孫皓月，李文剛，俞世康，伍德洋，陳漢發(fā)，楊潔，宋朝鵬，賈宏昉，謝良文*

農藝與調制

上部葉脂質代謝與煙葉褐變的關系研究

孫皓月1，李文剛2，俞世康3，伍德洋4，陳漢發(fā)4，楊潔3，宋朝鵬1，賈宏昉1，謝良文2*

1 河南農業(yè)大學煙草學院，河南鄭州 450000；2 四川省煙草公司，四川成都 610000；3 四川省煙草公司廣元市公司，四川廣元 628000；4 四川省煙草公司涼山州公司，四川西昌 615000

【目的】為明確烤煙上部葉脂質代謝對煙葉褐變的影響?！痉椒ā恳栽茻?7和中川208兩個品種的上部葉為試驗材料，利用轉錄組學、透射電鏡、掃描電鏡和熒光實時定量PCR（qRT-PCR）技術從細胞生物學和分子層面對脂質氧化與上部煙葉的褐變關系進行系統(tǒng)的研究?！窘Y果】（1）相比云煙87，易褐變的中川208上部葉褐變速度更快，且葉片達五成的褐變時間更短，褐變反應更劇烈；進一步的轉錄組GO分析和KEGG富集分析結果顯示中川208上部葉差異基因在脂類代謝（亞麻酸和亞油酸代謝）富集較多，表明脂質代謝與上部葉煙葉褐變密切相關。（2）對比云煙87，中川208上部葉成熟期角質層厚度明顯增加，蠟質層破碎薄片明顯增多，總脂肪酸含量、亞麻酸含量及脂氧合酶（LOX）酶活顯著高于云煙87，表明中川208上部葉脂類代謝較旺盛，易發(fā)生脂質氧化。（3）qRT-PCR結果表明中川208上部葉中脂類代謝途徑關鍵基因、、、等的表達量顯著高于云煙87，其中脂質氧化關鍵基因表達量上調2.27倍【結論】相比云煙87上部煙葉，中川208上部葉褐變反應更劇烈，煙葉中的脂肪酸代謝更旺盛，脂類物質更易發(fā)生氧化反應，表明脂肪酸代謝引起的脂質氧化是中川208上部煙葉易褐變的一個重要因素。

上部葉；脂質代謝；褐變；轉錄組學

上部煙葉因其致密的組織結構、豐富的物質積累，有助于提高卷煙產品的煙氣濃度和豐富煙香[1]，但在實際生產中也常見掛灰、雜色等問題。煙葉香氣成分的形成與褐變反應密切相關，而另一方面煙葉褐變程度的加大也制約著煙葉商品等級與可用性。近年來，對烤煙褐變問題的研究多集中于多酚氧化酶及多酚類引起的酶促褐變反應，通過平衡施肥、改進采烤方式、噴施生長調節(jié)劑等方法顯著減輕上部葉褐變情況[2-4]。在果蔬作物方面，有研究認為褐變的發(fā)生與脂質代謝有著密切的聯(lián)系，低溫脅迫下不飽和脂肪酸含量變化和脂質過氧化作用導致馬鈴薯褐變度降低[5]；去除蠟質脂質的果實褐斑病發(fā)病率降低[6]；延緩雙孢蘑菇的脂質過氧化進程可降低其褐變指數[7]，這些研究都表明果蔬類的脂質代謝和氧化是影響改變褐變進程的重要因素之一。云煙87煙葉作為主栽品種易考性耐烤性好，對比中川208烤后煙葉雜色比例較少[8-9]。為了明確脂質氧化是否參與煙葉的褐變過程，本研究選擇烤煙品種云煙87和易褐變的中川208上部葉為適供材料，以轉錄組學分析為切入點，利用掃描電鏡、透射電鏡和qRT-PCR技術從細胞生物學和分子層面對脂質代謝與上部煙葉的褐變關系進行系統(tǒng)研究，對改善上部葉烘烤技術、提高上部葉的烘烤質量、降低煙農的經濟損失、減少煙葉資源的浪費有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021年在廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)基地開展，供試烤煙品種為云煙87和易褐變的中川208，選取上部葉16～20葉位為供試材料。

1.2 試驗設計

選擇地勢平坦、排水條件良好的地塊，行株距為1.20 m×0.5 m，以當地優(yōu)質烤煙生產方式，進行施肥和中耕管理。中部葉完全采摘后，采取長勢大小一致、健康無病害的上部葉，每個品種各選取10片煙葉立即運往實驗室，采用半葉法將煙葉一分為二并去除主脈，一半葉片4℃保存用于超微結構觀察，一半葉片放入液氮內速凍后置于-80℃冰柜儲存用于酶活性與轉錄組測定，其余葉片用于觀察采后顏色變化，每個處理3次重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 采后顏色變化測定

每品種選取5片用于采后顏色變化的測定，參考《YC/T 311—2009烤煙品種烘烤特性評價》[10]的方法，將采收煙葉懸掛放置于保持黑暗環(huán)境的室溫中，從煙葉采收完成時每隔24 h進行褐變比例統(tǒng)計，測定變褐程度、變褐速度。

1.3.2 超微結構分析測定

參考鄭小雨的方法[11]，選取葉片第5到第7支脈之間右側相同的位置，用手術刀切成1 mm×1 mm的小塊，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS緩沖液配制）中固定。透射電鏡觀察角質層：用1%鋨酸（pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS緩沖液配制）固定，經純丙酮脫水后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋聚合。用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片機（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）切出超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，再用JEM-1400Plus型透射電鏡（日本電子）進行觀察并拍照，每個處理觀察10個視野。掃描電鏡觀察表皮蠟質：置于4℃冰箱固定，隨后進行反復脫水清洗干燥，置于日立S-3000掃描電鏡下觀察拍照，每個處理10個視野。用軟件Photoshop 2020進行標注處理。

1.3.3 煙草葉片RNA提取及測序

提取樣品總RNA并使用DNase消化DNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化成雙鏈cDNA；將純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增；通過構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質檢合格后，使用Illumina平臺進行上機測序，由上海歐易生物有限公司完成。

1.3.4 差異表達基因的注釋及分析

由Illumina測序所得的數據進行質控（QC），以確定測序數據是否適用于后續(xù)分析。通過比較不同樣本間數據，依據DESeq進行差異基因分析，并使用nbinom Test函數計算差異比較的值和Fold Change值。以Fold Change≥2且<0.05為條件篩選DEGs。選取差異基因數目大于2的GO條目，利用超幾何分布檢驗計算差異編碼基因列表中富集值，再對值經多重檢驗糾正后得到q值，進而判斷差異基因在該GO中出現富集的情況，對其功能進行描述，闡明差異在基因功能上的體現。利用 KEGG 數據庫對差異蛋白編碼基因進行 Pathway 分析（結合 KEGG 注釋結果），并用超幾何分布檢驗的方法計算每個 Pathway 條目中差異基因富集的顯著性。

1.3.5 差異基因qRT-PCR分析

按照Invitrogen公司的Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒說明書進行熒光實時定量qRT-PCR。根據轉錄組測序結果篩選出有差異的脂類代謝基因：實時定量的實驗數據以煙草組成型表達基因（GenBank: L18908.1）為內參基因，進行3次重復試驗，采用2-ΔΔCt算法進行分析。假設目的基因在脅迫處理下的表達量是對照（正常培養(yǎng)）的N倍，N = 2-ΔΔCt，ΔΔCt = Treat(Ct樣品-CtL25)-CK(Ct樣品-CtL25)。

表1 煙葉脂類代謝相關基因的定量PCR引物序列

Tab.1 Quantitative PCR primer sequences of tobacco leaf lipid metabolism-related genes

1.3.6 LOX活性的測定

脂氧合酶（LOX）活性按照北京索萊寶科技有限公司生產的酶活試劑盒按照說明書方法進行測定。

1.3.7 脂肪酸含量測定

脂肪酸等成分檢測方法采用下列標準：《YC/T288—2009煙草及煙草制品多元酸(草酸、蘋果酸和檸檬酸)的測定氣相色譜法》[12]。

1.3.8 統(tǒng)計分析

使用檢驗比較兩個樣本組，結果用平均值和相應的標準誤差表示，使用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。圖片使用Origin 2018軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 采后煙葉顏色變化

由圖1A可知，中川208上部葉在65 h時開始褐變，148 h時達五成褐變，168 h時達到八成褐變，云煙87上部葉73 h啟動褐變，在152 h褐變至五成，在168 h達到八成褐，說明中川208上部葉的褐變速度快于云煙87上部葉。由圖1B可知，中川208上部葉的褐變啟動時間顯著早于云煙87上部葉，褐變至五成、八成時間均極顯著早于云煙87，說明中川208上部葉褐變反應劇烈程度較高。

注: *和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著，下同。

2.2 煙葉轉錄組差異基因分析

煙葉轉錄組基因顯著性差異表達情況結果如圖2A所示，中川208對比云煙87上部葉共有2453個差異表達基因（DEGs），包括1005個上調基因和1448個下調基因。差異表達基因的GO分析結果表明（圖2B），差異表達基因主要富集在17個生物過程、9個細胞組成、7個分子功能方面，其中生物過程主要富集在防御反應，甘油、鞘脂類代謝，極長鏈脂肪酸、脂肪酶生物合成過程等；細胞組成主要富集在等離子體膜、核、核小體等；分子功能主要富集在酚氧化酶活性、甘油三酯脂肪酶活性、催化活性等。KEGG富集結果分析表明（圖2C），差異表達基因被注釋到202個通路中。其中主要富集通路（<0.05）參與碳氮代謝中的氨基酸（苯丙氨酸代謝和精氨酸、脯氨酸代謝）和糖代謝（氨基糖和核苷酸糖代謝），而次生代謝主要是酚類代謝（苯丙酮類代謝和黃酮類生物合成）和脂類代謝（亞麻酸和亞油酸代謝）等。

2.3 煙葉細胞超微結構觀察

由圖3所示，中川208上部葉角質層較厚，達7.138 μm，是云煙87上部葉的1.6倍。煙葉成熟期蠟質層呈破碎菱形晶體狀，中川208上部葉蠟質層晶體破碎薄片較多且面積較大，主要集中分布于氣孔附近，直徑3 μm以上的蠟質顆粒達35個，高于云煙87上部葉2.3倍。說明對比云煙87上部葉，中川208煙葉角質層更厚，蠟質晶體含量更多，脂肪族化合物具有旺盛的生理代謝活性。

注：C:角質層；W:細胞壁；PM:質膜。

2.4 烤后煙葉的脂肪酸含量分析

烤后煙葉中7種脂肪酸的檢測結果如圖4A所示，肉豆蔻酸(C14:1)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、花生酸(C20:0)、亞油酸(C18:2)、油酸和亞麻酸(C18:1、C18:3)含量均呈現出相同的趨勢，中川208上部葉總脂肪酸含量顯著高于云煙87上部葉，達到了1.13倍。其中，中川208上部葉亞油酸含量為3.03 mg/g，是云煙87上部葉的1.2倍，達到極顯著差異，中川208上部葉肉豆蔻酸、油酸與亞麻酸分別顯著增加了0.06 mg/g和0.16 mg/g。

由圖4B可知，中川208上部鮮煙葉LOX酶活性顯著高于云煙87上部葉，酶活增加了62.68%，說明中川208上部葉在一定程度上飽和與不飽和脂肪酸的積累較多，脂質降解氧化能力更強。

圖4 烤后煙葉脂肪酸含量分析（A）與鮮煙LOX酶活性（B）

2.5 煙葉中脂肪酸代謝途徑關鍵基因表達

煙葉脂肪酸代謝途徑中關鍵基因的檢測結果如圖5所示，與云煙87上部葉相比，中川208上部煙葉中、、、、等基因表達量均顯著上調，與轉錄組脂類代謝差異基因測定結果相一致，尤其是和基因，分別上調7.83和2.27倍，達到極顯著差異。

圖5 脂肪酸代謝途徑關鍵基因

3 討論

云煙87與中川208的煙葉褐變差異基因富集在15個通路中，其中酚類代謝、脂質代謝、氨基酸代謝、糖代謝等通路可能是造成兩品種褐變差異的重要原因。本研究發(fā)現煙葉褐變下脂肪酸代謝途徑相關差異基因的表達變化與影響蝴蝶蘭、茄子、蘋果等褐變的調控基因表達結果相類似[13-15]。也與茶樹新梢組培褐變后研究發(fā)現通過滲透調節(jié)次生代謝物質、激素調節(jié)和角質蠟質保護來抵御脅迫逆境[16]的結果相吻合。

酚類、黃酮類是植物果蔬酶促褐變的重要底物，當細胞膜系統(tǒng)被破壞時，酚類物質、類黃酮的氧化迅速轉變成大量醌，最終導致褐變[17-18]，這是目前經典的褐變機制。除了酚類物質，糖苷類、脂質類也可能是褐變的底物，但是相關研究較少。脂質代謝途徑的關鍵酶被發(fā)現參與果蔬褐變，如ATP參與脂質的合成與脂肪酸的去飽和作用，影響膜的生理功能和理化性能[19-21]，導致膜脂過氧化作用加劇，細胞間分割作用打破導致酶和底物結合，最終產生褐變[22-23]。本研究以不同品種煙葉為研究材料，結果顯示與云煙87相比，更易發(fā)生褐變的中川208上部葉中脂類代謝差異顯著，表明脂質代謝在中川208上部煙葉褐變過程中發(fā)揮關鍵作用，這與前人在其它果蔬上的研究相一致。

煙葉角質層主要由角質和蠟質組成。角質是一種由甘油、羥基脂肪酸及環(huán)氧脂肪酸組成的聚酯聚合物。蠟質沉積在表皮細胞最外層形成蠟質晶體，主要由脂肪族化合物（烷烴、脂肪酸、初級醇、醛）組成[24]，大量研究表明植物脂肪酸代謝（脂質氧化）與蠟質層形成密切相關，蠟質層可以作為研究脂肪酸代謝的一個參考指標[25-26]。目前關于煙葉蠟質形成的生理生化和分子機制研究還未見詳細報道。本研究發(fā)現中川208上部葉角質蠟質層明顯增厚，同時在煙葉表面發(fā)現大量已經坍塌破碎的蠟質晶體，煙葉中脂肪酸含量顯著提高。LOX是參與煙葉生長過程中脂質代謝途徑的關鍵酶[27]，LOX通過誘導不飽和脂肪酸中亞麻酸和亞油酸的氧化從而影響葉片的脂質氧化進程，中川208易褐變鮮煙葉中LOX活性顯著增加，不飽和脂肪酸氧化更劇烈，增加了不飽和脂肪酸油酸、亞麻酸、亞油酸以及飽和脂肪酸肉豆蔻酸、硬脂酸和花生酸相對含量的積累。

本研究發(fā)現中川208上部葉脂質代謝途徑關鍵基因、、、基因表達量顯著提高。細胞色素P450中鏈羥化酶（CYP）家族成員，與角質生物合成中羥基化密切相關[28]。ALDHs是一個超家族蛋白，它依賴于NAD（P），能氧化許多內源依賴性酶、脂肪族和芳香族醛，生成羧 酸[29]。其中脂質轉移蛋白（LTPs）被證明很可能有助于角質單體通過細胞壁向角質層的轉運[30]，中川208上部葉基因表達量與云煙87相比，增加了7.83倍，表明該基因在蠟質層形成過程中起關鍵作用，這中川208上部葉表皮蠟質積累量大相一致；脂氧合酶基因家族（LOXs）參與調控脂氧合酶的活性和功能，在調控脂質氧化過程中發(fā)揮重要作用[31]，中川208上部葉基因的表達量增加了2.27倍，與LOX酶活增加結果相一致。類基因參與蠟質的生物合成與轉錄，對蠟質合成途徑中信號傳導與調控起十分重要的作用[32]，等上游調控因子表達量在兩個品種中也具有顯著差異，暗示MYB家族基因在兩個品種的脂肪酸代謝途徑中發(fā)揮關鍵作用。

綜上，本研究初步從轉錄組、細胞生物學、物質代謝和分子層面系統(tǒng)深入分析了云煙87和中川208在上部葉脂質氧化與煙葉褐變中的差異，為證明脂質氧化參與煙葉褐變提供了理論依據。雖然本研究初步證實了脂質氧化影響煙葉的褐變，但是在分子水平上的證據仍不充分，后期將通過目的基因克隆和轉基因技術進一步明確脂質代謝關鍵基因在調控煙葉褐變過程中的功能。

4 結論

與云煙87相比，易褐變的中川208上部葉脂質代謝相關基因顯著上調表達，脂肪酸代謝旺盛，角質層（包含蠟質層）增厚，煙葉表面蠟質積累量大。中川208上部葉較多的脂肪酸底物和較高的LOX酶活性是其煙葉發(fā)生脂質氧化產生褐變的一個重要因素。

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Study on the relationship between lipid metabolism and browning of upper tobacco leaves

SUN Haoyue1, LI Wengang2, YU Shikang3, WU Deyang4, CHEN Hanfa4, YANG Jie3, SONG Zhaopeng1, JIA Hongfang1, XIE Liangwen2*

1 College of Tobacco, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, China;2 Sichuan Tobacco Company, Chengdu 610000, China;3 Guangyuan Tobacco Company of Sichuan Province, Guangyuan 628000, Sichuan, China;4 Liangshan Tobacco Company of Sichuan Province, Xichang 615000, China

[Background and Objective]This study aims to clarify the effects of lipid metabolism in upper leaves of flue-cured tobacco on leaf browning.In this study, the relationship between lipid oxidation and Browning of the upper leaves of Yunyan 87 and Zhongchuan 208 were systematically studied by means of transcriptomics, transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and real-time quantitative PCR(RT-PCR) in cell biology and molecular level.(1) Compared with Yunyan 87 tobacco leaves, Zhongchuan 208 tobacco leaves were browning faster, and the time for leaves to become 50% brown was shorter, and the browning reaction was more intense; Further transcriptomic GO analysis and KEGG enrichment analysis showed that the differential genes in the upper leaves of Zhongchuan 208 were enriched in lipid metabolism (linolenic acid and linoleic acid metabolism), suggesting that lipid metabolism was closely related to the browning of the upper leaves. (2)The cuticle was significantly thickened, the broken wax layer and thin slices were obviously increased in Zhongchuan 208 tobacco leaves. The total fatty acid content, linolenic acid content, and lipoxygenase (LOX) enzyme activity were significantly higher than those of the control, indicating that the lipid metabolism of easy-browning tobacco leaves is relatively vigorous and lipid oxidation is prone to occur. (3) The lipid metabolism genes,,,were screened out from the obtained differentially expressed genes, the expression of which were up-regulated in Zhongchuan 208 tobacco leaves according to qRT-PCR analysis. Among them, the expression ofa key gene of lipid oxidation, was up-regulated by 2.27 times.Compared with the upper leaves of Yunyan 87, the browning reaction of the upper leaves of Zhongchuan 208 is more intense, and the fatty acid metabolism in the tobacco leaves is more vigorous and the lipids are more susceptible to oxidation reactions. The results indicate that lipid oxidation caused by fatty acid metabolism is an important factor for the browning of Zhongchuan 208 tobacco leaves.

upper tobacco leaves; lipid metabolism; browning; transcriptomics

四川省煙草公司科技重點項目“提升上部葉烘烤質量的關鍵技術研究與應用”（NO：SCYC202116）

孫皓月（1998—），碩士研究生，主要研究方向：煙草調制與加工，Email：sally_sun.zz@foxmail.com

謝良文（1979—），高級農藝師，主要從事技術管理與煙葉生產技術方面研究，Email：652814038@qq.

20021-12-15；

2022-04-07

Corresponding author. Email：652814038@qq.com

孫皓月，李文剛，俞世康，等. 上部葉脂質代謝與煙葉褐變的關系研究[J]. 中國煙草學報，2022，28（4）. SUN Haoyue, LI Wengang, YU Shikang, et al. Study on the relationship between lipid metabolism and browning of upper tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/j.chinatobacco.2021.T0232