高血糖引起的活性氧生成增加導致氧化應激和心肌細胞損傷。草蓯蓉多糖的抗氧化作用已被廣泛報道，Quan等[9]研究表明，草蓯蓉多糖通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路增強抗氧化防御系統(tǒng)，抑制炎癥反應，減少凋亡信號通路，從而減輕半乳糖胺/脂多糖誘導的肝損傷。劉莉園等[10]研究顯示，草蓯蓉多糖可能調(diào)控Jun激酶(JNK)、p38及NF-κB途徑，從而預防氧化損傷所致血管內(nèi)皮細胞凋亡。本研究探討草蓯蓉多糖對H2O2所致心肌細胞損傷的保護作用。生理狀態(tài)下LDH無法穿透細胞膜，當細胞膜損傷時LDH可釋放到細胞外基質(zhì)，通過檢測LDH水平可直接反映細胞膜完整性[11]。本研究結(jié)果顯示，草蓯蓉多糖以濃度依賴方式抑制H2O2誘導的LDH釋放和細胞凋亡，提高H9c2細胞活力，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達水平，表明草蓯蓉多糖可減輕H2O2誘導的細胞損傷?；钚匝跖c脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，誘導細胞毒性和功能障礙。SOD等細胞抗氧化酶可降低細胞內(nèi)活性氧，抑制脂質(zhì)過氧化反應[12]。本研究中應用草蓯蓉多糖處理，降低了MDA生成，提高SOD活性，表明草蓯蓉多糖可減輕H2O2誘導的細胞氧化應激損傷。

miR-138-5p已證實在脊髓損傷、急性肺損傷、腦缺血再灌注損傷、心肌缺氧復氧損傷中發(fā)揮著重要作用[13-14]。Li等[15]以大腦中動脈閉塞大鼠模型模擬腦缺血再灌注損傷發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p表達下調(diào)，過表達miR-138-5p可抑制炎癥，改善神經(jīng)功能。Hu等[16]研究顯示，急性心肌梗死大鼠和缺氧復氧誘導的心肌細胞miR-138-5p表達下調(diào)，過表達miR-138-5p可抑制缺氧復氧誘導的細胞凋亡和炎癥反應。Chang等[17]研究表明，右美托咪通過上調(diào)miR-138-3p減輕改善心肌缺血再灌注損傷小鼠的心室重構(gòu)。本研究中H2O2誘導后H9c2心肌細胞中miR-138-3p表達降低，草蓯蓉多糖以濃度依賴方式增加miR-138-3p表達量，提示草蓯蓉多糖可能與調(diào)控miR-138-3p表達有關。轉(zhuǎn)染miR-138-3p mimics進行功能實驗，結(jié)果表明過表達miR-138-3p可抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡、LDH釋放，抑制MDA生成，下調(diào)Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，提高細胞活力和SOD活性，與草蓯蓉多糖的保護作用機制一致；轉(zhuǎn)染的anti-miR-138-3p抑制miR-138-3p表達加劇H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡和氧化損傷。抑制miR-138-3p可減弱草蓯蓉多糖對H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡和氧化損傷的影響，表明草蓯蓉多糖通過上調(diào)miR-138-3p對H2O2誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷發(fā)揮保護功能。

本研究不足之處在于，miR-138-3p反向靶基因、草蓯蓉多糖是否調(diào)控其他miRNA發(fā)揮保護功能有待進一步確認。綜上所述，草蓯蓉多糖通過上調(diào)miR-138-3p表達可減輕H2O2誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷，為草蓯蓉多糖防治與氧化應激相關的心血管疾病提供了理論基礎。