拉馬甲甲,文建華,徐志文*
(1.四川省喜德縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川 喜德 616750;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,動物疾病與人類健康四川省重點實驗室,四川 成都 611130)
豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種單股負(fù)鏈共價閉合環(huán)狀DNA 病毒,屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬[1]。目前全球已報道的共有4 種血清型,我國國內(nèi)主要流行2型和3型,其中PCV 2型對豬群的傳染性和致病性最強(qiáng),存在垂直傳播。豬圓環(huán)病毒2 型在國內(nèi)最早于2001 年在京津冀地區(qū)的豬群中被分離鑒定[2],豬圓環(huán)病毒3 型則由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)宋長緒教授課題組于2017 年首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)[3]。目前關(guān)于PCV3 的癥狀與致病性的相關(guān)研究還在進(jìn)行,但已有報道顯示在出現(xiàn)繁殖障礙、免疫抑制、多器官炎癥及豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)的豬群中曾檢測出PCV3病原。
1.1 病料 病料采集于出現(xiàn)喘氣、發(fā)燒以及多器官功能衰竭的斷奶仔豬,主要采集肺臟與脾臟。
1.2 試劑 磁珠法總核酸提取試劑盒與配套儀器購買自國生生物技術(shù)有限公司;Taq PCR Master Mix、DEPC處理水購買自生工生物公司;DL2000 Marker 與反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScrip RT reagent Kit)購買自TAKARA(寶生物有限公司)。
1.3 樣品處理 檢查樣品,確定病變區(qū)域,從病變區(qū)域邊緣剪取并稱量樣品4 g,裝入無菌無DNase的EP管中,加入1 000 μL DEPC處理水,勻漿后置于-40 ℃下反復(fù)凍融3次,8 000 r/min離心5 min,取上清液,-80 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 引物合成 根據(jù)GenBank 登錄的豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3 型(PCV3)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)的基因序列,利用DNAMAN軟件分析保守序列并設(shè)計引物,引物信息見表1。
表1 引物信息
1.5 核酸提取與PCR檢測 提取樣品總DNA與總RNA,使用PCV2、PCV3、PRV、PPV引物分別對樣品總DNA 進(jìn)行PCR 檢測;將總RNA 反轉(zhuǎn)錄后取得cDNA,使用PRRSV、CSFV 引物進(jìn)行PCR 檢測。PCR反應(yīng)體系程序分別見表2、表3。
表2 PCR反應(yīng)體系
表3 PCR反應(yīng)程序
對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示PRV、PRRSV、PPV、CSFV均呈陰性,PCV2 及PCV3 出現(xiàn)陽性條帶,其中1、2、3、4 號樣品檢出PCV2 陽性;1、5 號樣品檢出PCV3 陽性(結(jié)果如圖1、圖2)。判定1 號樣品為豬圓環(huán)病毒2型和3型的混合感染。
圖1 PCV2 PCR檢測結(jié)果
圖2 PCV3 PCR檢測結(jié)果
豬圓環(huán)病毒2 型與3 型的混合感染在臨床上較為常見,二者臨床特征相近且均有較為嚴(yán)重的致病性,因此鑒別診斷對于疫病防控尤為重要[4]。
豬圓環(huán)病毒2 型主要侵襲胎兒心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,而在仔豬和成豬上只感染巨噬細(xì)胞,造成患病豬只的免疫系統(tǒng)損傷,引發(fā)T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量下降,從而導(dǎo)致患病豬免疫抑制。因此,豬群在感染豬圓環(huán)病毒后可能會進(jìn)一步發(fā)生其他疫病的并發(fā)感染和傳播[5]。臨床上常見圓環(huán)病毒與其他各類細(xì)菌病或病毒病的混合感染現(xiàn)象,導(dǎo)致受感染的豬場損失擴(kuò)大,同時防控難度更大。當(dāng)豬群中檢測出圓環(huán)病毒2型或3 型感染或混合感染時,需要同步加強(qiáng)其他病毒病和細(xì)菌病的監(jiān)測力度。
防控時應(yīng)當(dāng)注意將病死豬、撲殺豬及其污染物作無害化處理;對發(fā)病豬和疑似患病豬隔離單獨(dú)飼養(yǎng),并加強(qiáng)其他豬群疫病的防控;加強(qiáng)豬場管理,定期對養(yǎng)殖器具與圈舍進(jìn)行消殺。需要注意的是,豬圓環(huán)病毒對環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗能力。研究表明,PCV2 在75 ℃下加熱15 min 感染活性幾乎不變,在80 ℃下加熱處理15 min 才會完全喪失感染活性[6],因此常規(guī)的依賴溫度變化的消毒方法,如巴氏消毒法、干熱消毒法和濕熱消毒法對PCV 的殺滅效果相當(dāng)有限[7]。由于PCV 在結(jié)構(gòu)上不存在囊膜,因此病毒對有機(jī)溶劑(氯仿、酒精等)不敏感,而苯酚、季胺類化合物、氫氧化鈉和強(qiáng)氧化劑等物質(zhì)則對PCV 具有較強(qiáng)的抑制效果[8]。此外,豬場應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格限制無關(guān)車輛和人員進(jìn)出,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,防止外來病原體侵入和豬只應(yīng)激而導(dǎo)致免疫力下降。